馬尾松根際溶磷細(xì)菌Paraburkholderia sp.的篩選、鑒定及溶磷特性研究

呂俊 潘洪祥 于存

（貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽 550025）

土壤有效磷是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中制約植物生長發(fā)育的重要限制因子，缺磷會導(dǎo)致植物生長緩慢，產(chǎn)量降低和植株矮?。?-2］。土壤中磷素蘊(yùn)藏豐富，但主要以難溶性的礦物態(tài)磷存在，其主要為Ca-P，難以被植株吸收利用［3］。據(jù)全國土壤普查估算，我國約3/2的土壤缺磷，土壤有效態(tài)磷僅占全磷量的2%-3%［1］。在生產(chǎn)中，提高土壤磷素的有效性途徑主要是施用化學(xué)磷肥，而長期使用化肥會造成土壤板結(jié)、保水能力下降以及土壤微生物多樣性和活性降低等一系列生態(tài)環(huán)境問題［4］。土壤溶磷微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的一部分，與難溶性磷活化與轉(zhuǎn)化有著密切關(guān)系，其能在生長代謝中分泌有機(jī)酸類物質(zhì)進(jìn)而降低局部環(huán)境pH值，并與磷酸鹽中的Ca2+、Fe3+、Al3+等金屬陽離子結(jié)合，使磷離子被釋放出來，從而提高土壤中有效磷含量，以供植物吸收利用［5］。截止目前，國際公認(rèn)的溶磷微生物有巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、假單胞菌（Pseudomonas）、農(nóng)桿菌（Agrobacterium）、腸桿菌（Enterobacter）、黃褐假單胞菌（Cinnamon aeruginosa）等［6-8］。因不同溶磷微生物的生長代謝能力不同，分泌的有機(jī)酸種類和數(shù)量有很大差異，且不同的有機(jī)酸與磷酸鹽中的陽離子的結(jié)合能力不一樣，因而不同的溶磷微生物對磷酸鹽的溶解能力有所不同，這是由微生物自身的特性決定的［9］。如劉文干等［10］的研究結(jié)果表明Paraburkholderia cepaciaC5-A的溶磷機(jī)制主要是通過分泌乙酸，而蕭龍珍等［11］的研究結(jié)果表明檸檬酸、乳酸是影響菌株B. megateriumXS2溶磷的重要有機(jī)酸。張英等［12］發(fā)現(xiàn)不同有機(jī)酸促進(jìn)溶解磷酸三鈣作用基本符合檸檬酸、丁二酸＞草酸、酒石酸、蘋果酸＞乙酸。另外，微生物生長發(fā)育以及分泌代謝產(chǎn)物易受外界環(huán)境的影響，即使對于同種溶磷微生物，在不同環(huán)境因子下（如碳源、氮源、pH和C/N等）也會影響其生長代謝，進(jìn)而影響溶磷能力［7］。因此，將溶磷菌研發(fā)成生物菌肥就得篩選適應(yīng)不同環(huán)境因子的微生物。

馬尾松（Pinus massonianaLamb.）作為我國南方重要的山地造林先鋒樹種和工業(yè)用材樹種，其種植面積正逐年增加。在馬尾松幼苗培育過程中，為提高幼苗產(chǎn)量和品質(zhì)，過量使用無機(jī)磷肥已成為了普遍現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致了馬尾松苗圃土壤理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)惡化、微生物種群結(jié)構(gòu)失衡、土壤難溶性磷富集，這已嚴(yán)重抑制了馬尾松產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展［13］。雖然已有許多應(yīng)用外生菌根菌通過溶磷作用對馬尾松促生的研究，但外生菌根菌往往需要在形成菌根之后才能發(fā)揮促生作用，另外因其自身特性容易受外界環(huán)境影響，進(jìn)而導(dǎo)致效果受限［14-15］。而根際溶磷細(xì)菌通常具有更強(qiáng)的繁殖能力，對環(huán)境的要求相對較低，且溶磷能力更強(qiáng)。因此，本研究從馬尾松根際土壤中篩選溶磷細(xì)菌，在明確其分類地位的基礎(chǔ)上，研究其在不同培養(yǎng)條件下的溶磷特性以及在不同時(shí)期對不同難溶性磷酸鹽的溶解能力，并通過盆栽試驗(yàn)考察溶磷菌株在土壤中的溶磷效果以及對馬尾松幼苗的促生能力，為開發(fā)溶磷微生物肥料提供優(yōu)質(zhì)菌株資源，為溶磷菌的科學(xué)應(yīng)用和維持馬尾松產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試種子：從貴州省都勻馬尾松國家林木良種基地收集馬尾松（Pinus massonianaLamb.）種子。

土壤樣品：2019年5月于貴陽市花溪區(qū)選擇一片生長良好的馬尾松林（26.44° N，106.65° E），從中隨機(jī)取5棵林齡為20年左右的健康馬尾松收集其根際土壤。采樣時(shí)，鏟去馬尾松表層土，深挖30 cm左右后截取馬尾松根系（根系直徑＜0.5 cm）5段，抖落根系外圍土，再用毛刷將粘在根上的根際土壤（根附近2 mm范圍內(nèi)）收集于無菌袋中，裝入冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室分離。

解無機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，七水合硫酸亞鐵0.03 g，四水合硫酸錳0.03 g，七水合硫酸鎂0.3 g，磷酸三鈣10.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 7.0-7.2；用于解磷微生物菌株的分離和篩選。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉 10.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 7.0-7.2；用于菌株的純化和種子液培養(yǎng)。上述培養(yǎng)基添加2.0%的瓊脂即得到相應(yīng)的固體培養(yǎng)基，在濕熱滅菌鍋121℃高壓滅菌30 min備用。

1.2 方法

1.2.1 溶磷菌的分離 稱取根系土壤采用稀釋涂布平板法依次配備濃度為10-3、10-4、10-5的土壤稀釋液，分別取0.1 mL均勻涂布于無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上。每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，置于28℃下培養(yǎng)2 d。待菌體長出后挑取四周有明顯透明圈的菌株，于LB固體培養(yǎng)基上采用劃線法進(jìn)行多次純化直至獲得純培養(yǎng)物，4℃條件下斜面保存，備用。

1.2.2 溶磷菌的篩選 采用三點(diǎn)接種法將1.2.1分離獲得的溶磷菌分別接種于無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)5 d后，測量各菌株的透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，通過計(jì)算D/d值的大小初步確定菌株溶磷能力；將初篩得到的溶磷菌接種到盛有50 mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃下120 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，取培養(yǎng)液于8 000 r/min離心10 min棄上清液，無菌蒸餾水洗滌菌體3次后稀釋、調(diào)制菌重懸液（菌體量1×108CFU/mL）。250 mL三角瓶中裝入100 mL無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，121℃條件下高壓滅菌25 min。待冷卻后，將菌懸液（1×108CFU/mL）按2%的接種量接入已滅菌的無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，以接入等量滅活菌懸液的培養(yǎng)基作為對照。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，28℃下120 r/min搖床培養(yǎng)5 d后，收集培養(yǎng)液于8 000 r/min離心10 min，取上清液采用鉬銻抗比色法測定培養(yǎng)液中有效磷含量［10］。菌株溶磷量為接菌培養(yǎng)液有效磷含量減去對照有效磷含量，用mg/L表示。

1.2.3 溶磷菌的鑒定 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察及甲基紅、接觸酶、V-P反應(yīng)試驗(yàn)等生理生化指標(biāo)的測定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［16］。菌株DNA提取以及16S rDNA PCR擴(kuò)增測定參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》［17］。將擴(kuò)增產(chǎn)物送到成都新百基生物科技有限公司進(jìn)行純化測序。將16S rDNA測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）中核酸序列進(jìn)行比對分析，并從NCBI中下載與之相似性高的相關(guān)基因序列，利用MEGA 7.0軟件采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 溶磷菌對4種難溶性磷酸鹽的溶解效果 在無機(jī)磷液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別以磷酸三鈣Ca3（PO4）2（分析純，P含量19.97%）、磷酸氫鈣CaHPO4·2H2O（分析純，P含量18.10%）、磷酸鐵FePO4·2H2O（分析純，P含量16.60%）和磷酸鋁（分析純，P含量25.40%）為唯一磷源，添加量分別為10.00 g/L、11.03 g/L、12.03 g/L和7.90 g/L，使各培養(yǎng)液中的P含量一致。將待測菌株（1×108CFU/mL）按2%的接種量接入已滅菌的各培養(yǎng)基中，以接入等量滅活菌懸液的培養(yǎng)基作為對照。28℃下120 r/min搖床培養(yǎng)7 d，每隔1 d收集1次培養(yǎng)液離心并測定其溶磷量和pH值，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.5 不同條件對菌株溶解磷酸三鈣的影響 以無機(jī)磷液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別設(shè)置不同碳源（以葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作為唯一碳源，添加量分別為10.00、10.00、9.50、9.50和9.00 g/L，使各處理C含量一致）、氮源（以（NH4）2SO4、KNO3、NH4Cl、CO（NH2）2和NH4NO3作為唯一氮源，添加量分別為0.50、0.76、0.41、0.23和0.30 g/L，使各處理N含量一致）、C/N比（葡萄糖濃度為10.0 g/L，（NH4）2SO4添加量分別為1.00、0.40、0.25、0.17 g/L，即C/N比 為10∶1、25∶1、40∶1和60∶1）、NaCl含量（分別設(shè)置培養(yǎng)基NaCl終濃度為0、2.5、5、10和20 g/L處理）以及初始pH（用0.5 mol/L鹽酸溶液和0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值，分別設(shè)置pH為4、5、6、7、8、9、10處理）。按照1.2.4相同操作接菌并培養(yǎng)5 d后，收集各處理下的培養(yǎng)液離心并測定其溶磷量，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.6 菌株對盆栽馬尾松幼苗的促生作用 盆栽試驗(yàn)的土壤基質(zhì)來自貴州大學(xué)西校區(qū)馬尾松林，土壤為鋁質(zhì)常濕淋溶土。選擇采土點(diǎn)后，去除枯枝落葉層，深挖約20 cm后取樣，于實(shí)驗(yàn)室過篩、滅菌備用。將馬尾松種子浸入30℃溫水浸泡12 h，選取沉入水底的籽粒飽滿、大小均勻的種子，表面消毒采用0.4%KMnO4溶液浸種20-30 min，無菌蒸餾水洗滌5次以上，將種子埋入裝有滅菌蛭石的托盤中，于28℃保溫箱中催芽培養(yǎng)2周，選擇長勢一致的幼苗進(jìn)行盆栽試驗(yàn)考察溶磷菌對馬尾松的促生效果。設(shè)接種細(xì)菌處理，每盆裝土0.5 kg，種植馬尾松3株，接菌量為每盆5 mL菌懸液（108CFU/mL），以接種等量滅活菌懸液的幼苗為對照，每處理設(shè)36個(gè)重復(fù)。生長期間不施肥，馬尾松生長60 d后收獲，測量馬尾松的株高、根長、植株鮮重、干重，測定植株全磷量及根際土壤中有效磷的含量［1］。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理及畫圖采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素ANOVA方差分析，多重比較采用Duncan檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法，進(jìn)化樹采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 溶磷菌的篩選

由無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上初步純化獲得產(chǎn)生明顯溶磷透明圈且形態(tài)、顏色不同的菌落20個(gè)。其中，溶磷圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值（D/d）≥2.00的菌株有5株（表1）。溶磷菌在固體培養(yǎng)下的D/d與菌株代謝物的種類、釋放快慢、蔓延程度等有關(guān)，透明圈法只能作為溶磷菌的初步篩選指標(biāo)。因此，采用無機(jī)磷液體培養(yǎng)基對這5株細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩，液體搖瓶培養(yǎng)5 d后的溶磷結(jié)果顯示（表1），5株細(xì)菌的溶磷量范圍在43.44-244.13 mg/L之間，各菌株間的溶磷能力存在顯著差異，其中以菌株WJ2的溶磷量最高，為244.13 mg/L，顯著高于其他4株菌株。

表1 馬尾松根際溶磷細(xì)菌的溶磷能力

2.2 菌株WJ2的鑒定

菌株WJ2在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h后，菌落呈乳白色，油脂狀，不透明，邊緣整齊，中心凹陷，表面濕潤、光滑（圖1-A）；革蘭氏染色結(jié)果表明該菌株屬革蘭氏陰性細(xì)菌（圖1-B）；掃描電鏡下的個(gè)體形態(tài)為短桿狀（圖1-C）；生理生化檢測結(jié)果顯示該菌株可以利用α-D-葡糖、D-果糖、D-天冬氨酸等多種碳、氮源，淀粉水解試驗(yàn)為陰性，接觸酶反應(yīng)為陽性，葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，甲基紅反應(yīng)為陰性，V-P測定為陽性，能產(chǎn)生明膠酶使明膠分解為氨基酸，溫度在40℃時(shí)不能生長，NaCl濃度在3%時(shí)不能生長（表2）。

利用通用引物27F和1492R引物擴(kuò)增獲得WJ2的16S rDNA序列的長度為1 352 bp。將該序列進(jìn)行BLAST比對結(jié)果顯示，菌株WJ2的16S rDNA核苷酸序列與Paraburkholderia caffeinilytica（NR152088.1）和P. sediminicola（NR044383.1）的16S rDNA核 苷酸序列同源性最高，分別為99.18%和99.04%。由多個(gè)細(xì)菌16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出菌株WJ2與外源菌株Arthrobacter paludis不在一個(gè)分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與多個(gè)Paraburkholderiasp.菌株聚為一個(gè)分支，表明菌株WJ2與Paraburkholderiasp.屬的親緣關(guān)系更近（圖2）。因此，結(jié)合菌株WJ2生理生化特性、菌落特征、菌體個(gè)體形態(tài)以及菌株16S序列的比對結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化分析，將菌株WJ2鑒定為伯克霍爾德氏菌Paraburkholderiasp.。菌株WJ2的16SrDNA序列提交至GenBank的登錄號為MT065821。

圖1 菌株WJ2的菌落形態(tài)、溶磷圈及個(gè)體形態(tài)

2.3 菌株WJ2對4種難溶性磷酸鹽的溶解動態(tài)監(jiān)測

結(jié)果表明菌株WJ2對4種磷酸鹽均有一定的溶解能力，表現(xiàn)出該菌株具有廣譜的溶磷性（圖3）。其中，對磷酸三鈣的溶解量最大，磷酸鋁和磷酸鐵次之，磷酸氫鈣最差，其最大溶磷量分別為204.42 mg/L、177.70 mg/L、151.82 mg/L和108.19 mg/L。此外，Pearson相關(guān)分析表明，菌株WJ2分別在磷酸鐵（r=-0.500，P＜0.05）（圖3-A）、磷酸三鈣（r=-0.844，P＜0.01）（圖3-B）、磷酸氫鈣（r=-0.533，P＜0.01）（圖3-C）和磷酸鋁（r=-0.787，P＜0.01）（圖3-D）培養(yǎng)液中的溶磷量與pH變化之間均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.4 碳源種類對菌株WJ2溶磷能力的影響

菌株WJ2在不同碳源中對磷酸三鈣的溶解能力差異顯著（圖4）。以乳糖、葡萄糖為碳源時(shí)該菌株的溶磷量最高，分別為252.93 mg/L和244.61 mg/L，顯著高于在其他碳源條件下的溶磷量；以蔗糖為碳源時(shí)的溶磷量次之，為197.87 mg/L；以可溶性淀粉為碳源時(shí)的溶磷量最低，為20.14 mg/L。這表明該菌株對碳源的利用可能主要以單糖和雙糖為主，對多糖的利用率較低。

2.5 氮源種類對菌株WJ2溶磷能力的影響

不同氮源對菌株WJ2溶解磷酸三鈣的影響差異顯著（圖5）。以尿素為氮源時(shí)該菌株的溶磷量最大，為238.19 mg/L；以硫酸銨、硝酸銨為氮源時(shí)的溶磷量次之，但與尿素?zé)o顯著差異，分別為211.70 mg/L和207.00 mg/L；其次是以硝酸鉀為氮源，溶磷量為160.26 mg/L；以氯化銨為氮源時(shí)的溶磷量最低，為100.48 mg/L。

表2 菌株WJ2的生理生化特性

圖2 菌株WJ2及其近緣種的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖3 不同磷源培養(yǎng)液中溶磷量（PSC）和pH的動態(tài)變化

圖4 碳源種類對溶磷菌WJ2溶解磷酸三鈣的影響

2.6 C/N比對菌株WJ2溶磷能力的影響

C/N比對菌株WJ2溶解磷酸三鈣的影響結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中C/N能顯著影響菌株WJ2的溶磷能力，且回歸分析表明兩者間的關(guān)系符合線性模型（R2=0.924，P＜0.05）（圖6）。以C/N比 為10∶1時(shí)菌株WJ2的溶磷量最大，為283.32 mg/L，顯著高于其他3組C/N比處理；當(dāng)C/N比為25∶1時(shí)的溶磷量次之，為204.70 mg/L；C/N比為60∶1和40∶1時(shí)溶磷量最低，分別為74.30 mg/L和84.93 mg/L，且兩者間的差異不顯著。

圖5 氮源種類對溶磷菌WJ2溶解磷酸三鈣的影響

圖6 碳氮比對溶磷菌WJ2溶解磷酸三鈣的影響

2.7 不同NaCl含量對溶磷菌WJ2溶磷能力的影響

不同NaCl濃度對菌株WJ2溶解磷酸三鈣的影響差異顯著，且回歸分析表明兩者間的關(guān)系符合線性模型（R2=0.844，P＜0.05）（圖7）。當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度為0 g/L時(shí)，菌株WJ2的溶磷量最大，為234.78 mg/L；隨著NaCl濃度的增加，菌株的溶磷量呈下降趨勢，當(dāng)NaCl濃度分別為2.5 g/L、5 g/L、10 g/L和20 g/L時(shí)，其溶磷量依次為141.00 mg/L、105.59 mg/L、54.74 mg/L、2.18 mg/L。

2.8 初始pH對菌株WJ2溶磷能力的影響

圖7 氯化鈉濃度對溶磷菌WJ2溶解磷酸三鈣的影響

菌株WJ2在不同初始pH中對磷酸三鈣的溶解能力差異顯著，且回歸分析表明兩者間的關(guān)系符合二次模型（R2=0.807，P＜0.05）（圖8）。當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH為8.0時(shí)，菌株WJ2的溶磷量最大，顯著高于其他初始pH處理，為218.33 mg/L；當(dāng)初始pH為7.0和6.0時(shí)，菌株WJ2的溶磷量仍維持在較高水平，分別為183.73 mg/L和177.61 mg/L，僅次于初始pH為8.0的處理；但當(dāng)初始pH＞8.0和pH＜6.0時(shí)菌株WJ2的溶磷能力受到顯著影響，溶磷量發(fā)生驟減。表明該菌株適應(yīng)于在中性偏堿性的環(huán)境中進(jìn)行溶磷活動。

圖8 初始pH對溶磷菌WJ2溶解磷酸三鈣的影響

2.9 盆栽試驗(yàn)菌株WJ2對馬尾松生長及土壤有效磷的影響

培養(yǎng)60 d后，接種菌株WJ2的馬尾松幼苗與對照相比，其株高、主根長度和鮮重都顯著增加，增加量分別達(dá)11.74%、45.73%、46.00%，其干重也增加了33.33%。此外，接種菌株WJ2也顯著提高土壤中有效磷含量和植株磷素含量，與對照比，分別增加了18.32%、13.82%（表3）。表明菌株WJ2能夠提高土壤中有效磷含量，促進(jìn)馬尾松幼苗的生長。

3 討論

溶磷微生物的溶磷能力主要受自身遺傳特性的影響，不同溶磷微生物的溶磷能力差異很大，溶磷微生物對不同難溶性磷也有選擇性，通常菌株能溶解的難溶性磷源越廣，則說明其溶磷特性越好［18-19］。劉文干等［10］篩選的洋蔥伯克霍爾德氏菌（Paraburkholderia cepacia）對磷酸三鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、磷礦粉的溶解量分別為125.79 mg/L、60.02 mg/L、227.34 mg/L和321.15 mg/L。蕭龍珍等［11］篩選得到的巨大芽孢桿菌（B.megaterium）對磷酸三鈣的溶解量為189.20 mg/L。薛冬等［20］從牡丹根際分離到的白網(wǎng)鏈霉菌（Streptomyces albireticuli）在不同磷源培養(yǎng)液中溶磷量依次為磷酸鈣（158.5 mg/L）＞磷酸鋁（139.9 mg/L）＞磷酸鐵（127.7 mg/L）＞卵磷脂（45.6 mg/L）。樊晶晶等［21］在連續(xù)監(jiān)測黑曲霉（Aspergillus niger）溶解磷酸三鈣時(shí)，其溶磷量在36 h后達(dá)到穩(wěn)定值，為4.7 mg/L。本研究從馬尾松根際篩選出的伯克霍爾德菌WJ2對磷酸三鈣、磷酸鐵、磷酸氫鈣和磷酸鋁的溶解能力分別達(dá)到204.42 mg/L、151.82 mg/L、108.19 mg/L和177.70 mg/L，表現(xiàn)出良好的溶磷能力。由于磷酸三鈣較磷酸鐵、磷酸鋁、磷酸氫鈣相比更易被解離，故多數(shù)研究結(jié)果表明，溶磷菌對磷酸鈣的溶解能力大于磷酸鋁、磷酸氫鈣和磷酸鐵，這與本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果相似［7，20，22］。此外，大部分研究認(rèn)為，溶磷菌溶磷過程中的溶磷量和培養(yǎng)液pH間存在顯著相關(guān)關(guān)系［7，22］。在本研究中，對伯克霍爾德菌WJ2在不同磷源中的溶磷動態(tài)進(jìn)行監(jiān)測時(shí)，發(fā)現(xiàn)其在磷酸鐵、磷酸三鈣、磷酸氫鈣和磷酸鋁培養(yǎng)液中的溶磷量與培養(yǎng)液pH呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明分泌有機(jī)酸類物質(zhì)導(dǎo)致培養(yǎng)液pH值的下降可能是該菌株溶解難溶性磷酸鹽的重要因素之一。

表3 菌株WJ2對馬尾松生長及土壤有效磷的影響

因碳、氮源作為微生物的能源物質(zhì)，其種類會影響溶磷微生物的生長代謝，進(jìn)而影響其溶解磷酸鹽的能力［23］。故本研究設(shè)置了不同碳源、氮源探究伯克霍爾德菌WJ2的溶磷特性，結(jié)果表明其在以乳糖、葡萄糖為碳源和尿素、硫酸銨、硝酸銨為氮源時(shí)均能正常利用并發(fā)揮較好的溶磷能力。這與喬志偉等［22］和蕭龍珍等［11］的結(jié)果相似。同時(shí)，溶磷菌的溶磷能力也受碳氮比的影響，且通常碳氮比越低，菌株的溶磷能力越強(qiáng)［23］。在本研究中，隨著培養(yǎng)基碳氮比的降低，菌株WJ2對磷酸三鈣的溶解能力隨之增強(qiáng)，在碳氮比為10∶1時(shí)，溶磷量達(dá)到了最大值。不同溶磷微生物溶解難溶性磷酸鹽所需最適初始pH值有所不同，pH過高或過低都影響溶磷能力。Zeng等［5］的研究表明，中性環(huán)境更有利于弗雷德里克斯堡假單胞菌（Pseudomonas frederiksbergensis）溶解磷酸鹽。李豆豆等［7］發(fā)現(xiàn)，初始pH為7-8時(shí)更適宜草酸青霉菌PSF1的生長，同時(shí)溶磷能力最強(qiáng)。本研究中，菌株WJ2在初始培養(yǎng)液pH值為8時(shí)的溶磷能力最高，隨著初始pH的升高或降低，其溶磷能力會隨之降低。此外，大部分研究表明，溶磷菌的溶磷能力在一定程度上會隨著培養(yǎng)液NaCl的含量增加而降低，這與本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果相似［5］。溶磷微生物能活化土壤中難溶性磷，提高土壤中有效磷水平，進(jìn)而提高植物對磷素的吸收率并促進(jìn)其生長［19，24-26］。在本實(shí)驗(yàn)中，接種伯克霍爾德菌WJ2的馬尾松幼苗與對照相比，其株高、主根長、鮮重等生物量均得到顯著提高，以及植株磷素含量、根際土壤有效磷含量也顯著增加。

4 結(jié)論

從馬尾松根際篩選到一株高效溶磷細(xì)菌，鑒定為伯克霍爾德菌WJ2。該菌株對磷酸三鈣、磷酸鋁、磷酸鐵和磷酸氫鈣等多種難溶性磷酸鹽有較好的溶磷能力；菌株WJ2在以乳糖、葡萄糖作為碳源，尿素、硫酸銨、硝酸銨等作為氮源、在C/N為10∶1、NaCl含量為0 g/L、pH為8.0的條件中都能表現(xiàn)出較強(qiáng)的溶磷能力；在盆栽試驗(yàn)中，菌株WJ2可提高土壤有效磷含量，促進(jìn)植株對磷素的吸收，促進(jìn)馬尾松幼苗的生長。