• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于DNA甲基化的分子亞型可預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后

    2020-12-21 08:12:10楊阮阮李錦忠龔曉兵
    海南醫(yī)學(xué) 2020年22期
    關(guān)鍵詞:甲基化基因組位點(diǎn)

    楊阮阮,李錦忠,龔曉兵

    暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科,廣東 廣州 510632

    原發(fā)性肝癌是世界上第六大常見的癌癥,也是導(dǎo)致癌癥死亡的第三大原因,最常見的組織學(xué)是肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[1]。改善 HCC 患者預(yù)后一個(gè)重要阻礙是對(duì)HCC 的異質(zhì)性不完全了解。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為,每個(gè)原發(fā)性腫瘤的變異可能由遺傳和表觀遺傳上不同的細(xì)胞組成,這導(dǎo)致每種腫瘤類型具有特定的表型異質(zhì)性[2],在這些腫瘤細(xì)胞中有一些被稱為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSC),其負(fù)責(zé)產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤病變,也有可能助于治療腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,通過對(duì)表觀遺傳的分子亞型進(jìn)行臨床特征及預(yù)后的分析對(duì)了解腫瘤異質(zhì)性具有重要意義。

    表觀遺傳是基因表達(dá)的可遺傳狀態(tài)而不改變DNA序列,甲基化是表觀遺傳學(xué)中最重要和最常見的修飾,也是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段[3]。全基因組甲基化水平降低是癌癥早期的一種顯著標(biāo)志,并可能與癌癥的嚴(yán)重程度及轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)聯(lián)。而特定基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG 島異常高甲基化是癌癥另一重要現(xiàn)象,導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)的改變并使腫瘤抑制基因和其他癌癥相關(guān)基因沉默,使癌細(xì)胞能適應(yīng)微環(huán)境并促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展[4-5]。SHIN 等[6]分析了 HCC 和非腫瘤肝組織的甲基化譜,發(fā)現(xiàn)了HCC 中新的高甲基化基因,如TNFRSF10C 和IRF5 (參與細(xì)胞凋亡),HOXA9(胚胎發(fā)育過程中受調(diào)控)和NPY(參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞增殖)。此外,在腫瘤組織69 個(gè)顯著低甲基化的基因中,已經(jīng)鑒定出IL16 (趨化因子介導(dǎo)的免疫相關(guān)基因),BLK 和PGR 癌基因以及組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)。然而,尚未確定這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的特定甲基化序列。因此,本文基于高通量組學(xué)數(shù)據(jù)整合了HCC的多個(gè)DNA甲基化生物標(biāo)志物,開發(fā)了一種預(yù)后預(yù)測(cè)模型,以改善臨床預(yù)后評(píng)估和個(gè)性化治療。

    1 資料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)獲取和預(yù)處理 從TCGA 數(shù)據(jù)(https://cancergenome.nih.gov/)下載 level 3 級(jí)的 RNA-seq 數(shù)據(jù)(FPKM),包括374例肝細(xì)胞癌(Liver hepatocellular carcinoma,LIHC)患者樣本和50 例癌旁樣本。從UCSC(https://xenabrowser.net/)下載 430 例 LIHC 的 Illumina Infinium HumanMethylation450 陣列的甲基化數(shù)據(jù)。用 Perl(5.26)語(yǔ)言(http://www.perl.org/)的合并及 ID 轉(zhuǎn)換腳本提取DNA甲基化矩陣和轉(zhuǎn)錄組矩陣,本研究?jī)H包括來自臨床隨訪時(shí)間超過30 d 的樣本數(shù)據(jù)。每個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平由β值表示,其范圍為0(未甲基化)至1(完全甲基化)。使用sva R package[7]中的ComBat算法,通過整合所有DNA甲基化陣列數(shù)據(jù),合并batch和patient信息來去除batch效應(yīng)。

    1.2 預(yù)后相關(guān)的甲基化位點(diǎn)篩選 首先,使用單變量Cox模型來計(jì)算每個(gè)異常甲基化基因的甲基化水平與患者總體存活(overall survival,OS)之間的關(guān)聯(lián),當(dāng)P<0.05時(shí),可以認(rèn)為基因在單變量Cox分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。然后,使用TMN 分期,病理分期(Stage),組織學(xué)分級(jí)(Grade),年齡和性別將從單變量COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中獲得的顯著CpGs引入多變量COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中,這些變量在單變量模型中也很重要。最后,選擇在單變量和多變量Cox 回歸分析中均顯著的CpG位點(diǎn)作為特征性CpG位點(diǎn)。

    1.3 甲基化腫瘤分型 使用R 中的Consensus Cluster Plus軟件包[9]進(jìn)行一致性聚類。根據(jù)最多可變的CpG位點(diǎn)識(shí)別LIHC子組。對(duì)應(yīng)于一致性聚類的熱圖由pheatmap R 包生成。使用顏色漸變表示從0(白色)到1(深藍(lán)色)的共識(shí)值;排列矩陣,使得屬于同一簇的項(xiàng)目彼此相鄰。在這種布置中,對(duì)應(yīng)于完美共識(shí)的矩陣將顯示顏色編碼的熱圖,其特征是沿著白色背景上對(duì)角線的藍(lán)色塊。

    1.4 生存和臨床特征分析 Kaplan-Meier 圖用于說明DNA 甲基化譜圖定義的LIHC 亞組的總體存活率。使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)來評(píng)估集群之間差異的顯著性。使用R中的生存軟件包進(jìn)行生存分析。使用R的ggplot2 包進(jìn)行腫瘤分型與臨床特征的相關(guān)性分析。在所有測(cè)試中,P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    1.5 功能富集分析和基因組注釋 將R 中的clusterProfiler 包[10]與 KEGG 結(jié)合使用,對(duì)預(yù)后位點(diǎn)所在的基因組中的基因本體論,生物途徑和調(diào)控基序進(jìn)行基因富集分析。

    1.6 預(yù)后預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建和評(píng)估 R 中生存包的coxph函數(shù)用于基于CpG位點(diǎn)的甲基化圖譜和預(yù)后信息的組合來構(gòu)建Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=CpG1*風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)CpG1+CpG2*風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)CpG2+CpGN*風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)CpGN(“*”代表乘法)。Suivival、ROC 曲線和Calibration plot (校準(zhǔn)圖)判斷風(fēng)險(xiǎn)模型的臨床應(yīng)用價(jià)值。

    2 結(jié)果

    2.1 篩選與OS相關(guān)的潛在預(yù)后甲基化位點(diǎn) 經(jīng)對(duì)患者數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后,確定了16 381個(gè)甲基化位點(diǎn)。然后使用單變量Cox 回歸分析,在16 381 個(gè)甲基化位點(diǎn)中,有7 917 個(gè)CpG 位點(diǎn)被確定為肝細(xì)胞癌(LIHC)患者OS 相關(guān)的潛在DNA 甲基化生物標(biāo)記物(P<0.05)。多因素獨(dú)立預(yù)后分析篩選出具有獨(dú)立預(yù)后能力的2 248個(gè)CpG位點(diǎn)。

    2.2 不同的DNA甲基化預(yù)后亞組和簇間預(yù)后分析 使用2 248個(gè)潛在的預(yù)后甲基化位點(diǎn)的一致性聚類來識(shí)別LIHC 的不同DNA 甲基化分子亞組以進(jìn)行預(yù)后分析。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)確定簇的數(shù)量:簇內(nèi)的一致性較高,變異系數(shù)相對(duì)較低,CDF 曲線下的面積沒有明顯增加(圖1A、1B)。根據(jù)類別數(shù)計(jì)算了平均聚類一致性和聚類之間的變異系數(shù)。累積分布函數(shù)(CDF)曲線下的面積在7 個(gè)類別后開始趨于穩(wěn)定(圖1B),最后確定最佳簇?cái)?shù)為7,并制作了相關(guān)樹狀圖表示定義明確的7 塊結(jié)構(gòu)及其一致性(圖1C),另外TMN 分期,Stage,Grade,年齡,性別和 DNA 甲基化亞組作為注釋,利用heatmap 函數(shù)生成與上述k=7 樹圖相對(duì)應(yīng)的heatmap 圖譜(圖 2)。Kaplan-Meier 生存分析顯示 7 個(gè)組之間的預(yù)后差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),聚類5和2的預(yù)后最佳,而聚類7和6的預(yù)后最差(圖3)。然后,分別根據(jù)TMN 分期,Stage,Grade 和年齡、性別分析了7 個(gè)群集的群集內(nèi)比例(圖4)。相關(guān)臨床特征與不同組聚類間的關(guān)聯(lián)趨勢(shì)如下:聚類4、6 和7 具有較高的病理分期階段(Stage);T分期較低的集群為1、2和5;N 等級(jí)較高的集群為4 和6;性別總體以男性為主。本研究發(fā)現(xiàn),不同臨床特征在7 個(gè)群集中的所占比例各不相同,而且與集群的預(yù)后特征也相匹配(如聚類5的T分期較低而預(yù)后較好)。

    圖1 DNA甲基化分類的選擇標(biāo)準(zhǔn)和一致性矩陣

    圖2 以DNA 甲基化分級(jí)、TNM 分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)、性別和年齡為注釋的heatmap圖譜

    圖3 每個(gè)DNA甲基化亞型的生存曲線

    2.3 基因功能富集分析和基因組注釋 利用上述2 248個(gè)CpG位點(diǎn)的基因組注釋,共鑒定出2 438個(gè)相應(yīng)的啟動(dòng)子基因。然后對(duì)這2 438個(gè)基因進(jìn)行功能富集分析,結(jié)果表明:在生物途徑(biology process,BP),這些基因主要涉及ncRNA代謝過程、有絲分裂細(xì)胞周期相變的調(diào)控、細(xì)胞周期相變的調(diào)節(jié)、核糖核酸分解過程、信使核糖核酸分解過程。分子功能(molecular function,MF)主要參與催化活性,作用于RNA、核酸外切酶活性、單鏈DNA結(jié)合、核酸酶活性、催化活性,作用于tRNA。此外,細(xì)胞組成(cellular component,CC)主要涉及染色體區(qū)域、核斑點(diǎn)、染色體端粒的地區(qū)、濃縮的染色體和中心體(表1)。KEGG共發(fā)現(xiàn)24個(gè)相關(guān)的PATHWAYs(P<0.01),其中最集中且有意義的途徑是RNA 運(yùn)輸、細(xì)胞周期、p53 信號(hào)通路和剪接體等(圖5)。

    2.4 構(gòu)建和評(píng)估LIHC 預(yù)后預(yù)測(cè)模型 聚類5包含大量的樣本和最多的特異性甲基化位點(diǎn)(圖6),并且預(yù)后良好,因此選擇它作為種子聚類。多變量Cox 回歸用于構(gòu)建腫瘤預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型并發(fā)現(xiàn)8 個(gè)預(yù)后相關(guān)的甲基化位點(diǎn):cg05489143、cg09600437、cg19165652、cg19569208、cg22732432、cg22958262、cg24153171、cg25455598 (表 2),由它們構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型可用于預(yù)后評(píng)估。獲得的腫瘤預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型是:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=4.98*cg05489143-21.18*cg09600437+3.50*cg19165652+459*cg19569208+11.08*cg22732432+5.07*cg22958262-1.6.02*cg24153171 + 4.75*cg25455598。此外,根據(jù)上述模型計(jì)算的中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分截止值,共有204 例患者被分為高風(fēng)險(xiǎn)組(n=101)和低風(fēng)險(xiǎn)組(n=102),LIHC的高低風(fēng)險(xiǎn)與甲基化程度的關(guān)系如圖7,可以看到隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的增高,高風(fēng)險(xiǎn)組的生存時(shí)間雖然沒有明顯下降,但是死亡率明顯升高。基于高、低風(fēng)險(xiǎn)分組采用Kaplan-Meier 方法繪制生存曲線(圖8A),高低風(fēng)險(xiǎn)兩組的預(yù)后差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。同時(shí),ROC曲線的AUC值為0.822(圖8B),提示該模型可以很好地預(yù)測(cè)患者的存活率。

    圖4 DNA甲基化簇之間的年齡、性別、TNM分期、病理學(xué)分期和組織學(xué)分級(jí)占比

    圖5 對(duì)2 248個(gè)CpG位點(diǎn)的注釋基因進(jìn)行KEGG通路富集分析

    表1 異常CpG位點(diǎn)的注釋基因的GO功能富集

    圖6 每個(gè)DNA甲基化簇的特定的高/低甲基化CpG位點(diǎn)

    表2 多變量COX回歸得到的8個(gè)與OS顯著相關(guān)的CpG位點(diǎn)

    圖7 高低風(fēng)險(xiǎn)組的熱圖分析

    圖8 模型對(duì)臨床生存及預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

    3 討論

    近年來HCC的治療取得了較大的突破,但肝癌的累積復(fù)發(fā)率分別在3年、5年時(shí)仍高達(dá)50%~60%、70%~100%[11]。盡管索拉非尼是目前HCC 最有效的靶向藥物,也是唯一一種在晚期HCC使用的全身性靶向腫瘤治療藥物,但其療效非常有限[12]。在這個(gè)前提下,HCC 中出現(xiàn)的表觀遺傳改變可能會(huì)成為一種新的治療靶點(diǎn)[13]。DNA 甲基化作為表觀遺傳學(xué)中最重要和最常見的修飾,它是一種共價(jià)化學(xué)修飾,表現(xiàn)為胞嘧啶環(huán)的5位碳上加入甲基(CH3),這常見于5'CG3'這個(gè)基因序列中[14]。

    本文研究了LIHC患者癌癥樣本和癌旁樣本之間的異常甲基化位點(diǎn),首先通過單因素和多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析最終篩選出具有獨(dú)立預(yù)后能力的CpG 位點(diǎn),接著利用一致性聚類方法進(jìn)行腫瘤分型,最后根據(jù)分型差異分析構(gòu)建甲基化位點(diǎn)的預(yù)后模型。根據(jù)該模型計(jì)算可以看到隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的增高,高風(fēng)險(xiǎn)組的生存時(shí)間雖然沒有明顯下降,但是死亡率明顯升高。另外,高低風(fēng)險(xiǎn)兩組的預(yù)后具有顯著差異,同時(shí),ROC 曲線的AUC 值為 0.822,表明模型可以很好地預(yù)測(cè)患者的存活率。有研究表明HCC 腫瘤會(huì)表現(xiàn)出與危險(xiǎn)因素、腫瘤分期、分化程度和癌癥治療后存活相關(guān)的特異性DNA甲基化特征[15],并且大多數(shù)CpG 位點(diǎn)會(huì)傾向于從T1 期到T3 期逐漸高甲基化[16],本研究也發(fā)現(xiàn)臨床分期等臨床參數(shù)與集群的預(yù)后特征相匹配。近年來,已經(jīng)有很多關(guān)于基因甲基化對(duì)各種癌癥如肺癌[17],乳腺頸癌[18]和卵巢癌[19]診斷,治療和預(yù)后評(píng)估的實(shí)驗(yàn)及臨床研究。也有關(guān)于肝癌的相關(guān)研究,如CARM1介導(dǎo)的GAPDH甲基化是肝癌中葡萄糖代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制[20]。另外,有實(shí)驗(yàn)證明P14ARF mRNA 水平受原發(fā)性肝癌中的DNA 甲基化調(diào)節(jié),P14ARF基因DNA甲基化可能與HCC的發(fā)生及TNM分期有關(guān)[21]。與基因突變不同,表觀遺傳的改變具有可逆性,特別是DNA甲基化和組蛋白修飾[22]。通過使用去甲基化劑如5-氮雜胞苷(阿扎胞苷)和5-氮雜-2'-脫氧胞苷,可以實(shí)現(xiàn)DNA甲基化基因在癌細(xì)胞系中的重新表達(dá),臨床上在骨髓異常增生綜合征和急性髓性白血病中的應(yīng)用較常見和成熟[23-24]。因此,對(duì)基因甲基化的研究對(duì)未來肝癌的診療意義重大。

    近年來,使用綜合基因組工具的大規(guī)模基因組學(xué)和全基因組研究重塑了對(duì)癌癥進(jìn)化和異質(zhì)性的理解。例如,RAN TAO 等[25]通過 HBV 相關(guān) HCC 的全基因組甲基化譜發(fā)現(xiàn)7 個(gè)新基因(WNK2、EMILIN2、TLX3、TM6SF1、TRIM58、HIST1H4F 和 GRASP)在HCC 中高甲基化,在成對(duì)的相鄰肝組織中低甲基化。SHEN等[26]也發(fā)現(xiàn)在HCC組織中有684個(gè)CpG位點(diǎn)顯著高甲基化,這些基因中的5 個(gè)(CDKL2、CDKN2A、HIST1H3G、STEAP4、ZNF154)在高達(dá)63%的患者血漿中具有可檢測(cè)的高甲基化DNA。鑒定的甲基化基因組可以是用于早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。但是以上這些研究只是從單個(gè)基因或多個(gè)基因的DNA 甲基化程度監(jiān)測(cè)去評(píng)估在肝癌中的價(jià)值,肝癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,所以聯(lián)合基因表達(dá)和DNA甲基化位點(diǎn)進(jìn)行綜合分析,并通過甲基化位點(diǎn)構(gòu)建出了肝細(xì)胞癌的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型,把評(píng)估進(jìn)行了量化分析,通過這個(gè)模型可以比較準(zhǔn)確肝癌患者的生存情況,臨床實(shí)用性更強(qiáng)。

    綜上,本研究在癌組織和癌旁組織中成功篩選出2 248個(gè)差異甲基化位點(diǎn),DNA甲基化水平的差異與T分期、N 分期、M 分期、年齡、Stage、Grade 和預(yù)后的差異相關(guān)。接著利用一致性聚類方法得到7 個(gè)腫瘤亞組,亞組之間的預(yù)后有顯著差異,同時(shí)對(duì)差異甲基化位點(diǎn)相應(yīng)的啟動(dòng)子基因進(jìn)行功能富集分析,它們主要涉及RNA運(yùn)輸、細(xì)胞周期、p53信號(hào)通路和剪接體,為肝癌發(fā)生機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。最后根據(jù)分型差異分析構(gòu)建甲基化位點(diǎn)的預(yù)后模型,該模型可以很好地預(yù)測(cè)患者的存活率。

    猜你喜歡
    甲基化基因組位點(diǎn)
    鎳基單晶高溫合金多組元置換的第一性原理研究
    上海金屬(2021年6期)2021-12-02 10:47:20
    牛參考基因組中發(fā)現(xiàn)被忽視基因
    CLOCK基因rs4580704多態(tài)性位點(diǎn)與2型糖尿病和睡眠質(zhì)量的相關(guān)性
    二項(xiàng)式通項(xiàng)公式在遺傳學(xué)計(jì)算中的運(yùn)用*
    鼻咽癌組織中SYK基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化分析
    胃癌DNA甲基化研究進(jìn)展
    基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
    有趣的植物基因組
    全甲基化沒食子兒茶素沒食子酸酯的制備
    含內(nèi)含子的核糖體蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)情況分析
    国产一区二区在线观看日韩| 男女国产视频网站| 老司机影院成人| 特大巨黑吊av在线直播| 午夜福利,免费看| 色网站视频免费| 99热国产这里只有精品6| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品人妻熟女av久视频| 久久久欧美国产精品| 制服丝袜香蕉在线| 九色成人免费人妻av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品人妻一区二区三区麻豆| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 成人特级av手机在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 在线观看av片永久免费下载| 看免费成人av毛片| av在线播放精品| 一区二区三区四区激情视频| 婷婷色综合www| 狂野欧美激情性bbbbbb| 99热全是精品| 午夜免费鲁丝| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美国产精品一级二级三级 | 一级毛片电影观看| 国产男人的电影天堂91| 亚洲国产欧美在线一区| 少妇人妻久久综合中文| 久久av网站| 熟女人妻精品中文字幕| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲国产精品一区三区| 精品少妇内射三级| 美女视频免费永久观看网站| 男女无遮挡免费网站观看| av福利片在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| av免费观看日本| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产男女内射视频| 国模一区二区三区四区视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产黄色视频一区二区在线观看| 51国产日韩欧美| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品一区www在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 狂野欧美激情性bbbbbb| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 三级经典国产精品| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲国产精品一区三区| 久久久国产一区二区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 我要看黄色一级片免费的| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 少妇的逼水好多| 国产精品.久久久| 亚洲国产精品999| a级片在线免费高清观看视频| 五月开心婷婷网| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲精品456在线播放app| 麻豆成人av视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 日本午夜av视频| 777米奇影视久久| 亚洲欧洲日产国产| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 成人无遮挡网站| 桃花免费在线播放| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲av二区三区四区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 十分钟在线观看高清视频www | 国产淫片久久久久久久久| 晚上一个人看的免费电影| 天堂俺去俺来也www色官网| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩成人伦理影院| 日韩人妻高清精品专区| 精品久久久久久电影网| 色视频在线一区二区三区| 18禁在线播放成人免费| 日日爽夜夜爽网站| av不卡在线播放| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜视频国产福利| 伦理电影大哥的女人| 亚洲欧美精品自产自拍| 少妇人妻一区二区三区视频| 九色成人免费人妻av| 美女内射精品一级片tv| 亚洲精品久久午夜乱码| 观看av在线不卡| 丰满人妻一区二区三区视频av| 欧美国产精品一级二级三级 | 久久久精品免费免费高清| 国产高清不卡午夜福利| 26uuu在线亚洲综合色| 免费av中文字幕在线| 美女福利国产在线| 女性被躁到高潮视频| 韩国av在线不卡| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 精品熟女少妇av免费看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 在线 av 中文字幕| 少妇熟女欧美另类| 最后的刺客免费高清国语| 久久久午夜欧美精品| 亚洲美女视频黄频| 嫩草影院新地址| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲三级黄色毛片| www.av在线官网国产| 久久免费观看电影| 99热国产这里只有精品6| 五月玫瑰六月丁香| 观看美女的网站| 日韩亚洲欧美综合| 香蕉精品网在线| 人妻 亚洲 视频| 欧美日韩综合久久久久久| 七月丁香在线播放| 国内精品宾馆在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 岛国毛片在线播放| 街头女战士在线观看网站| 国产亚洲最大av| 黄色毛片三级朝国网站 | 最近2019中文字幕mv第一页| 日韩一区二区视频免费看| 久久久久久久久久人人人人人人| 欧美日韩视频精品一区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产日韩欧美视频二区| 欧美高清成人免费视频www| 人体艺术视频欧美日本| 日日撸夜夜添| 婷婷色综合www| 国产精品欧美亚洲77777| 秋霞在线观看毛片| 免费看不卡的av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美日韩视频精品一区| 一区二区三区四区激情视频| 特大巨黑吊av在线直播| 久久鲁丝午夜福利片| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产亚洲91精品色在线| 一区二区三区免费毛片| 欧美日韩亚洲高清精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 两个人的视频大全免费| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 免费黄色在线免费观看| 午夜影院在线不卡| 免费av不卡在线播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 狂野欧美激情性bbbbbb| 成年女人在线观看亚洲视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲怡红院男人天堂| av国产精品久久久久影院| 51国产日韩欧美| 久热这里只有精品99| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 美女国产视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日本91视频免费播放| 最近中文字幕2019免费版| 中文欧美无线码| 欧美少妇被猛烈插入视频| 日韩亚洲欧美综合| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲精品一二三| 中文天堂在线官网| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 成人黄色视频免费在线看| 天堂8中文在线网| 99热6这里只有精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 91久久精品电影网| 欧美日韩在线观看h| 亚洲经典国产精华液单| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 少妇人妻精品综合一区二区| tube8黄色片| 成人美女网站在线观看视频| 国产精品女同一区二区软件| 精品国产乱码久久久久久小说| √禁漫天堂资源中文www| 美女内射精品一级片tv| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产视频首页在线观看| 久久久久精品性色| 午夜免费观看性视频| 久久久久久久久久久久大奶| av又黄又爽大尺度在线免费看| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品一区二区三卡| 男女免费视频国产| 日日啪夜夜撸| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久精品久久久久久久性| av视频免费观看在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 有码 亚洲区| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩视频在线欧美| 大陆偷拍与自拍| 亚洲av福利一区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 成人二区视频| 男女无遮挡免费网站观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一区在线观看完整版| 亚洲内射少妇av| 嫩草影院新地址| 国产精品熟女久久久久浪| 丁香六月天网| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 大香蕉97超碰在线| 日日啪夜夜爽| 内射极品少妇av片p| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜激情久久久久久久| av女优亚洲男人天堂| 亚洲三级黄色毛片| 在线观看av片永久免费下载| 国产高清国产精品国产三级| 最近的中文字幕免费完整| 国产午夜精品一二区理论片| 国产亚洲5aaaaa淫片| 成人漫画全彩无遮挡| 丰满饥渴人妻一区二区三| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 一区二区三区四区激情视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 人妻 亚洲 视频| 人人妻人人澡人人看| 2021少妇久久久久久久久久久| 午夜免费男女啪啪视频观看| 欧美bdsm另类| 午夜91福利影院| 成年女人在线观看亚洲视频| 我的老师免费观看完整版| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一级黄片播放器| 看十八女毛片水多多多| 亚洲国产欧美在线一区| 一级黄片播放器| 岛国毛片在线播放| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产乱来视频区| 少妇精品久久久久久久| 国产熟女欧美一区二区| 777米奇影视久久| 在线 av 中文字幕| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 中文字幕人妻丝袜制服| 大片电影免费在线观看免费| 欧美精品亚洲一区二区| 久久婷婷青草| 只有这里有精品99| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 一边亲一边摸免费视频| 久久99热6这里只有精品| 三级经典国产精品| 黄色毛片三级朝国网站 | 一级毛片电影观看| 99久久精品一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 精华霜和精华液先用哪个| 免费在线观看成人毛片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 精品一区二区三区视频在线| 我的老师免费观看完整版| 性色avwww在线观看| 99国产精品免费福利视频| 日韩强制内射视频| 赤兔流量卡办理| 七月丁香在线播放| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| av福利片在线| 在线观看www视频免费| 日韩一本色道免费dvd| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美区成人在线视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美人与善性xxx| 国产精品一区二区在线不卡| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久精品久久精品一区二区三区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| av天堂中文字幕网| 国产精品人妻久久久影院| 五月天丁香电影| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区 | 国产 精品1| 国产又色又爽无遮挡免| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 一级毛片我不卡| a级一级毛片免费在线观看| av播播在线观看一区| 黄色毛片三级朝国网站 | 高清av免费在线| 性色av一级| av福利片在线观看| 大片免费播放器 马上看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久韩国三级中文字幕| 女性生殖器流出的白浆| 精品卡一卡二卡四卡免费| 少妇高潮的动态图| 大片免费播放器 马上看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日韩成人伦理影院| 噜噜噜噜噜久久久久久91| av视频免费观看在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 日韩电影二区| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲丝袜综合中文字幕| 免费av中文字幕在线| 久久这里有精品视频免费| 国产男人的电影天堂91| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产成人精品无人区| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲第一区二区三区不卡| 春色校园在线视频观看| 高清黄色对白视频在线免费看 | 欧美精品一区二区免费开放| 香蕉精品网在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产在线一区二区三区精| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 99久久人妻综合| 精品久久久久久电影网| av在线老鸭窝| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一个人免费看片子| 久久久国产一区二区| 精品久久久噜噜| 久久人人爽人人爽人人片va| h视频一区二区三区| 亚洲内射少妇av| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲国产日韩一区二区| 国产精品久久久久久av不卡| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 永久网站在线| 乱系列少妇在线播放| 久久热精品热| 国产美女午夜福利| 久久久午夜欧美精品| 天堂俺去俺来也www色官网| av播播在线观看一区| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 最近2019中文字幕mv第一页| 日本与韩国留学比较| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久精品国产自在天天线| 亚洲人成网站在线播| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 极品少妇高潮喷水抽搐| 黑人高潮一二区| 男女无遮挡免费网站观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲欧美成人精品一区二区| 校园人妻丝袜中文字幕| av福利片在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲成色77777| 亚洲va在线va天堂va国产| h日本视频在线播放| 成人漫画全彩无遮挡| 老女人水多毛片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 国产色婷婷99| 国产精品无大码| 成年人午夜在线观看视频| 欧美+日韩+精品| 国产男女内射视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 欧美日韩国产mv在线观看视频| 人妻一区二区av| 亚洲怡红院男人天堂| 日韩一区二区三区影片| 国产男女超爽视频在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 在线观看一区二区三区激情| 免费观看a级毛片全部| 最近2019中文字幕mv第一页| 九九在线视频观看精品| 久久青草综合色| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久久久久伊人网av| 久热久热在线精品观看| 日韩免费高清中文字幕av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产成人免费无遮挡视频| 久久鲁丝午夜福利片| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲美女视频黄频| 久久久久久久国产电影| 免费观看a级毛片全部| 午夜老司机福利剧场| h视频一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www | 亚洲不卡免费看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 一级黄片播放器| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲国产精品成人久久小说| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久韩国三级中文字幕| 伦精品一区二区三区| 男女边吃奶边做爰视频| 国产高清三级在线| 精品国产一区二区久久| 亚洲成人一二三区av| 国产精品成人在线| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美三级亚洲精品| 亚洲欧美清纯卡通| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲av成人精品一区久久| 伦理电影免费视频| 岛国毛片在线播放| 在线 av 中文字幕| 欧美精品一区二区免费开放| 国产日韩欧美亚洲二区| av一本久久久久| 精品少妇黑人巨大在线播放| 人妻人人澡人人爽人人| 这个男人来自地球电影免费观看 | av福利片在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产一区二区三区av在线| av黄色大香蕉| 国国产精品蜜臀av免费| 精品酒店卫生间| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲av中文av极速乱| 久久久久久久国产电影| 久久久国产一区二区| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲va在线va天堂va国产| 日韩人妻高清精品专区| 特大巨黑吊av在线直播| xxx大片免费视频| 亚洲精品一二三| 久久 成人 亚洲| 三级国产精品欧美在线观看| 国产一级毛片在线| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美高清成人免费视频www| 在线观看免费高清a一片| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲成人一二三区av| 日韩大片免费观看网站| 国产伦理片在线播放av一区| 性色avwww在线观看| 亚洲精品自拍成人| 丝瓜视频免费看黄片| 九色成人免费人妻av| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国内精品宾馆在线| 欧美日韩视频精品一区| 国产日韩欧美在线精品| 天美传媒精品一区二区| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲国产精品专区欧美| 日韩在线高清观看一区二区三区| 午夜91福利影院| 国产黄色免费在线视频| 十八禁高潮呻吟视频 | 女性生殖器流出的白浆| 欧美日韩av久久| 日韩伦理黄色片| 美女中出高潮动态图| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 另类精品久久| xxx大片免费视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国内精品宾馆在线| 一区在线观看完整版| 国产色婷婷99| 日日摸夜夜添夜夜爱| 我的老师免费观看完整版| 91精品国产九色| 国产成人精品婷婷| 国产在线免费精品| 简卡轻食公司| 99热国产这里只有精品6| 日日啪夜夜爽| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 男女无遮挡免费网站观看| 国产男女内射视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久青草综合色| 五月开心婷婷网| 一级毛片我不卡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 最近的中文字幕免费完整| 2022亚洲国产成人精品| 久久久久久久久大av| av线在线观看网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲欧洲日产国产| 国产高清三级在线| 国产亚洲91精品色在线| 久热这里只有精品99| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲国产日韩一区二区| 美女内射精品一级片tv| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩亚洲欧美综合| 日韩人妻高清精品专区| 韩国高清视频一区二区三区| 久久久午夜欧美精品| 韩国高清视频一区二区三区| 精品久久久久久久久亚洲| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 美女中出高潮动态图| 国产高清国产精品国产三级| 不卡视频在线观看欧美| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日本与韩国留学比较| 亚洲人成网站在线播| 丰满人妻一区二区三区视频av| 免费人成在线观看视频色| av一本久久久久| 国产成人freesex在线| 好男人视频免费观看在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产精品99久久99久久久不卡 | 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲成色77777| 建设人人有责人人尽责人人享有的| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产在线免费精品| 少妇熟女欧美另类| 国产精品人妻久久久影院| 精品酒店卫生间| 一级黄片播放器| 大码成人一级视频| 久久久国产精品麻豆| 三级国产精品片| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久女婷五月综合色啪小说| 免费看av在线观看网站| 一级a做视频免费观看| 欧美日韩综合久久久久久| 国产一级毛片在线| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产精品久久久久久久电影| 中文字幕制服av| 中国国产av一级| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲国产精品国产精品| 日本av手机在线免费观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久久a久久爽久久v久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 精品一品国产午夜福利视频|