香草乙酮在細(xì)胞水平對(duì)NOX-ROS-P38信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響

元榮榮,張 宇,魏丹丹,林旭紅

1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院 內(nèi)分泌科,河南 開(kāi)封475000；2.河南大學(xué)淮河醫(yī)院腎內(nèi)科,河南 開(kāi)封475000；3.河南大學(xué)淮河醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南 開(kāi)封475000

近年來(lái),潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),流行病學(xué)統(tǒng)計(jì),我國(guó)UC的患病率約為0.02‰[1-2]。目前,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)及活性氮在UC產(chǎn)生的病理生理機(jī)制中日益受到重視[3]。ROS可以激活絲裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的ERK、JNK和P38 MAPK[4]。而在腸上皮細(xì)胞系中,溶組織阿米巴能激活NOX2,增加氧自由基的生成,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此,NOX2能增加氧自由基的生成,而氧自由基能激活或抑制P38 MAPK。但是對(duì)NOX2-ROS-P38-PGE2/NO信號(hào)通路在潰瘍性結(jié)腸炎中作用的認(rèn)識(shí)并不十分清楚,本實(shí)驗(yàn)探討香草乙酮對(duì)NOX-ROS-P38信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 在細(xì)胞系THP-1(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù))中過(guò)表達(dá)NOX2，觀察ROS及p-P38表達(dá)

構(gòu)建pc DNA3.1-NOX2表達(dá)質(zhì)粒,應(yīng)用lipo 2 000 invitrogen轉(zhuǎn)染細(xì)胞,一般待細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,首先配制含0.8μg DNA的50μL Opti-mem無(wú)血清培養(yǎng)基及含2μL lipo 2 000的50 μL Opti-mem無(wú)血清培養(yǎng)基,混勻、室溫放置5 min,然后將二者混合,放置20 min,轉(zhuǎn)染期間,將24孔板培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基,每孔400μL,將混合液加入對(duì)應(yīng)孔中,4～6 h后換成有血清培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組于次日更換成含有香草乙酮的培養(yǎng)液,對(duì)照組于次日更換成無(wú)香草乙酮的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,應(yīng)用細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧(ROS)魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司)檢測(cè)ROS,并用Real time PCR檢測(cè)p-P38基因的表達(dá)。

1.2 RNAi技術(shù)敲除細(xì)胞NOX2基因，觀察ROS及p-P38表達(dá)

Invitrogen公司合成用于沉默NOX2的si-NOX2RNA dimer及作為對(duì)照的si-Scrambled RNA dimer,用細(xì)胞核電穿孔儀(Lonza Company)轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞,并與次日更換成含有香草乙酮的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧(ROS)魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ROS,并用Real time PCR檢測(cè)p-P38基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染GFP孔檢測(cè)基因敲除效率。

1.3 SOD阻斷ROS在細(xì)胞系THP-1中生成及低氧刺激ROS生成，應(yīng)用Real time PCR檢測(cè)p-P38及NOX2

實(shí)驗(yàn)分組,對(duì)照組不干預(yù)ROS,阻斷ROS組和刺激ROS組。

1.3.1 SOD阻斷ROS生成

將N-乙酰半胱氨酸(NAC)加入細(xì)胞培養(yǎng)液中,做MTT實(shí)驗(yàn)確定最佳NAC濃度,孵育1～2 h,利用DHE染色觀察ROS被抑制情況。

1.3.2 低氧刺激ROS生成

將細(xì)胞置于低氧條件的儀器中(美國(guó)Biospherix低氧箱),其中1%O2、94%N2、5%CO2,對(duì)照組細(xì)胞處于21%O2、74%N2、5%CO2的條件下,應(yīng)用DHE染色觀察ROS生成。

1.3.3 Real time PCR檢測(cè)p-P38及NOX2基因表達(dá)

從細(xì)胞中提取總RNA,用分光光度法測(cè)定所提取RNA的濃度,并用RNA電泳檢測(cè)其完整性,然后進(jìn)行m RNA反轉(zhuǎn)錄,最后PCR檢測(cè)：采用premier 5.0設(shè)計(jì)p-P38和NOX2基因引物序列,將每個(gè)cDNA樣品2μL 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,每個(gè)標(biāo)本做復(fù)孔檢測(cè)。熱循環(huán)參數(shù)如下：95℃30 s 為第一階段,一個(gè)循環(huán)；95℃5 s,60℃31 s為第二階段,40個(gè)循環(huán)。用ABI 7500系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、分析。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以x-±s表示。使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,采用單因素方差分析的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,方差分析后的兩兩比較采用S-N-K檢驗(yàn),P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 在細(xì)胞系THP-1中過(guò)表達(dá)NOX2，ROS及p-P38表達(dá)

在細(xì)胞系THP-1中過(guò)表達(dá)NOX2,經(jīng)香草乙酮培養(yǎng)后,ROS的表達(dá)下降,與對(duì)照組相比有顯著差異,P＜0.01；經(jīng)香草乙酮培養(yǎng)后,p-P38的表達(dá)下降,與對(duì)照組相比有顯著差異,P＜0.05。

3.2 敲除細(xì)胞NOX2基因，ROS及p-P38表達(dá)

不敲除NOX2基因,經(jīng)香草乙酮培養(yǎng)后ROS和p-P38表達(dá)減少,與敲除組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01,P＜0.05。

3.3 阻斷和刺激ROS，NOX2及p-P38表達(dá)

阻斷ROS后,3組NOX2的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＞0.05。低氧刺激ROS后p-P38表達(dá)較對(duì)照組顯著增加,與對(duì)照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＜0.01；SOD阻斷ROS后p-P38表達(dá)較對(duì)照組顯著減少,與對(duì)照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＜0.01。

4 討論

研究[3-4]發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激引起的機(jī)體免疫功能紊亂可能在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制中有重要作用,ROS是氧化應(yīng)激反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。我們研究發(fā)現(xiàn),香草乙酮治療潰瘍性結(jié)腸炎小鼠后NOX2活性及ROS生成被抑制,P38 MAPK磷酸化水平降低。因此推測(cè)NOX-ROS-P38信號(hào)通路在香草乙酮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的分子機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)在THP-1細(xì)胞系中研究香草乙酮對(duì)NOX-ROS-P38信號(hào)通路的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在THP-1細(xì)胞系中阻斷ROS的生成,p-P38表達(dá)明顯減少(P＜0.01),刺激ROS后,p-P38的表達(dá)明顯增加(P＜0.01),但NOX2的表達(dá)均不受影響,說(shuō)明P38在ROS的下游,NOX在ROS的上游。

在過(guò)表達(dá)NOX2時(shí),應(yīng)用香草乙酮培養(yǎng)細(xì)胞后,ROS和p-P38的表達(dá)均減少(P＜0.01,P＜0.05)。經(jīng)香草乙酮培養(yǎng)后,NOX2基因不敲除組的ROS及p-P38的表達(dá)較基因敲除組的減少(P＜0.01,P＜0.05)。研究[5-7]發(fā)現(xiàn),在中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中,香草乙酮通過(guò)阻斷NADPH氧化酶的活性而抑制氧自由基的生成。因此推測(cè)香草乙酮可能通過(guò)抑制NOX2的活性或抑制NOX2促進(jìn)ROS的生成過(guò)程來(lái)抑制ROS的生成,進(jìn)而抑制p38 MAPK磷酸化,但其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。