咽拭子擦拭檢測(cè)皮膚疣人乳頭瘤病毒分型的敏感性研究

明 星，尹萌萌，李 京，呂世超

皮膚疣是由人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染引起的常見皮膚病，臨床分為尋常疣、跖疣和扁平疣。根據(jù)基因的同源性，HPV 分為5 個(gè)屬（α、β、γ、mu、nu）和16 個(gè)種，共350多個(gè)型[1,2]，其中α 屬的HPV-2、3、7、10、27 和57 型，γ 屬的HPV-4、60 和65 型，mu 屬的HPV-1 和63 型，nu 屬的HPV-41 型是與皮膚疣相關(guān)的型別[3]。感染國外尋常疣、跖疣及國內(nèi)成人跖疣患者的主要HPV 型均為mu 屬的 1 型和α 屬的2、27、57 型[4-7]。研究發(fā)現(xiàn)HPV 型別與患者臨床特征、自然消退率和水楊酸、液氮冷凍治療效果相關(guān)[4,7]，因此檢測(cè)皮膚疣患者的HPV 型別，可幫助臨床醫(yī)生選擇治療方案（治療或觀察），也是研究“精準(zhǔn)”治療皮膚疣的基礎(chǔ)。準(zhǔn)確檢測(cè)皮膚疣HPV 型別不僅依賴正確的檢測(cè)方法，也依賴敏感性好的取材方法。

手術(shù)刀片刮除和剪刀剪除部分疣體是國內(nèi)檢測(cè)皮膚疣HPV 型的取材方法[8-10]，這兩種方法是侵入性操作，不僅易出血、引起患者恐懼、疼痛，導(dǎo)致依從性差，而且耗時(shí)長(zhǎng)，不利于大規(guī)模臨床和流行病學(xué)調(diào)查研究。de Koning 等[11]發(fā)現(xiàn)棉簽擦拭可作為檢測(cè)皮膚疣HPV 型的取材方法，但存在標(biāo)本易交叉污染和樣本處理相對(duì)復(fù)雜的缺點(diǎn)。 用獨(dú)立包裝的咽拭子取材能改善手術(shù)刀片刮除和棉簽擦拭取材的不足。本研究探討咽拭子擦拭法在皮膚疣標(biāo)本檢測(cè)HPV 型的敏感性，研究結(jié)果有助于改進(jìn)檢測(cè)皮膚疣HPV 型的取材方法，有助于臨床和科研工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 2019 年3 月―2019 年4 月招募安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍第306 臨床學(xué)院和北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科門診的皮膚疣患者50 例，其中跖疣34 例，尋常疣16 例。尋常疣皮損分布于頭皮3 例、面部2 例、后背部1 例、手部8 例、足背2 例。50 例患者中男35 例，女15 例，平均年齡34.38 歲（10 ～85 歲），平均病程13.28 個(gè)月（0.25 ～120 個(gè)月），平均疣體為3.8 個(gè)（1 ～30 個(gè)）。取材前均取得患者同意。

1.1.2 主要試劑 咽拭子（青島永強(qiáng)華商醫(yī)療科技公司），15 號(hào)一次性使用無菌手術(shù)刀片（上海復(fù)星醫(yī)藥股份有限公司），凍存管（北京蘭杰柯科技有限公司）， 組織DNA 提取試劑盒、ETP-300 全自動(dòng)核酸提取儀（上海英芮誠公司），HPV L1 區(qū)引物（北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司），KAPA 擴(kuò)增試劑盒、TaKaRa 純化試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]，9700 PCR 擴(kuò)增儀、3730XL 測(cè)序儀(美國ABI 公司)。

1.2 方法

1.2.1 確定取材的靶疣 首選第1 個(gè)發(fā)生的疣，不能確定第1 個(gè)疣，選擇面積最大的疣。

1.2.2 咽拭子擦拭法取材 用細(xì)胞保存液浸濕的咽拭子采樣頭擦拭靶疣表面10 次后，將采樣頭置于細(xì)胞保存液中，編號(hào)后置于-18℃冰箱中保存，待測(cè)HPV型。

1.2.3 刀片刮除法取材 咽拭子取材后，用15 號(hào)無菌手術(shù)刀片在同一個(gè)疣體的表面刮除部分疣體組織，置于2 ml 的凍存管中，編號(hào)后置于-18℃冰箱中保存，待測(cè)HPV 型。

1.2.4 檢測(cè)方法 樣本裂解后，利用組織DNA 提取試劑盒和全自動(dòng)核酸提取儀提取標(biāo)本中的病毒DNA,實(shí)驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行；利用HPV L1 區(qū)引物（正向引物5'- CARGGTCAYAAYAATGGYAT -3'，反向引物5'- AAYTTTCGTCCYARAGRAWATTGRTC -3'）按KAPA 擴(kuò)增試劑盒說明書擴(kuò)增提取后的DNA；按TaKaRa 試劑盒說明書回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，通過自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序；最后經(jīng)NCBI-BLAST 數(shù)據(jù)庫比對(duì)確定HPV 型，通過TA 克隆技術(shù)區(qū)分混合型別。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

年齡、病程、疣體個(gè)數(shù)用均值表示，通過與刀片刮除組的HPV 型檢測(cè)結(jié)果比較，計(jì)算咽拭子擦拭組的敏感性。咽拭子擦拭法的敏感性=咽拭子擦拭組中與刀片刮除組中HPV 型檢測(cè)結(jié)果一致的樣本例數(shù)÷刀片刮除組HPV 檢測(cè)陽性總例數(shù)。

2 結(jié)果

刀片刮除組的HPV 檢測(cè)陽性率為100%（50/50），其中HPV1、HPV27、HPV2 和HPV57 型分別為18 例、14 例、7 例和3 例，HPV1 和27、HPV1 和2、HPV2和27 分別為6 例、1 例和1 例。咽拭子擦拭組的檢測(cè)陽性率為92%（46/50），其中除1 例患者的HPV型檢測(cè)結(jié)果是HPV1，而刀片刮除組為 HPV1 和27 外，其余陽性檢測(cè)結(jié)果和刀片刮除組完全一致。咽拭子擦拭法的敏感性為92%（46/50）。

3 討論

本研究采用咽拭子取材，PCR 技術(shù)擴(kuò)增病毒DNA、Sanger 法（DNA 雙脫氧鏈末端終止測(cè)序法）測(cè)序和TA 克隆技術(shù)區(qū)分混合型別。與棉簽取材相比，獨(dú)立包裝且配有細(xì)胞保存液的咽拭子發(fā)生交叉感染的可能性更小，且避免了棉簽取材需加入生理鹽水和DNA 提取需人工擠壓棉簽的步驟，操作更快捷。另外，咽拭子采樣頭由尼龍短纖維絨毛頭構(gòu)成，能有效吸附脫落細(xì)胞，較棉簽頭更易洗脫細(xì)胞，理論上可提高陽性檢出率。選擇HPV 病毒衣殼蛋白L1 區(qū)最保守、變異最少的核苷酸序列為擴(kuò)增引物，可以檢測(cè)出所有的HPV 亞型[1]。Sanger 法是最早最經(jīng)典的測(cè)序方法，準(zhǔn)確率高達(dá)99.99%[12]。TA 克隆技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速、重組高效等優(yōu)點(diǎn)[13]。

既往研究發(fā)現(xiàn)采用PCR 技術(shù)檢測(cè)刀片刮除皮膚疣疣體組織的HPV 陽性率為97%[8]，本研究刀片刮除組的陽性率為100%，因此可以將刀片刮除法作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算咽拭子擦拭法的敏感性。研究結(jié)果顯示咽拭子擦拭組46 例皮膚疣標(biāo)本HPV 陽性，其中45 例和刀片刮除組HPV 分型完全一致，僅1 例患者HPV為1 型，而刀片刮除組為1 和27 型（25 號(hào)患者）。咽拭子擦拭法的敏感性為92%，與de Koning 等[11]報(bào)道棉簽擦拭法的敏感性為96%（24/25）基本一致。另外，咽拭子擦拭組有4 例樣本HPV 陰性，而刀片刮除組是陽性，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是咽拭子擦拭法與刀片刮除法相比獲得的病毒載量少（包括25號(hào)患者），影響了樣本的檢測(cè)結(jié)果。如果增加咽拭子擦拭皮膚疣的次數(shù)，可能會(huì)提高檢測(cè)結(jié)果的陽性率和咽拭子擦拭法的敏感性。根據(jù)以上研究結(jié)果，并考慮到咽拭子擦拭法的優(yōu)勢(shì)，該方法可作為檢測(cè)皮膚疣HPV 分型的常規(guī)取材方法。有文獻(xiàn)報(bào)道HPV 可存在于正常人皮膚表面[14,15]和許多皮膚病皮損中，如銀屑病、紅斑狼瘡、脂溢性角化、日光性角化、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌等[16-21]，因此很難取到可靠的陰性對(duì)照標(biāo)本，所以本研究未涉及咽拭子擦拭法的特異性研究。

本研究檢測(cè)結(jié)果顯示感染尋常疣和跖疣的主要HPV 型是HPV1、2、27 和57 型，和國內(nèi)外既往研究結(jié)果一致[4-8]。