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      一種三聯(lián)乳酸菌的體外降膽固醇和抗氧化能力研究

      2020-12-21 09:19:52黃元霞彭傳海丁寧邱忠平李星鄒美慧
      生物技術(shù)通報 2020年12期
      關(guān)鍵詞:菌體三聯(lián)乳酸菌

      黃元霞 彭傳海 丁寧 邱忠平 李星 鄒美慧

      (1. 西南交通大學生命科學與工程學院,成都 610031;2. 中鐵二局中心醫(yī)院,成都 610081)

      膽固醇廣泛存在于人及動物體內(nèi),是體內(nèi)組織細胞的基本活性物質(zhì)。而機體內(nèi)膽固醇過多可能會導(dǎo)致動脈脂質(zhì)沉積,引發(fā)高脂血癥,從而提高心腦血管類疾病的發(fā)病率。因此,降低血清膽固醇對于防治高脂血癥、降低心腦血管疾病的發(fā)病率具有重要的意義[1]??墒秤萌樗峋↙actic acid bacteria,LAB)是目前公認安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)等級的食品微 生物[2],可利用菌體本身以及在腸道中分泌膽鹽水解酶(Bile salt hyelrolase,BSH)來降低血清膽固醇,從而起到防治高脂血癥的作用[2-3]。BSH可將體內(nèi)的復(fù)合膽鹽水解為游離膽鹽,促進游離膽鹽與膽固醇生成沉淀,沉淀不易被腸道吸收,會隨糞便排出體外,從而降低膽固醇含量[4]。乳酸菌在生長過程中會產(chǎn)出一種天然存在的功能性、非蛋白質(zhì)氨基酸——γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA),具有降血脂、降血壓等功能,可輔助治療心腦血管疾?。?]。此外,乳酸菌具有一定的抗氧化活性,可清除體內(nèi)的自由基,進而改善氧化應(yīng)激,平衡脂類代謝,減少高脂血癥的發(fā)生[6-7]。因此,乳酸菌作為一種功能性的保健食品,具有重要的開發(fā)潛力。

      目前乳酸菌常常是降膽固醇和抗氧化的重要益生菌,但是多以單菌株的研究為主[8],而對于乳酸菌制劑的降膽固醇以及抗氧化研究鮮見報道。干酪乳桿菌和哈伯氏乳桿菌具有抗氧化、降膽固醇、增強人體免疫等較多益生性能,且其效果較強,是目前市面上活菌飲料和乳制品中較常用的乳酸菌[9-10];屎腸球菌是目前抗逆性較強的乳酸菌之一,其易在體內(nèi)定植,且仍具有較多的益生性能[11];同時干酪乳桿菌、哈伯氏乳桿菌和屎腸球菌在發(fā)酵過程中均可產(chǎn)有機酸等代謝產(chǎn)物,使得發(fā)酵液的pH降低,為乳酸菌提供合適的生長條件,抑制其它有害微生物的生長,這對于延長乳酸菌制劑的保存時間具有重要的意義[10-11]。

      基于上述3種乳酸菌的益生性能,本研究從西南交通大學資源微生物技術(shù)研究中心實驗室篩選保藏的若干株乳酸菌中,通過研究各菌株的益生性能,獲得有較優(yōu)降膽固醇能力和抗氧化活性的干酪乳桿菌S1、屎腸球菌S4和哈伯氏乳桿菌S6,制備為三聯(lián)乳酸菌,考察其對胃腸道環(huán)境的適應(yīng)性、降膽固醇能力、GABA的含量以及抗氧化活性,以期為后續(xù)研究和開發(fā)功能性微生態(tài)制劑或保健食品提供一定的技術(shù)支撐。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      供試菌株:干酪乳桿菌S1、屎腸球菌S4和哈伯氏乳桿菌S6均篩選自市售酸奶、乳酸菌飲料,由西南交通大學資源微生物技術(shù)研究中心保藏2年,且能穩(wěn)定傳代5代以上,各菌的16S rDNA在GenBank的登陸號分別為MN809276、MN809277和MN809279。金雙歧三聯(lián)活菌制劑(內(nèi)蒙古雙歧藥業(yè)有限公司)。

      培養(yǎng)基以及人工胃腸液制備[12]:MRS培養(yǎng)基用于乳酸菌的培養(yǎng)與計數(shù)。高膽固醇培養(yǎng)基(0.1 mg/mL)用于乳酸菌降膽固醇能力檢測。人工胃液:NaCl 0.20%、胃蛋白酶0.30%,HCl調(diào)pH為 2.5,過濾除菌備用。人工腸液:胰蛋白酶 0.10%,膽鹽0.30%,調(diào)pH至8.0,過濾除菌備用。

      1.2 方法

      1.2.1 三聯(lián)乳酸菌的制備 將冷凍干燥保存的供試菌株,使用前接種至MRS液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h,活化菌株。利用牛津杯法對3株菌株進行拮抗實驗[13]。調(diào)節(jié)菌懸液活菌數(shù),使得干酪乳桿菌S1、屎腸球菌S4和哈伯氏乳桿菌S6的菌懸液的活菌數(shù)為2.0×109CFU/mL。然后按1∶1∶1混合得到三聯(lián)乳酸菌。將市售金雙歧活菌制劑作為對照組,按上述方法將其菌懸液活菌數(shù)調(diào)至相同。

      1.2.2 人工胃腸液耐受性 將其接種于MRS培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h,將1 mL發(fā)酵液與9 mL人工胃液混勻置37℃搖床中。然后移取1 mL處理2 h的含菌人工胃液與9 mL pH 6.8的人工腸液混合,分別在0 h、2 h、6 h、10 h、24 h取樣,按平板計數(shù)法測定其活菌數(shù),按1式計算存活率[12]。

      式中N1:人工胃腸液處理N個小時的活菌數(shù);N0:0 h活菌數(shù)

      1.2.3 降膽固醇能力

      1.2.3.1 總降膽固醇能力 將其接種于高膽固醇MRS培養(yǎng)基中,在37℃搖床中培養(yǎng)24 h,采用硫酸鐵銨法,測定其上清液中的膽固醇濃度[14]。

      1.2.3.2 BSH比活測定 采用茚三酮顯色法[15],將其接種于MRS培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h,發(fā)酵液離心用pH 7.0的磷酸緩沖液洗滌沉淀2次,之后用其調(diào)菌體濃度在OD620下值為1-2,加入25 μL、20 mmol/L的溶菌酶破壁,37℃水浴1 h。取0.1 mL上清粗酶液+1.8 mL(pH 6.0)緩沖液+0.1 mL 0.2 mmol/L的牛磺脫氧膽酸鈉溶液,37℃水浴30 min,加1.5 mL、15%三氯乙酸終止反應(yīng),菌液離心,取1.0 mL上清液+2.0 mL茚三酮顯色液,沸水浴15 min,在OD570測定吸光值。粗酶蛋白測定:取0.1 mL粗酶上清,加水至1 mL,加入考馬斯亮藍G-250溶液5 mL,在OD595測定吸光值。

      酶活力定義:每分鐘每毫升酶液反應(yīng)產(chǎn)生的?;撬岬摩蘭ol數(shù)A。酶比活定義(U/mg):酶活與每mL酶液所含的蛋白量(mg)之比。

      1.2.3.3 膽固醇共沉淀、菌體吸收以及摻入細胞膜含量的測定 參照文獻[16]的方法,將其接種于添加和不添加膽鹽的高膽固醇MRS培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h,發(fā)酵液離心后,測定上清液膽固醇濃度。取1 mL重懸菌液,加入20 μL、50 mmol/L溶菌酶及50 μL、10%SDS,37℃水浴1 h,然后超聲破碎,測定上清液膽固醇濃度,破壁后的菌體用磷酸鹽緩沖液洗滌,沉淀用1.5 mL無水乙醇重懸離心10 min,測定上清液膽固醇濃度,未破壁重懸菌液離心10 min,測定上清中膽固醇濃度。式中A:添加膽鹽及膽固醇的培養(yǎng)液上清中膽固醇含量;B:不添加膽鹽但添加膽固醇的培養(yǎng)液上清中的膽固醇含量;C:菌體洗滌液上清中膽固醇含量;D:菌體破壁后上清中膽固醇含量;E:破壁后菌泥用乙醇重懸浮后上清中的膽固醇含量;F:膽酸鹽與膽固醇共沉淀量;H:菌體吸收去除膽固醇量;I:不接種的添加膽鹽的培養(yǎng)基中膽固醇含量;J:細胞膜結(jié)合量。

      1.2.3.4 BSH比活與降膽固醇能力的相關(guān)性分析 以BSH比活(U/mg)為Y,以降解膽固醇的含量為Xi(μg/mL),其中X1代表膽固醇與膽酸鹽共沉淀的膽固醇含量(μg/mL),X2代表菌體吸收的膽固醇含量(μg/mL),X3代表細胞膜結(jié)合的膽固醇含量(μg/mL)。

      1.2.4 GABA的含量 GABA標準曲線:取配置好的 1 mg/mL GABA 標準液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 于 試管中,然后分別加入蒸餾水到1.0 mL,加入0.5 mL 0.01 mol/mL 四硼酸鈉,1.0 mL 的6%苯酚入,混勻;加入 1.0 mL 次氯酸鈉溶液,混勻后靜置8 min,沸水浴 10 min,立即冰浴 5 min,加入2.0 mL的 60%乙醇,在 OD640測量其吸光度。

      GABA含量測定:取1.0 mL發(fā)酵液抽濾,置于試管中,按照上述方法測量其吸光度,并通過標準曲線計算其含量[17]。

      1.2.5 抗氧化活性 樣品制備[18]:對活化后的菌種培養(yǎng)液離心10 min,分別收集菌體細胞和發(fā)酵上清液;用pH為7.0的磷酸緩沖液洗滌菌體細胞,再用其對菌體細胞進行重懸,再采用低溫超聲波破碎,然后離心20 min,收集上清液作為無細胞提取物。還原力:采用鐵氰化鉀還原法[18]。超氧自由基清除率:采用鄰苯三酚自氧化法[18]。羥自由基清除率:利用Fenton反應(yīng)法[18]。

      1.2.6 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)重復(fù)測定3次(n= 3),結(jié)果表示為x-±s,采用 SPSS22. 0統(tǒng)計軟件進行顯著性和相關(guān)性分析。P<0. 01表示差異有統(tǒng)計學意義,誤差線用標準誤差表示。

      2 結(jié)果

      2.1 乳酸菌拮抗實驗

      通過牛津杯法分別對3株乳酸菌,進行兩兩之間的拮抗實驗,其結(jié)果見圖1。

      圖1 拮抗實驗

      由圖1可知,兩株乳酸菌在同一平板上,兩兩之間并未存在抑菌圈,表明3株乳酸菌之間均無拮抗作用,可用于制備三聯(lián)乳酸菌。

      2.2 人工胃腸耐受性

      乳酸菌的人工胃腸液耐受性是其發(fā)揮益生特性的重要前提,其在不同時期的人工胃腸液中的存活率如圖2。

      圖2 人工胃腸耐受性

      由圖2可知,三聯(lián)乳酸菌在模擬胃腸道環(huán)境中的存活率顯著高于對照組(P<0.01)。在人工胃液中,三聯(lián)乳酸菌存活率達86.34%以上,較對照組高29.47%;轉(zhuǎn)入腸液4 h后,三聯(lián)乳酸菌和對照組的存活率均有下降趨勢,比在人工胃液時分別下降10.69%、11.35%;轉(zhuǎn)入腸液8 h后,三聯(lián)乳酸菌的存活率較對照組高39.15%;直至24 h時,三聯(lián)乳酸菌仍處于較高水平,存活率為47.88%,其活菌數(shù)為1.25×109CFU/mL,較對照組高172.2%。表明三聯(lián)乳酸菌的人工胃腸液耐受力較強。

      2.3 降膽固醇能力

      分別測定三聯(lián)乳酸菌的總降膽固醇降能力、BSH比活,利用膽固醇共沉淀、菌體吸收以及摻入細胞膜降解膽固醇的含量,分析BSH比活與降膽固醇能力的相關(guān)性。

      2.3.1 總降膽固醇能力和BSH比活 BSH可分解結(jié)合膽酸鹽,促進膽固醇與分解后的游離膽酸發(fā)生共沉淀或者在人體內(nèi)促進膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化,達到去除膽固醇的目的,其大小可間接表明乳酸菌降膽固醇的能力。由此測定三聯(lián)乳酸菌的膽固醇去除率和BSH比活,其結(jié)果見表1。

      由表1可知,將三聯(lián)乳酸菌和對照組培養(yǎng)24 h后,三聯(lián)乳酸菌和對照組均有一定的降膽固醇能力,其膽固醇去除率分別為73.43%和58.21%。三聯(lián)乳酸菌的膽固醇去除率較對照組高26.15%,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。由此表明三聯(lián)乳酸菌的總降膽固醇能力較強。三聯(lián)乳酸菌和對照組都具有一定的BSH比活,且三聯(lián)乳酸菌的BSH比活顯著高于對照組(P<0.01),其BSH比活為151.40 U/mg,較對照組高53.29%,與測定的膽固醇去除率一致。表明三聯(lián)乳酸菌的BSH比活較強,具有降膽固醇優(yōu)勢。

      表1 三聯(lián)乳酸菌膽固醇去除率和BSH比活

      2.3.2 膽固醇共沉淀、菌體吸收以及摻入細胞膜含量 乳酸菌去除膽固醇主要依靠共沉淀、菌體吸收以及摻入細胞膜,測定三聯(lián)乳酸菌的去除比例,結(jié)果見表2。

      表2 三聯(lián)乳酸菌體外去除膽固醇分布

      由表2可知,三聯(lián)乳酸菌對于膽固醇的去除主要靠共沉淀作用,其次為菌體吸收,只有少部分摻入細胞膜。其中利用共沉淀可去除56.46%的膽固醇,其膽固醇去除量為26.43 μg/mL;利用菌體細胞能去除39.62%以上的膽固醇,其膽固醇去除量為15.54 μg/mL;而只有3.9%的膽固醇能與細胞膜結(jié)合,其膽固醇去除量為1.83 μg/mL。表明三聯(lián)乳酸菌更易利用BSH分解結(jié)合膽酸鹽,通過共沉淀去除環(huán)境中的膽固醇。

      2.3.3 BSH比活與降膽固醇能力的相關(guān)性分析 將三聯(lián)乳酸菌的BSH比活與其共沉淀、菌體吸收以及細胞膜結(jié)合去除的膽固醇的相關(guān)性進行分析,結(jié)果見表3。

      表3 BSH比活與降膽固醇能力相關(guān)性分析

      由表3可知,乳酸菌利用膽固醇與膽酸鹽共沉淀去除的膽固醇含量與BSH比活的相關(guān)系數(shù)r為0.898(P<0.01),表明BSH比活與膽固醇和膽酸鹽共沉淀的含量成正比,乳酸菌利用菌體吸收和細胞膜結(jié)合的膽固醇含量與BSH酶比活的相關(guān)系數(shù)r為-0.528和-0.033(P>0.01),表明乳酸菌菌體吸收和細胞膜結(jié)合的膽固醇含量不受BSH比活的影響。

      2.4 GABA的含量

      對三聯(lián)乳酸菌和對照組培養(yǎng)24 h后,測定發(fā)酵液中GABA的含量,結(jié)果見圖3。

      圖3 GABA含量

      由圖3可知,三聯(lián)乳酸菌和對照組均可產(chǎn)一定的GABA。三聯(lián)乳酸菌的GABA產(chǎn)量達到1.387 mg/mL,較對照組高55.59%,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。GABA含量的測定對紅曲菌的研究較多,對乳酸菌研究較少。而本研究表明三聯(lián)乳酸菌具有GABA含量,可達到一定降血脂和降血壓的作用。

      2.5 抗氧化活性

      以還原力、超氧自由基清除率和羥自由基清除率為抗氧化活性指標,對三聯(lián)乳酸菌的菌體細胞、發(fā)酵上清液和無細胞提取物3個部位的抗氧化性進行檢測,結(jié)果見圖4。

      圖4 抗氧化活性

      由圖4可知,三聯(lián)乳酸菌和對照組均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性,其還原力和超氧自由基清除率主要存在于發(fā)酵上清液和無細胞提取物,而羥自由基清除率主要存在于菌體細胞。三聯(lián)乳酸菌總體抗氧化活性顯著高于對照組(P<0.01)。三聯(lián)乳酸菌無細胞提取物的還原力最高為1.52,較對照組高14.29%,無細胞提取物超氧自由基清除率最高為95.68%,較對照組高64.12%,菌體細胞羥自由基清除率最高為89.93%,較對照組高13.42%。因此,三聯(lián)乳酸菌具有較好的抗氧化活性。

      3 討論

      三聯(lián)乳酸菌有較強人工胃腸耐受能力,有利于在人體腸道內(nèi)定植。乳酸菌進入人體之后,需經(jīng)胃液的胃酸環(huán)境(pH 3.0)和胃蛋白酶,腸液的高膽鹽濃度(0.03%-0.3%)和胰蛋白酶后,定植于腸道,進而發(fā)揮其益生功能[9-10]。本研究中三聯(lián)乳酸菌在人工胃液中經(jīng)2 h后存活率達86.34%,在人工胃腸液處理24 h后,存活率為47.88%。Goldin等[19]和趙芳等[12]研究了LGG菌株在人工胃液中處理2 h的存活率分別為62.96%和69.78%,三聯(lián)乳酸菌表現(xiàn)出較強的人工胃液適應(yīng)性,且顯著高于對照組。由于三聯(lián)乳酸菌可通過菌株間的協(xié)同作用,利用自身的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、細胞膜組成變化和維持胞內(nèi)外pH平衡等機制對酸性環(huán)境進行調(diào)劑[8-9],進而增強在人工胃液中的存活率。其次三聯(lián)乳酸菌BSH活力較強,可提高乳酸菌的腸道黏附性,而密致細胞表層蛋白也可對抗菌物質(zhì)起到一定阻礙作用,由此三聯(lián)乳酸菌在人工胃腸液中的活菌數(shù)較高,適應(yīng)性較強[20]。

      三聯(lián)乳酸菌主要利用共沉淀和菌體吸收去除膽固醇。本研究表明三聯(lián)乳酸菌的總膽固醇去除率為73.43%,產(chǎn)GABA含量為1.387 mg/mL。韋云路等[21]報道長雙歧桿菌TTF的膽固醇去除率為24.8%,印伯星等[22]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌LV108的膽固醇去除率為51.93%,表明三聯(lián)乳酸菌有較強的降膽固醇能力,且顯著高于對照組。三聯(lián)乳酸菌主要通過以下幾種機制去除膽固醇:通過共沉淀作用去除膽固醇。三聯(lián)乳酸菌分泌的BSH比活高達151.40 U/mg,BSH可將結(jié)合膽鹽水解生成游離膽酸,進而促進膽固醇共沉淀,因此BSH比活與膽固醇共沉淀的含量成正相關(guān);其次游離膽酸不易被腸道吸收,干擾體內(nèi)的干腸循環(huán),進而引起與膽固醇代謝相關(guān)受體的活性變化,最終降低腸道對膽固醇的吸收[4]。通過菌體吸收和少量摻入細胞膜去除膽固醇。三聯(lián)乳酸菌易在腸道內(nèi)定植,微生物數(shù)量和生理活性相對較高,通過菌體間的協(xié)同作用可提高菌體對膽固醇的吸收,從而獲得碳源和能量,而細胞膜結(jié)合少部分膽固醇后,也可能將其同化為細胞膜的組成成分[5,23]。

      三聯(lián)乳酸菌有較強抗氧化活性,其還原力和超氧自由基清除主要利用無細胞提取物,而羥自由基清除主要利用菌體細胞。清除自由基可改善體內(nèi)的氧化應(yīng)激,平衡體內(nèi)的脂肪代謝,避免高脂血癥的形成[7]。本研究表明三聯(lián)乳酸菌無細胞提取物的還原力達到1.52,超氧自由基清除率達95.68%,發(fā)酵上清液中羥自由基清除率為85.96%。何書美等[24]研究了不同品牌酸牛奶中乳酸菌液的還原力為0.7-0.8,李曉軍等[25]篩選的發(fā)酵乳桿菌La5的超氧自由基清除率為22.29%,三聯(lián)乳酸菌表現(xiàn)出較強抗氧化活性,且顯著高于對照組。由于三聯(lián)乳酸菌耐受能力強,微生物數(shù)量多,在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的胞內(nèi)抗氧化物酶、螯合金屬離子的天然物質(zhì)以及胞外多糖等代謝產(chǎn)物含量會相對增多,進而提高還原力以及對自由基的清除能力,這對高脂血癥以及心腦血管疾病的預(yù)防有著重要的意義[26]。

      4 結(jié)論

      三聯(lián)乳酸菌人工胃腸耐受性較好,且降膽固醇和抗氧化活性也較強。在人工胃腸液處理24 h后,存活率為47.88%,活菌數(shù)為1.25×109CFU/mL;降膽固醇能力最強為73.43%,BSH比活為151.40 U/mg,GABA的含量為1.387 mg/mL;無細胞提取物的還原力和對超氧自由基清除率最高為1.52和95.68%,菌體細胞對羥自由基清除率最高為89.93%,是一種較優(yōu)的三聯(lián)乳酸菌制劑。

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