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    大熊貓犬瘟熱病毒(CDV-PA-1421 株)微載體懸浮培養(yǎng)工藝研究

    2020-12-22 02:08:30靜李艷玲朱明媛谷孝玉李
    中國(guó)獸藥雜志 2020年11期
    關(guān)鍵詞:犬瘟熱活疫苗大熊貓

    劉 靜李艷玲朱明媛谷孝玉李 潤(rùn)

    (唐山怡安生物工程有限公司,河北唐山063020)

    犬瘟熱(Canine distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病,有較高發(fā)病率和病死率,臨床上以厭食、雙相熱、結(jié)膜炎、嚴(yán)重的胃腸炎和神經(jīng)癥狀為典型特征。 大熊貓是我國(guó)重點(diǎn)保護(hù)瀕危珍稀野生動(dòng)物,隨著犬瘟熱感染宿主范圍的日益擴(kuò)大,從1983 年開始,享有“活化石”之稱的國(guó)寶大熊貓也相繼有感染犬瘟熱死亡的報(bào)道。 2014 年12 月至2015 年樓觀臺(tái)秦嶺大熊貓繁育基地,6 只被CDV感染的大熊貓中有5 只死亡,幸存的1 只因早前接種過CDV 疫苗,體內(nèi)存在CDV 中和抗體,未表現(xiàn)臨床癥狀,這表明中和抗體可以使大熊貓免受CDV強(qiáng)毒的致死性攻擊[1-2]。 因此,及時(shí)進(jìn)行疫苗免疫是防控犬瘟熱病的關(guān)鍵措施,可提高大熊貓的抵抗力[3-4]。

    目前,國(guó)內(nèi)外用于大熊貓CDV 免疫預(yù)防的疫苗主要有三類:(1)弱毒疫苗。 弱毒疫苗已在國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用并取得了一定的效果,但弱毒疫苗接種后保護(hù)效果較弱或安全性不足[5]。 (2)基因工程疫苗。 基因工程疫苗相對(duì)而言比較安全,僅能在哺乳類動(dòng)物機(jī)體發(fā)生復(fù)制,不能產(chǎn)生感染[6],但免疫持續(xù)期短,不能產(chǎn)生足夠的記憶細(xì)胞維持長(zhǎng)期免疫力[7]。 (3)滅活疫苗。 國(guó)內(nèi)部分動(dòng)物園使用該苗作為大熊貓的預(yù)防疫苗,多年來未發(fā)現(xiàn)任何臨床CDV 病例,也未出現(xiàn)疫苗源性的安全問題,但目前還沒有熊貓?jiān)葱缘娜翢釡缁钜呙纾嗦?lián)苗在疫病防控上效果欠佳,因此,研發(fā)大熊貓犬瘟熱專用滅活疫苗迫在眉睫。 本研究采用正交試驗(yàn)確定Vero細(xì)胞培養(yǎng)、MOI、pH 值、溫度、收獲時(shí)間等工藝參數(shù),建立大熊貓犬瘟熱滅活疫苗(CDV -PA -1421株) 的懸浮培養(yǎng)工藝,制備高質(zhì)量的大熊貓犬瘟熱滅活疫苗。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料 Vero 細(xì)胞,批號(hào)Vero-B0402-002,130 代,由唐山怡安生物工程有限公司制備并貯存。 大熊貓犬瘟熱病毒(CDV-PA-1421 株),保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(保藏號(hào):18179)。 MSVP 培養(yǎng)基購(gòu)于上海源培生物科技股份有限公司,胰蛋白酶購(gòu)于GIBCO,新生牛血清購(gòu)于蘭州民海生物公司,谷氨酰胺購(gòu)于Invitrogen,微載體Cytodex 1 購(gòu)于GE。 生物反應(yīng)器(C-10 -2 CC 型)購(gòu)自德國(guó)Sartorius。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,18 ~22 g 小鼠10 只,購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)參數(shù) 采用正交試驗(yàn),選擇細(xì)胞接種濃度、微載體濃度、細(xì)胞生長(zhǎng)液3 個(gè)影響細(xì)胞增殖的因素,每個(gè)因素設(shè)置3 個(gè)水平條件(表1)。 通過選擇的條件進(jìn)行Vero 細(xì)胞培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)96 ~168 h 后進(jìn)行計(jì)數(shù),根據(jù)最高細(xì)胞密度,比較不同因素對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

    表1 Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab 1 Orthogonal experiment design table of Vero cell microcarrier culture

    1.2.2 病毒培養(yǎng)條件 采用正交試驗(yàn)確定病毒培養(yǎng)條件,選擇不同MOI、pH 值、溫度、收獲時(shí)間4 個(gè)因素,每個(gè)因素分別設(shè)置不同水平(表2)。 根據(jù)最高病毒含量,比較不同因素和水平對(duì)病毒增殖的影響。

    表2 大熊貓犬瘟熱病毒正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab 2 Orthogonal experiment design table of giant panda canine distemper virus

    1.2.3 10L 反應(yīng)器病毒培養(yǎng)工藝驗(yàn)證 根據(jù)確定培養(yǎng)條件,將長(zhǎng)成單層的Vero 細(xì)胞消化,接種到10L 反應(yīng)器中,加入細(xì)胞生長(zhǎng)液至工作體積。 待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,接種大熊貓犬瘟熱(CDV -PA -1421株)毒種,在37 ℃pH7.2 條件下培養(yǎng)96 ~120 h,觀察細(xì)胞病變(CPE)。 CPE 達(dá)到70% ~80%時(shí)收獲上清液,按Reed -Muench 法計(jì)算其半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50),檢測(cè)病毒含量。 連續(xù)培養(yǎng)3 批病毒,驗(yàn)證工藝的穩(wěn)定性。

    1.2.4 疫苗制備及檢驗(yàn) 將收獲液過濾去除細(xì)胞碎片后,經(jīng)澄清、濃縮、滅活、配比、分裝等工序,獲得大熊貓犬瘟熱病毒滅活疫苗(CDV-PA-1421 株),參照《中國(guó)獸藥典》(2015 年版)進(jìn)行性狀、裝量、無(wú)菌、pH 值、安全檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)條件 對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析可知(表3),影響細(xì)胞增殖的因素細(xì)胞接種濃度>微載體濃度>細(xì)胞生長(zhǎng)液,優(yōu)水平組合為A2B2C3,即細(xì)胞接種濃度0.2×106~0.4×106/mL、微載體濃度8.0 g/L、細(xì)胞生長(zhǎng)液MSVP。 方差分析結(jié)果顯示(表4),細(xì)胞接種濃度、微載體濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響高度顯著,細(xì)胞生長(zhǎng)液無(wú)顯著影響。

    表3 Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)極差分析Tab 3 Range analysis of Vero cell microcarrier culture

    表4 Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)方差分析Tab 4 Variance analysis of Vero cell microcarrier culture

    2.2 病毒培養(yǎng)條件 對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析可知(表5),優(yōu)水平組合為A1B1C2D3,即MOI 0.01、溫度37 ℃、pH 7.2、收獲時(shí)間96 ~120 h,影響病毒增殖的因素,收獲時(shí)間>MOI >溫度>pH值。 方差分析結(jié)果顯示(表6),MOI、溫度、收獲時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果高度顯著,pH 值無(wú)顯著影響。

    表5 大熊貓犬瘟熱病毒培養(yǎng)極差分析Tab 5 Range analysis of giant panda canine distemper virus

    表6 大熊貓犬瘟熱病毒培養(yǎng)方差分析Tab 6 Variance analysis of giant panda canine distemper virus culture

    2.3 工藝重復(fù)性驗(yàn)證 如圖1 所示,3 批收獲液病毒含量達(dá)到107.0~107.5TCID50/0.1 mL。

    圖1 大熊貓犬瘟熱疫苗工藝重復(fù)性驗(yàn)證Fig 1 The repeatability test of the culture craft for canine distemper vaccine of giant pandas

    2.4 疫苗檢驗(yàn) 經(jīng)檢驗(yàn),大熊貓犬瘟熱滅活疫苗(CDV - PA -1421 株)性狀為乳白色至淡紅色液體,靜置后底部有白色沉淀,輕輕振搖,呈均勻懸液,pH 值為7.2。 使用18 ~22 g 小鼠10 只,腹腔注射,每只0.5 mL,觀察21 d,小鼠全部健活,沒有出現(xiàn)任何的局部和全身不良反應(yīng)。

    3 結(jié)論與討論

    犬瘟熱病毒自1809 年報(bào)道以來,在世界范圍內(nèi)廣泛流行[8]。 隨著CDV 毒株基因的不斷變異,宿主范圍已由犬和貓擴(kuò)大到其他哺乳動(dòng)物,尤其是瀕危的大熊貓[9]。 犬瘟熱已經(jīng)成為威脅大熊貓種群數(shù)量和生命安全的第一大烈性傳染?。?0-11],然而現(xiàn)有犬瘟熱疫苗的免疫效果有所降低,針對(duì)熊貓?jiān)吹膶S靡呙绺乔啡?,迫切需要研發(fā)更為有效的疫苗制劑。 本研究所用大熊貓犬瘟熱病毒(CDV-PA-1421 株)是陳德坤團(tuán)隊(duì)2015 年提取分離的大熊貓犬瘟熱病毒陜西株,屬?gòu)?qiáng)毒株,與已發(fā)表CDV SD(14)11 毒株(亞洲-1 型)同源性為98%[12],毒株十分寶貴。 本試驗(yàn)基于已有的大熊貓犬瘟熱攪拌瓶工藝參數(shù),利用正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基、細(xì)胞接種濃度、微載體濃度、pH 值、病毒MOI 等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行研究,從而確定大熊貓犬瘟熱病毒(CDV-PA-1421 株)微載體懸浮培養(yǎng)工藝。

    Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)方差分析結(jié)果顯示:微載體濃度、細(xì)胞接種密度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響高度顯著,但并不是細(xì)胞接種密度及微載體濃度越高越好。微載體濃度低時(shí),細(xì)胞增殖受限,最高細(xì)胞密度較低。 微載體濃度過高,攪拌速度較大,對(duì)細(xì)胞造成損傷,不僅不利于細(xì)胞生長(zhǎng),微載體成本也較高。此外,細(xì)胞接種密度為0.4 ×106/mL ~0.6 ×106/mL反而比0.2 ×106/mL ~0.4 ×106/mL 的最高細(xì)胞密度低。 這是由于過高的接種密度,會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過快耗竭,影響細(xì)胞增殖,更不利于后期的病毒繁殖。 細(xì)胞生長(zhǎng)液優(yōu)選條件為MSVP +1%血清,但是否添加血清對(duì)最高細(xì)胞密度影響較小,方差分析也顯示細(xì)胞生長(zhǎng)液對(duì)細(xì)胞增殖的影響不顯著。 此外,血清的添加也存在諸多問題:無(wú)論是進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)血清均可能存在外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn),影響疫苗產(chǎn)品的安全性;血清白蛋白易吸附在微載體表面,細(xì)胞貼附率明顯下降;雜蛋白、激素、多肽等多種雜質(zhì)增大下游分離純化的難度。 因此,本試驗(yàn)選擇MSVP無(wú)血清培養(yǎng)基作生產(chǎn)培養(yǎng)基。

    病毒培養(yǎng)方差分析顯示:MOI 對(duì)病毒增殖影響顯著,但0.01、0.03、0.1 結(jié)果差異較小,顯著性主要來自0.3 MOI 水平與其他水平的差距。 當(dāng)MOI大于0.3 時(shí),細(xì)胞病變過快,細(xì)胞維持時(shí)間短,影響病毒增殖,最終收獲液的病毒含量偏低,從而確定最適MOI 為0.01 ~0.1。 溫度對(duì)病毒增殖影響顯著,37 ℃條件下的病毒含量明顯高于34 ℃。 收獲時(shí)間對(duì)病毒增殖影響高度顯著,培養(yǎng)96 ~120 h 病毒滴 度 高 于107.0TCID50/0. 1mL,與 水 貂 犬 瘟 熱(CDV3 -CL 株)在100 ~120 h 獲得高滴度病毒液一致[13]。

    本研究確定大熊貓犬瘟熱病毒(CDV-PA-1421株)培養(yǎng)工藝為:將長(zhǎng)成單層的Vero 細(xì)胞消化,接種到10L 生物反應(yīng)器中,細(xì)胞接種濃度為0.2 ×106/mL ~0.4 ×106/mL,微載體濃度為8.0 g/L,細(xì)胞生長(zhǎng)液為MSVP 培養(yǎng)基。 按0. 01 ~0. 1MOI 接毒,37 ℃pH 值7.2 條件下培養(yǎng)96 ~120 h 收獲上清液,即可獲得高于107.0TCID50/0.1mL 的收獲液。 連續(xù)進(jìn)行3 批重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果顯示,病毒培養(yǎng)工藝穩(wěn)定,收獲液病毒含量在107.0~107.5TCID50/0.1mL,批間差異小,為大熊貓犬瘟熱滅活疫苗的研究奠定良好基礎(chǔ)。 由于大熊貓的保護(hù)限制,無(wú)法對(duì)其進(jìn)行犬瘟熱攻毒試驗(yàn)研究,難以確定大熊貓犬瘟熱特異性抗體保護(hù)效價(jià),本研究將繼續(xù)利用制備的滅活疫苗免疫其他動(dòng)物,進(jìn)行異源精制抗體的研究,以期為大熊貓犬瘟熱的治療提供更多的解決方案。

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