基于轉(zhuǎn)錄組測序花煙草響應(yīng)鹽脅迫活性氧清除相關(guān)基因的挖掘

魯琳 楊尚諭 劉維東 魯黎明

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

土壤鹽漬化是威脅植物正常生長的最重要因素之一，并對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大威脅［1］。在高鹽脅迫下，Na+所產(chǎn)生的滲透脅迫和離子毒性嚴重影響了植物細胞代謝和生理功能，阻礙植物生長和發(fā)育，嚴重時會導(dǎo)致植物的死亡［2］。在長期的進化過程中，植物形成了一套復(fù)雜的抵御鹽脅迫的機制。在鹽脅迫下，植物通過活性氧（Reactive oxygen species，ROS）清除、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和下游基因表達，以及啟動過度鹽敏性 （Salt overly sensitive，SOS）途徑等來調(diào)節(jié)其形態(tài)、生理和生化過程，以抵御外界高鹽的環(huán)境［3］。在這些機制中，ROS清除系統(tǒng)在植物對鹽脅迫的適應(yīng)中起著重要的作用。

植物在高鹽、干旱、寒冷、高溫和遭受病原菌的侵染時，均會產(chǎn)生大量的ROS，而過量的ROS，會被植物細胞的抗氧化防御系統(tǒng)所清除［4］。研究表明，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、過氧化氫酶（Catalases，CAT）、抗壞血酸過氧化物 酶（Ascorbate peroxidase，APX）、愈 創(chuàng) 木 酚 過氧化物酶（Guaiacol peroxidase，GPOX）、谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（Monodehydroascorbate reductase，MDHAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（Dehydroascorbate reductase，DHAR）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferases，GST）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）等，是植物活性氧清除的關(guān)鍵酶與主要執(zhí)行者［4］。研究表明，在鹽脅迫下，煙草幼苗的SOD、POD、CAT及APX的活性均有所增強［5-6］。同時，SbpAPX在煙草中的過表達，增強了轉(zhuǎn)基因植株對鹽及干旱的抵抗能力［7］。Cu/Zn-SOD［8-9］、Mn SOD［10-11］、POD［12］、CAT［13］、APX［14-15］及GPX［16-17］的過表達植株，均表現(xiàn)出較高的對鹽脅迫的耐受能力。

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是植物生命活動調(diào)節(jié)的重要調(diào)控形式，轉(zhuǎn)錄組測序則是了解植物基因總體表達情況的強大工具。目前，高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)在植物響應(yīng)生物及非生物脅迫的機制研究中得到了廣泛的應(yīng)用［18-20］，一大批涉及防御、物質(zhì)運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及次生代謝的基因得到鑒定，對于揭示植物抗逆的分子機制起到了很大的推動作用。

花煙草（Nicotiana alata）是屬于茄科煙草屬的一年生野生草本植物，由于其花色艷麗多樣、花期較長，在園林綠化中得到了較多的應(yīng)用。然而，土壤鹽漬化也嚴重影響了花煙草的正常生長。目前，對花煙草鹽脅迫響應(yīng)的相關(guān)研究尚不多見。

本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）技術(shù)，分析花煙草響應(yīng)鹽脅迫的基因的表達特性，重點挖掘與分析了ROS清除的相關(guān)基因，以期為花煙草耐鹽的分子機制的研究，以及耐鹽花煙草品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以花煙草（Nicotiana alata）為試驗材料，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 材料處理及轉(zhuǎn)錄組測序 幼苗材料培養(yǎng)：挑選籽粒飽滿且大小一致的種子，用次氯酸鈉溶液表面消毒后，用無菌水清洗數(shù)次，隨后播種于MS培養(yǎng)基上，并置于恒溫培養(yǎng)室中生長（光照：16 h光/8 h暗；溫度：25℃）。

鹽脅迫處理及總RNA提?。捍裏熋缟L4周后，挑選36株長勢一致的煙苗，分為3組，每組煙苗為1個重復(fù)，每重復(fù)12株煙苗。在無菌操作臺中，將其分別移苗至含有200 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上，然后，繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)（光照：16 h光/8 h暗；溫度：25℃）。在處理0 h和12 h后，按重復(fù)進行整株取樣，并置于液氮中保存，用于總RNA的提取。參照魯黎明等［21］方法提取總RNA，并經(jīng)紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送北京諾禾致源科技公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)的分析及功能注釋 對測序所獲得的原始數(shù)據(jù)，按照諾禾致源公司的數(shù)據(jù)處理方法，進行原始數(shù)據(jù)的過濾，獲得高質(zhì)量的clean reads，并進行后續(xù)分析。采用BLAST軟件，在NCBI的non-redundant（NR）、UniProt/ Swiss-Prot、Gene Ontology（GO）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes）等數(shù)據(jù)庫進行比對，并進行差異基因的功能注釋、GO及KEGG分析。

差異基因（Differentially expressed genes，DEGs）的篩選條件為P-value≤0.01，| log2Fold Changes|≥1。其中，F(xiàn)old Changes代表不同處理之間基因表達量的比值。該值大于1時，則該基因認定為上調(diào)表達；反之，則為下調(diào)表達。

1.2.3 差異表達基因的驗證 為了對轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果進行驗證，隨機挑選8個基因，并利用Primer 5.0軟件設(shè)計擴增引物（表1），采用qPCR的方法，對其表達水平進行驗證。將各處理的樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，進行qPCR反應(yīng)，內(nèi)參為β-actin。qPCR的反應(yīng)體系、反應(yīng)程序以及基因相對表達量的計算均參照魯黎明等［21］方法進行。

表1 qPCR反應(yīng)所用引物

2 結(jié)果

2.1 測序質(zhì)量分析

采用高通量測序平臺，對低溫處理組及對照組的樣品進行了RNA測序。結(jié)果顯示，共獲得47 599 094-62 591 696 clean reads（表2）。就每個樣品的GC含量來看，其含量為42.97%-43.19%，偏差很小，而且基本呈隨機分布，且Q30的數(shù)值均大于90%，說明本次測序的質(zhì)量非常可靠。

表2 各樣品測序質(zhì)量

通過對樣品重復(fù)間數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析，結(jié)果（圖1）表明，重復(fù)之間的決定系數(shù)R2最低為0.962，最高則達到了0.978，說明重復(fù)之間數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較好，可用于下一步的分析。

2.2 差異表達基因統(tǒng)計分析

將鹽脅迫處理12 h與0 h樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行對比分析，以|log2fold changes|≥1，以及P-value≤0.01為篩選條件，篩選差異表達基因。結(jié)果表明，高鹽（200 mmol/L NaCl）處理12 h后，差異表達基因的數(shù)量達到了7 239個，其中，上調(diào)表達基因4 077個，下調(diào)表達基因3 162個。

2.3 差異表達基因的GO功能注釋分析

對差異基因所進行的GO分析結(jié)果顯示，上調(diào)差異表達基因的功能主要集中于生物過程（Biological process）、細胞組分（Cell component）以及分子功能（Molecular function）方面。在生物過程中，差異表達基因所富集的GO的數(shù)目達108個；細胞組分以及分子功能則分別富集到7和32個GO條目（P-value≤0.01）。下調(diào)差異表達基因富集到12個GO條目，涉及到生物過程及分子功能2個部分。

2.3.1 上調(diào)差異表達基因富集的GO 在上調(diào)差異表達基因所富集的108個GO中，差異表達基因數(shù)量超過500個的有19個GO條目。其中，Biological process最大，包括差異表達基因4 585個（76.97%），其次為Metabolic process，包括3 660個差異表達基因（61.31%）。富集上調(diào)表達基因數(shù)目較多的屬于Biological process的前30個GO條目的具體信息見表3。

圖1 樣品各重復(fù)之間的相關(guān)性分析

富集到Cell component部分的差異表達基因，可以歸為7個GO條目，分別為Membrane（1 747，29.26%）、Photosystem（94，1.57%）、Oxidoreductase complex（48，0.80%）、Photosystem I（30，0.50%）、Chloroplast（29，0.49%）、Plastid（29，0.49%） 和Photosystem II oxygen evolving complex（25，0.42%）。其中，有48個上調(diào)差異表達基因與氧化還原酶蛋白復(fù)合體的形成有關(guān)。

在分子功能方面，上調(diào)差異表達基因富集到32個GO條目，其中，催化活性（Catalytic activity）基因數(shù)目最多（3 314，55.51%），其次為氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity）基因（852，14.27%）（表4）。值得注意的是，參與氧化還原酶活性的差異基因達1 520個，占比25.46%。

2.3.2 下調(diào)差異表達基因富集的GO 鹽脅迫下，煙草顯著下調(diào)表達的基因主要富集在生物過程（Biological process）與分子功能（Molecular function）（表5）。前者包括5個GO條目，290個基因；后者則含有7個GO條目，270個基因。生物過程的5個GO條目，全部與離子的轉(zhuǎn)運有關(guān)；分子功能的GO條目包括離子轉(zhuǎn)運活性及氧化還原活性兩類。此結(jié)果顯示，花煙草在遭受高鹽逆境時，其顯著下調(diào)表達基因的數(shù)目及富集到的GO數(shù)目，均遠遠低于上調(diào)基因。說明花煙草在響應(yīng)高鹽脅迫時，是以上調(diào)表達基因所參與的生理過程為主，同時也暗示，其離子轉(zhuǎn)運及氧化還原的生理過程可能發(fā)揮較為關(guān)鍵的作用。

2.4 差異表達基因的KEGG通路分析

通過對差異表達基因進行KEGG通路分析（圖2）。上調(diào)差異表達基因顯著富集到7條主要的代謝通路（q value ≤0.05）。富集因子最高的為Glycerolipid metabolism途徑，其次為Glycolysis/ Gluconeogenesis和Carbon fixation in photosynthetic organisms途徑。而富集差異基因最多的途徑為Biosynthesis of secondary metabolites，富集到543個差異表達基因，其次為Carbon metabolism途徑，有162個差異表達基因被富集到該途徑。

表3 上調(diào)差異表達基因的GO功能注釋分析（生物過程）

下調(diào)差異表達基因顯著富集的通路數(shù)量只有5條（q value≤0.05），其中，富集因子最高的通路為Circadian rhythm-plant。在富集基因的數(shù)量方面，這5條通路所富集差異表達基因的數(shù)量，較上調(diào)基因少了很多。富集下調(diào)差異基因最多的通路為Pyrimidine metabolism，僅僅富集了58個基因。其次，為Ribosome biogenesis in eukaryotes途徑，富集的差異表達基因數(shù)為57個。

從富集差異表達基因的代謝途徑數(shù)量的角度也可以看出，高鹽處理后，花煙草代謝途徑中，上調(diào)基因富集的代謝途徑數(shù)量遠遠高于下調(diào)基因。從而在某種程度上說明，花煙草在遭受高鹽脅迫后，其生理響應(yīng)過程主要以上調(diào)相關(guān)基因的表達為主。

2.5 花煙草響應(yīng)高鹽脅迫的抗氧化基因分析

植物在遭受高鹽、干旱等非生物及生物脅迫時，均會產(chǎn)生ROS，過量的ROS會對細胞的正常生命活動造成阻遏。因此，細胞會動員其抗氧化系統(tǒng)來清除這些ROS。為了探索花煙草抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵基因的表達對高鹽脅迫的響應(yīng)，分析了差異表達基因中SOD、POD、CAT等7類ROS清除基因的表達。結(jié)果表明，在花煙草受到高鹽脅迫后，共有45個ROS清除相關(guān)基因的表達發(fā)生了顯著改變，其中，上調(diào)表達基因28個，下調(diào)表達基因17個。上調(diào)表達的倍數(shù)最小為1.10倍（GST），最高為3.10倍（CAT）；下調(diào)表達的倍數(shù)最小為1.14倍（GST），最高為3.32倍（POD43）。上調(diào)表達基因中，數(shù)量最多的為GST（16），其 次 為POD（5）、SOD（4）、CAT（2）和GPX（1）（圖3）。下調(diào)表達基因中，數(shù)量最多的為GST（6），其次為POD（5）、SOD（2）、GPX（2）、APX（1）和GR（Glutathione reductase，2）。綜上所述，花煙草在高鹽脅迫下，其抗氧化的機制主要是上調(diào)抗氧化基因的表達，以啟動相應(yīng)的生理反應(yīng)，從而抵御不利的環(huán)境。

表4 上調(diào)差異表達基因的GO功能注釋分析（分子功能）

表5 下調(diào)差異表達基因的GO功能注釋分析

2.6 qRT-PCR驗證

為了驗證RNA測序結(jié)果的可靠性，隨機選取了POD42、GST1、CAT1、CIPK11、ERF4、GPX4、MYB5和CIPK6等8個基因進行qPCR擴增，并與其測序結(jié)果進行對比（圖4）。從圖4可以看出，2種方法中，所選擇的8個基因的表達趨勢一致，從而說明本研究RNA測序結(jié)果較為可靠，同時也表明，對RNA測序結(jié)果所做的相關(guān)分析較為客觀。

3 討論

鹽漬化是植物在生長過程中所遭受到的主要的環(huán)境脅迫之一。在高鹽脅迫下，植物細胞會對自己的生理活動進行調(diào)節(jié)，以抵御其對植物生長的影響。其中，活性氧清除系統(tǒng)對鹽脅迫所誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS的清除，是主要的生理響應(yīng)過程［4］。高等植物的酶促活性氧清除系統(tǒng)主要包括SOD、POD、CAT、APX、GPX、GST及GR等，其主要的功能，就是將鹽脅迫下在葉綠體、線粒體等細胞器中產(chǎn)生的過量的ROS進行還原，以降低其產(chǎn)生的危害。在本研究中，花煙草在鹽脅迫下，有7類共45個活性氧清除基因的表達發(fā)生了顯著變化（P ＜0.05），暗示鹽脅迫將導(dǎo)致花煙草眾多的生理進程發(fā)生改變。

3.1 SOD、POD和CAT

SOD、POD及CAT是植物最為常見的ROS清除酶類。在逆境脅迫下，植物編碼這3類酶基因表達的提高，酶活性的增強，對ROS的清除能力也大幅度提升，從而提高了植物對不良環(huán)境的抵御能力［4］。研究表明，抗鹽能力較強的基因型，其抗氧化的能力也強，在遭受高鹽脅迫時，其長勢及生物量均較不耐鹽的基因型有較大的優(yōu)勢［1］。同時，當SOD、POD和CAT在植物中過表達時，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力均顯著增強［8-13］。在本研究中，當花煙草面臨高鹽脅迫時，編碼SOD、POD及CAT 3個酶類的11個基因的發(fā)生了顯著的上調(diào)表達變化。其中，上調(diào)表達最高為3.1倍（CAT）。揭示花煙草響應(yīng)鹽脅迫過程中，SOD、POD和CAT發(fā)揮著十分重要的作用，其中，CAT的作用值得關(guān)注。

然而，在本研究中，也有5個編碼POD的基因及2個編碼SOD的基因發(fā)生了下調(diào)表達。這種現(xiàn)象產(chǎn)生的意義需要進一步的研究，同時，此結(jié)果也說明，花煙草對鹽脅迫的響應(yīng)，可能存在正向與負向兩種調(diào)控方式，其中，正向調(diào)節(jié)作用可能占主導(dǎo)地位。

3.2 APX與GPX

圖2 差異表達基因的KEGG分析

抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）及谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）是2個構(gòu)成植物抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵酶類。APX是一類在高等植物中廣泛存在的亞鐵血紅素蛋白，包括了4個不同的亞型，即葉綠體APX（sAPX）、類囊體APX（tAPX）、微體APX（mbAPX）和胞質(zhì)APX（cAPX）［22］。APX的表達受生物及非生物脅迫因子的廣泛誘導(dǎo)。研究表明，在鹽脅迫下，堿蓬的SsAPX［23］及白樺的APX［24］的表達均顯著升高；擬南芥APX［25］及棗樹ZjAPX［26］的過表達，則顯著增強了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力。

圖3 花煙草響應(yīng)高鹽脅迫的抗氧化基因

圖4 RNA測序與qPCR基因表達水平的比較

GPX也是細胞ROS清除的重要酶類，同樣是由多個同工酶組成的大家族。GPX能夠有效地清除細胞過氧化物，防止ROS對細胞的傷害，并因而在植物生長發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用［27］。例如，衣藻（Chlamydomonas）GPX［28］、小麥GPX［29］的過表達，均增強了轉(zhuǎn)基因植株對鹽、低溫的耐受能力。然而，植物GPX的表達較為復(fù)雜，在大多數(shù)情況下，GPX以上調(diào)表達的方式參與環(huán)境脅迫的響應(yīng)［27］，但高粱（Sorghum bicolor）的SbGPX6與SbGPX7［30］，在干旱脅迫下卻是下調(diào)表達。

以上結(jié)果均表明，APX與GPX均參與了植物對鹽脅迫的響應(yīng)。在本研究中，花煙草在鹽脅迫下，有1個GPX上調(diào)表達了1.27倍，另外2個GPX及1個APX均為下調(diào)表達。揭示花煙草APX及GPX參與鹽脅迫響應(yīng)有自己的特點，而且可能主要是負向調(diào)控方式。

3.3 GST

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）也是由多基因編碼的基因家族，其功能較為廣泛，參與了細胞的解毒、抗氧化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，因而在植物的生長發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用［31］。研究表明，植物的GST參與了高鹽、低溫、干旱、UV及ABA等多種非生物脅迫的響應(yīng)［32］。例如，擬南芥AtGSTU19參與了植物的抗旱與抗鹽脅迫［33］；過表達煙草［34］及堿蓬［35］的GST，能夠顯著增強轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽能力。然而，GST參與植物的逆境脅迫響應(yīng)的方式較為復(fù)雜，如AtGSTU17可能作為負調(diào)節(jié)因子，參與了擬南芥對干旱和鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，其較低的表達量或基因敲除有助于擬南芥抗性的提高［36］。

本研究也得出了類似的結(jié)果，在高鹽脅迫下，花煙草22個GST的表達顯著增強，其中，有16個顯著上調(diào)（最高2.81倍），6個則顯著下調(diào)（最高2.22倍）（圖3）。表明在花煙草的高鹽脅迫應(yīng)答中，GST占有舉足輕重的地位，同時，其不同成員間發(fā)揮作用的機制可能并不相同。

3.4 GR

谷胱甘肽還原酶（GR）與GST和GPX共同構(gòu)成了谷胱甘肽循環(huán)的重要組件，并且在ROS清除機制中發(fā)揮重要作用［31］。GR的基本功能是催化還原型谷胱甘肽（GSH）的合成，維持細胞內(nèi)的較高水平的還原力；同時，GR還能夠與SOD等酶系統(tǒng)共同作用，清除細胞內(nèi)多余的ROS［37］。所以，GR活性的增強，有利于植物抗氧化能力的提升，并最終提高了植物對生物及非生物逆境脅迫的抵御能力。植物GR在鹽脅迫應(yīng)答中的功能研究報道尚不多見，已有的研究表明，在鹽脅迫誘導(dǎo)下，水稻的GR3［38］、茶樹CsGR1［39］、油菜的GR2［40］、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）JcGR［41］等基因的表達明顯升高；而水稻GR3的敲除，則導(dǎo)致了突變體對鹽脅迫的敏感［42］。但是GR對脅迫的應(yīng)答的方式并不相同，如在鹽脅迫下，茶樹的CsGR2則顯著下降［39］。與此相類似，花煙草在高鹽環(huán)境下只有1個GR發(fā)生了下調(diào)表達（下調(diào)1.33倍）（圖3），說明在花煙草的鹽脅迫響應(yīng)中，GR也可能發(fā)揮著一定的作用，其作用的機制有待于進一步的探索。

4 結(jié)論

在鹽脅迫下，花煙草大量的基因發(fā)生了顯著的差異表達。這些差異表達基因的功能，主要集中在生物過程及金屬離子轉(zhuǎn)運等方面。其中，有7大類45個活性氧清除相關(guān)基因的表達模式變化明顯。本研究的結(jié)果說明，花煙草通過改變自身眾多的生理進程，以適應(yīng)外界的鹽脅迫環(huán)境。其中，增強對鹽脅迫所產(chǎn)生的活性氧的清除能力，是花煙草抵御鹽脅迫的主要機制之一。