白囊耙齒菌錳過氧化物酶基因的表達(dá)和酶學(xué)分析

崔周磊， 王洪成， 武俊明， 陳華友

(1. 江蘇大學(xué) 生命科學(xué)研究院, 鎮(zhèn)江 212000; 2. 江蘇中興藥業(yè)有限公司, 鎮(zhèn)江 212000)

玉米秸稈較經(jīng)濟(jì)的處理方式是運(yùn)用生物轉(zhuǎn)化方法發(fā)酵處理，使之成為優(yōu)質(zhì)牛羊生物粗飼料[1]。未經(jīng)處理的玉米秸稈口感粗糙且消化和吸收率較低，這是因?yàn)橛衩捉斩捴械哪举|(zhì)素包被在纖維素的外層，這種緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)阻礙了纖維素酶與纖維素的接觸[2-3]，是秸稈飼料化生產(chǎn)過程中最大的難點(diǎn)之一。NCBI數(shù)據(jù)庫顯示，白囊耙齒菌Irpexlacteus(I.lacteus)有一整套木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)，包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶(manganese peroxidase，MnP)、漆酶、多功能酶以及其他協(xié)同酶，可在9 d內(nèi)降解玉米秸稈中86.3%的纖維素、83.5%的半纖維素和74.9%的木質(zhì)素[4]。錳過氧化物酶可以氧化木質(zhì)素中的酚類結(jié)構(gòu)單元及其他難以降解的化學(xué)結(jié)構(gòu)，是一種高效的木質(zhì)素降解酶[5]。自然界中的I.lacteus誘導(dǎo)性表達(dá)MnP，但生長(zhǎng)速度緩慢，如果直接應(yīng)用于玉米秸稈發(fā)酵會(huì)增加發(fā)酵時(shí)間和生產(chǎn)成本[6-8]。因此，本研究旨在將I.lacteus中的錳過氧化物酶基因轉(zhuǎn)入到合適的表達(dá)系統(tǒng)中，進(jìn)行MnP的異源表達(dá)，從而初步有效地了解錳過氧化物酶的酶學(xué)性質(zhì)，以期為后續(xù)錳過氧化物酶基因?qū)肷锇踩缘娘曈媒湍腹こ叹械於ɑA(chǔ)，為秸稈飼料行業(yè)發(fā)酵技術(shù)進(jìn)一步研究提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)感受態(tài)菌株購自上海生物工程有限公司。質(zhì)粒pET-28a由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基配制參考文獻(xiàn)[9]。如需添加硫酸卡那霉素 (kan) ，待高壓滅菌后冷卻至50 ℃時(shí),再加kan混勻，kan的質(zhì)量濃度為50 mg/L。

1.3 主要試劑

TaqDNA 聚合酶、DNA Marker、PremixTaqTM購自寶生物工程(大連) 有限公司(TaRaKa); Protein Marker、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、瓊脂糖及Ni-TED 瓊脂糖純化樹脂預(yù)裝重力柱(C600793)購自生工生物工程有限公司；ClonExpress? MultiS One Step Cloning Kit(C112-01)非連接酶依賴型的多片段一步克術(shù)試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR引物合成和DNA測(cè)序由生工生物工程(上海)有限公司完成。錳過氧化物酶測(cè)試盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、ZnSO4、FeCl2和CuSO4等分析純?cè)噭┵徲趪?guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.4 重組錳過氧化物酶質(zhì)粒的構(gòu)建

將I.lacteus中的錳過氧化物酶基因序列(NCBI-GenBank: MH120207.1)導(dǎo)入信號(hào)肽分析軟件 SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)，獲得其融合一段含19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。去除信號(hào)肽后,MnP核苷酸序列為1 035 bp，經(jīng)密碼子優(yōu)化后MnP基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

根據(jù)MnP序列和載體pET-28a序列，通過CE Design V1.04設(shè)計(jì)載體線性化引物P1和P2以及MnP線性化引物P3和P4(見表1)，以pET-28a為模板，用P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增出載體的線性化片段(PCR擴(kuò)增條件：98 ℃ 預(yù)變性10 s；98 ℃ 變性10 s，55 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 再延伸5 min)。以合成的MnP為模板，用P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增出MnP線性化片段(PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 再延伸10 min)。載體pET-28a的線性化片段與MnP線性化片段通過ClonExpress? MultiS One Step Cloning Kit試劑盒進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于kanLB平板，37 ℃過夜。挑取LB平板上的單菌落液體培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒。根據(jù)MnP核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性鑒定引物P5和P6(見表1)，該引物在空載質(zhì)粒和宿主菌基因組中無特異性結(jié)合位點(diǎn)，故可以進(jìn)行菌液PCR鑒定陽性克隆。最后將陽性克隆送上海生工有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 重組錳過氧化物酶的表達(dá)與純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-28a-MnP轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)中，涂布于含kan的固體LB固體培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)。挑取E.coli-pET-28a-MnP的陽性轉(zhuǎn)化子接入含5 mL LB培養(yǎng)液中，30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1% 接種量將過夜培養(yǎng)的菌液接入到100 mL含有kan的LB液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)2.5 h左右，至OD600為0.6，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4.5 h。將誘導(dǎo)后的菌液在8 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清液，PBS溶液清洗細(xì)菌沉淀2次，向最終獲得的細(xì)菌沉淀中加入5 mL細(xì)胞裂解液，充分懸浮菌體。在冰水浴條件下，利用超聲破碎儀(功率200 W，超聲時(shí)間6 s，間歇6 s，共破碎 20 min)破碎菌體。破碎完成后，4 ℃，12 000 r/min，離心20 min，收集破碎上清液。經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，低流速將破碎上清液加入到結(jié)合緩沖液平衡過的Ni-TED 瓊脂糖純化樹脂預(yù)裝重力柱中，再用洗雜緩沖液漂洗5個(gè)柱體積，之后用分別含有20、50、100、150、200、250和300 mmol/L的洗脫緩沖液梯度洗脫，每種濃度清洗2個(gè)柱體積，收集洗脫液。將每一步采集的洗脫液用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)其中的蛋白。同時(shí)以相同培養(yǎng)條件下的E.coli-pET-28a 菌體作為空白對(duì)照。

1.6 重組錳過氧化物酶的酶學(xué)性質(zhì)

鎳柱親和層析分離純化后的蛋白溶液為酶活測(cè)定液，錳過氧化物酶活性測(cè)定體系為3.2 mL反應(yīng)體系：100 mmol/L琥珀酸緩沖液2 mL，4 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液0.7 mL，5 mmol/L MnSO4溶液0.2 mL，2.5 mmol/L H2O2溶液0.1 mL，粗酶液0.2 mL，在37 ℃預(yù)熱20 min后，依次向比色皿中加入以上溶液，放入分光光度計(jì)中后馬上加入0.1 mL H2O2溶液，啟動(dòng)酶促反應(yīng)的發(fā)生，記錄反應(yīng)3 min內(nèi)波長(zhǎng)為465 nm處吸光度的差值。同時(shí)以煮沸滅活的粗酶液替代原酶液在同樣條件下的反應(yīng)為對(duì)照組。MnP酶活的定義為：每毫克蛋白每分鐘催化1 nmol 愈創(chuàng)木酚為四鄰甲氧基連酚所需要的酶量即為1個(gè)酶活力單位(U)。

表1 引物序列

1.6.1 重組MnP的最適溫度和熱耐受性

在不同溫度條件(20 ℃～90 ℃，10 ℃為1個(gè)梯度)下用上述方法測(cè)定MnP活力，將最高酶活力記為100%，其他酶活力與最高酶活力的比值即為相對(duì)酶活力。在pH 3.0條件下，將酶活測(cè)定液分別置于不同溫度(20 ℃～90 ℃，10 ℃為1個(gè)梯度)下保持1 h，測(cè)定相對(duì)酶活力，以確定熱穩(wěn)定性。

1.6.2 重組MnP的最適pH和pH值耐受性

在37 ℃反應(yīng)條件下，在不同pH(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0)琥珀酸緩沖液中用上述方法測(cè)定MnP活力。將最高酶活力記為100%，其他酶活力與最高酶活力的比值即為相對(duì)酶活力；在37 ℃條件下，將酶活測(cè)定液分別置于不同pH值(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0)保持1 h，以確定穩(wěn)定性。

1.6.3 金屬離子對(duì)重組MnP酶活力的影響

向酶活測(cè)定液中分別添加不同濃度的 Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+和Cu2+金屬離子，室溫放置 30 min 后用于酶活測(cè)定。設(shè)定未添加金屬離子的酶活性為100%，加入金屬離子的酶活性折算成相對(duì)酶活，比較金屬離子對(duì)酶活性的影響，每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

1.7 重組錳過氧化物酶對(duì)木質(zhì)素的降解效果

將1.5節(jié)中的破碎上清液與粉碎后40目過篩的玉米秸稈、麩皮按料液1∶1混合，放置40 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中靜止反應(yīng)，于反應(yīng)24 h和48 h后分別取樣，每個(gè)樣品設(shè)置3組平行。酶解反應(yīng)結(jié)束后，所有樣品105 ℃烘干至恒重，然后采用Van Soest法測(cè)定木質(zhì)素的變化值[10]。在相同情況下用E.coli-pET-28a 菌體作空白對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組錳過氧化物酶質(zhì)粒的構(gòu)建

MnP線性化引物P1和P2及載體線性化引物P3和P4經(jīng)PCR擴(kuò)增，分別獲得了1 053 bp和5 277 bp的片段，結(jié)果如圖1所示。經(jīng)過ClonExpress?技術(shù)將合成MnP片段與PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α。提取質(zhì)粒后用特異性鑒定引物P5和P6進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，空白對(duì)照無條帶，陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增得到了與目的基因大小一致(732 bp)的條帶(圖1)。最后重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，該質(zhì)粒命名為pET-28a-MnP。

M: DL 10 000 Marker; 1: pET-28a; 2: MnP; 3: Blank; 4: pET-28a-MnP

2.2 重組錳過氧化物酶的表達(dá)與純化

測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-28a-MnP轉(zhuǎn)入E.coliBL21 (DE3)中，經(jīng)0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4.5 h后，破碎上清液用Ni-NTA親和層析對(duì)重組酶純化，純化后SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2所示。結(jié)合在鎳柱上的蛋白在咪唑濃度為300 mmol/L時(shí)被洗脫下來，通過TotalLab quant 凝膠成像分析得出重組MnP的表觀分子量約為43 ku。純化后的重組酶經(jīng)One DropTMOD 1000+測(cè)定其蛋白質(zhì)量濃度為0.36 mg/mL，經(jīng)錳過氧化物酶測(cè)試盒檢測(cè)計(jì)算得到純化后的MnP的酶活力為24 U/mg。

2.3 重組錳過氧化物酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 溫度對(duì)重組MnP酶活力和熱穩(wěn)定性的影響

圖3表明：在20 ℃～40 ℃，MnP活力隨著溫度的升高而增加；當(dāng)溫度超過40 ℃后，MnP活力隨溫度的增加而下降；當(dāng)溫度到達(dá)90 ℃時(shí)，MnP完全失去活力。這說明重組錳過氧化物酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃。在20 ℃～50 ℃時(shí)，MnP活力較穩(wěn)定，其相對(duì)酶活保持在90%以上；當(dāng)溫度高于50 ℃后， MnP活力下降。這表明重組MnP在50 ℃內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

M:Protein Marker; 1: pET-28a; 2: pET-28a-MnP; 3～8:washing buffer of 20, 50, 100, 150, 200, 250 mmol/L imidazole; 9: MnP washed by 300 mmol/L imidazole

圖3 溫度對(duì)重組MnP酶活力和熱穩(wěn)定性的影響

2.3.2 pH值對(duì)重組MnP酶活力和pH值穩(wěn)定性的影響

從圖4可以看出：當(dāng)pH值在2.0～3.0時(shí)，隨著pH值的升高，MnP活力逐漸增加；在pH值超過3.0后，MnP活力呈下降趨勢(shì)；在pH 6.0時(shí)，MnP活力幾乎為0。這說明MnP的最適pH值為3.0，且在中性條件下，該重組酶不具活力。另外，MnP活力在pH 2.5～3.5時(shí)比較穩(wěn)定，其相對(duì)酶活力保持在90%以上。

2.3.3 金屬離子對(duì)重組MnP活力的影響

從圖5可以看出：Na+在1 mmol/L和5 mmol/L時(shí)，對(duì)MnP沒有激活作用，但是當(dāng)離子濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)，對(duì)MnP有激活作用，可以提高酶活性24%；K+在低濃度1 mmol/L時(shí)，對(duì)MnP有激活作用，但隨著濃度的增高，對(duì)MnP有抑制作用；Ca2+和Mg2+在低濃度時(shí)，對(duì)酶活沒有太多影響，當(dāng)離子濃度提高到10 mmol/L時(shí)，對(duì)MnP有明顯的激活作用，可以提高酶活性53%和30%；Zn2+在不同濃度下對(duì)MnP有不同的抑制效果，在5 mmol/L時(shí)，抑制酶活較明顯；Fe2+和Cu2+在不同的濃度下，均有明顯的抑制作用。

圖4 pH對(duì)重組MnP酶活力和pH值穩(wěn)定性的影響

圖5 不同濃度金屬離子對(duì)MnP活力的影響

表2 麩皮和玉米秸稈中木質(zhì)素的含量及其降解率變化

2.4 重組錳過氧化物酶對(duì)木質(zhì)素的降解效果

麩皮和秸稈經(jīng)過破碎上清液酶解24 h和48 h分別取樣進(jìn)行木質(zhì)素的測(cè)定結(jié)果見表2。使用Excel 2010和SPSS軟件單樣品t檢驗(yàn)分析，木質(zhì)素降解率=(空白對(duì)照組木質(zhì)素含量-48 h酶解后木質(zhì)素含量)÷空白對(duì)照組木質(zhì)素含量×100。從表2可以看出，隨著時(shí)間的增加，木質(zhì)素的含量明顯下降，表明破碎上清液對(duì)麩皮和玉米秸稈中的木質(zhì)素有明顯的降解作用。數(shù)據(jù)得出麩皮和玉米秸稈的木質(zhì)素降解率分別為27.3%和35.8%。數(shù)據(jù)分析顯示重組錳過氧化物酶對(duì)木質(zhì)素的降解效果顯著。

木質(zhì)素的降解是多種酶系的共同作用結(jié)果，錳過氧化物酶只是其中的一種作用酶，且大多數(shù)是以同工酶的形式分泌胞外發(fā)揮作用的[11]。本實(shí)驗(yàn)中重組MnP的最適pH為3.0，在酸性條件下，相對(duì)酶活可以保持在90%以上，秸稈飼料在低pH值中更有利于儲(chǔ)存[12]，因此該重組MnP具有應(yīng)用前景。從離子分析可以看出：Ca2+的酶活促進(jìn)作用較明顯，Ca2+是微生物生長(zhǎng)的必要元素，且能有效防止MnP發(fā)生熱失活，有利于菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶[13]；Cu2+對(duì)MnP酶活力有明顯的抑制作用，由于Cu2+是重金屬離子，重金屬對(duì)生物有毒害作用，可使蛋白質(zhì)變性。從圖5也可看出，隨著Cu2+濃度的增加，MnP酶活抑制作用越明顯[14]。另外，在其他報(bào)道中，F(xiàn)e2+對(duì)很多真菌中的錳過氧化物酶抑制作用明顯[13,15-16]，不同濃度的Fe2+對(duì)MnP酶活抑制作用程度不同，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相同。

本實(shí)驗(yàn)選用的白囊耙齒菌是新測(cè)序的白腐菌，目前該菌的研究集中于對(duì)染料脫色處理[17-18]，在發(fā)酵秸稈飼料的領(lǐng)域研究較少。白囊耙齒菌的生長(zhǎng)周期很長(zhǎng)，在天然情況下錳過氧化物酶基因選擇性表達(dá)，且分泌的錳過氧化物酶量較少。如果單獨(dú)使用白囊耙齒菌進(jìn)行飼用發(fā)酵，無法保證秸稈飼料的品質(zhì)，同時(shí)也會(huì)影響產(chǎn)業(yè)周期。何平等[19]用12種誘導(dǎo)劑探究對(duì)I.lacteus產(chǎn)MnP的影響，這些誘導(dǎo)劑可以提高M(jìn)nP的酶活力，但用于發(fā)酵秸稈飼料中，食品安全性遭到質(zhì)疑。因此，將高效優(yōu)質(zhì)的木質(zhì)素降解酶基因轉(zhuǎn)入生物安全性的真核表達(dá)載體中表達(dá)，已成為一個(gè)新的研究方向。在未來，擬用大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)[20]，將錳過氧化物酶基因?qū)胧称钒踩?jí)別的酵母表達(dá)系統(tǒng)，如畢赤酵母(Pichiapastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等，構(gòu)造出若干組高比酶活錳過氧化物酶工程菌，為秸稈飼料行業(yè)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將白囊耙齒菌中的錳過氧化物酶基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行異源表達(dá)獲得了大量的錳過氧化物酶，經(jīng)過鎳柱純化后獲得較純蛋白，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明，MnP作用底物的最適溫度為40 ℃，最適pH值為3.0，Ca2+、Mg2+在離子濃度10 mmol/L時(shí)對(duì)MnP酶活力有促進(jìn)作用，Cu2+和Fe2+對(duì)MnP酶活力有抑制作用。重組酶在48 h內(nèi)降解玉米秸稈中35.8%、麩皮中27.3%的木質(zhì)素。該酶作為一種錳離子依賴的過氧化物酶，在pH 2.5～3.5時(shí)有穩(wěn)定的酶活。這種特性有助于白囊耙齒菌在酸性條件下生存。目前，飼料在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)，該酶的存在有利于飼料發(fā)酵后期木質(zhì)素的降解，在飼料酶制劑領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。