瓦氏雅羅魚嗜水氣單胞菌的分離鑒定及藥物敏感性

何亞鵬 時(shí)曉 杜迎春

摘?要：從發(fā)病死亡的瓦氏雅羅魚（Leuciscus waleckii）體內(nèi)分離純化1株細(xì)菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化分析、PCR檢測及序列分析，確定該致病菌為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。藥敏試驗(yàn)研究了該菌株對常用抗生素的藥物敏感性，結(jié)果表明，該菌株對抗生素妥布霉素、諾氟沙星、慶大霉素等敏感，臨床上選擇諾氟沙星治療，配合消毒措施，短時(shí)間內(nèi)有效地控制了該疫情。

關(guān)鍵詞：瓦氏雅羅魚（Leuciscus waleckii）;嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）;分離鑒定;藥敏試驗(yàn)

本研究對患病瓦氏雅羅魚（Leuciscus waleckii）進(jìn)行臨床診斷，從病魚肝臟中分離出細(xì)菌，進(jìn)行染色鏡檢，生理生化分析，PCR檢測，藥敏試驗(yàn)研究了該菌株對20種抗生素的敏感性，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇藥物進(jìn)行治療，效果較好，為進(jìn)一步研究瓦氏雅羅魚嗜水氣單胞菌致病性奠定了基礎(chǔ)，也為水產(chǎn)品檢疫、魚病診斷和珍稀魚類救護(hù)等方面提供了參考依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗(yàn)動(dòng)物?患病的瓦氏雅羅魚采自本中心養(yǎng)殖車間。

1.1.2?主要試劑?細(xì)菌培養(yǎng)基、生化鑒定試劑和藥敏紙片均購自北京索萊寶科技有限公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒、2×EasyTaq?PCR SuperMix、pEASY-T1克隆載體及Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物公司。

1.2?方法

1.2.1?細(xì)菌的分離?在超凈工作臺(tái)內(nèi)，無菌采集患病的瓦氏雅羅魚肝臟，挑取肝臟內(nèi)部劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第二天觀察記錄生長的菌落特征，如顏色、大小和形態(tài)等。然后取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察。

1.2.2?生理生化鑒定?取單菌落于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，在無菌條件下用接種環(huán)穿刺接種于細(xì)菌生化鑒定管中，根據(jù)說明書對該菌株進(jìn)行系統(tǒng)的理化特性測定和分析[1]。

1.2.3?PCR檢測?參考相關(guān)文獻(xiàn)，合成PCR方法檢測嗜水氣單胞菌的特異性引物，對分離的細(xì)菌進(jìn)行檢測[2]。引物序列為：PF：5-ACCTCAACGTCAACCGCAAGAT-3;PR：5-GTCTGCGCTTGTCGGTATCCTC-3，目的片段長度為876 bp。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌的DNA作為模板，以水為陰性對照模板，按PCR試劑盒說明書設(shè)計(jì)體系進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，觀察目的條帶大小，回收純化目的片段，連接pEASY-T1載體，進(jìn)行鑒定，提取陽性質(zhì)粒，測序后比對分析。

1.2.4?藥敏試驗(yàn)?將培養(yǎng)18 h的該菌菌液涂布在檢測平板上，待稍微干燥后在合適區(qū)域貼上藥敏紙片，室溫放置10 min后，倒置于28?℃的細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，18 h后測量每個(gè)藥物的抑菌圈直徑，分別判定各個(gè)藥物敏感性。

2?結(jié)果

2.1?臨床癥狀

瓦氏雅羅魚病魚游動(dòng)緩慢，體表泛白，魚鰓和魚鰭潰爛，鰓絲粘連、腫脹，鰭基部充血，剖檢可見肝臟點(diǎn)狀出血，腸道腫脹，無明顯腹水。初步判定為細(xì)菌感染引起的爛鰓病。

2.2?細(xì)菌形態(tài)

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落顏色呈白色半透明狀，菌落為圓形、凸起、表面光滑、邊緣整齊的小菌落。細(xì)菌革蘭氏染色均呈陰性，菌體呈短小桿狀（見封三圖1）。

2.3?細(xì)菌理化特性

統(tǒng)計(jì)生化鑒定結(jié)果，該菌株生化特性見表1。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[1]，可初步判斷該菌為嗜水氣單胞菌。

2.4?PCR擴(kuò)增結(jié)果及目的片段序列分析

以分離細(xì)菌的DNA為模板，用嗜水氣單胞菌PCR檢測特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增可得到約876 bp的目的片段（圖2），陰性對照無條帶。將構(gòu)建的陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序，將目的片段基因序列用GenBank中的BLAST工具進(jìn)行序列比對，比對結(jié)果表明該目的片段基因序列和基因庫中嗜水氣單胞菌的相似性最高，前10個(gè)均為嗜水氣單胞菌，相似性均在99%以上，表明該菌株為嗜水氣單胞菌。

2.5?藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選擇常見抗菌藥物進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明該分離菌株對妥布霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、慶大霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、氧氟沙星、丙氟哌酸等抗生素敏感，對磺胺二甲基嘧啶鈉、紅霉素、林可霉素、硫醚沙星、兩性霉素、氨芐西林、新諾明、頭孢拉定、麥迪霉素、卡那霉素不敏感（表2）。

2.6?用藥及結(jié)果

根據(jù)上述藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇諾氟沙星治療，同時(shí)在飼料中加入大蒜素，水中潑灑聚維酮碘消毒，控制了該疫情。

3?討論

本研究從病死的瓦氏雅羅魚體內(nèi)分離到致病菌，根據(jù)臨床病變、細(xì)菌形態(tài)和理化特性分析，懷疑該菌為嗜水氣單胞菌，PCR檢測出嗜水氣單胞菌特異性目的條帶，該目的片段測序結(jié)果表明，該序列和嗜水氣單胞菌的相似性最高，綜合判定分離菌株為嗜水氣單胞菌。在生理生化特性鑒定中，該分離菌對吲哚、氧化酶、過氧化氫酶、甲基紅、葡萄糖、木糖、麥芽糖、肌醇、蔗糖、吲哚試驗(yàn)、明膠液化等的生化反應(yīng)性與錦鯉源A.hydrophila相同。分離菌株P(guān)CR目的基因序列經(jīng)BLAST比對與GenBank登錄的相關(guān)序列同源性達(dá)99%以上，不同動(dòng)物源A.hydrophila的生化特性可能存在一些差異。

目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌性疾病是最主要的生物源性疾病。防治細(xì)菌性疾病的主要手段是使用藥物，抗生素類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮著重要作用，但在使用過程中藥物濫用問題也比較突出，主要表現(xiàn)為不注重科學(xué)合理養(yǎng)殖，把防病治病的任務(wù)主要寄托在抗病藥物的大量使用上。久而久之，藥物殘留及細(xì)菌耐藥問題日益嚴(yán)重，逐步成為了引起公眾持續(xù)關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。因此在養(yǎng)殖過程中抗生素的選擇和使用必須要注重科學(xué)性、合理性，長期不合理的大量使用單一藥物可誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生耐藥性，動(dòng)物體內(nèi)也會(huì)累積大量藥殘，危害消費(fèi)者健康，還會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品禁售，因此平時(shí)的養(yǎng)殖要提升養(yǎng)殖條件，提高養(yǎng)殖能力，做好預(yù)防措施，預(yù)防為主，在選擇藥物防治前需要做好藥敏試驗(yàn)，科學(xué)合理用藥。本研究藥敏結(jié)果顯示兩菌株對鹽酸多西環(huán)素、煙酸諾氟沙星、乳酸諾氟沙星等抗生素敏感，和之前研究也基本相符，選擇諾氟沙星配合大蒜素等中草藥治療，同時(shí)采用聚維酮碘對池水消毒，收到良好效果。本試驗(yàn)為嗜水單胞菌感染的診斷和臨床用藥提供了參考，而且對魚類細(xì)菌性疾病防治以及公共衛(wèi)生等研究具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 布坎南，吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].8版.科學(xué)出版社，1984：475-487.

[2] 饒靜靜，李壽崧，黃克和，等.致病性嗜水氣單胞菌多重PCR檢測方法的建立[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2007，14（5）：749-755.

（收稿日期：2020-10-28）