外泌體在非腫瘤性肝臟疾病中的研究進(jìn)展

徐 帥， 張立平

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 消化科， 北京 100078； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)， 北京 100029

外泌體產(chǎn)生于細(xì)胞中的多泡體，攜帶多種參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等，可通過細(xì)胞膜受體直接激活受體細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞間信息交流和調(diào)節(jié)細(xì)胞微環(huán)境，參與細(xì)胞生長、增殖，腫瘤發(fā)生和侵襲，抗病毒感染和細(xì)胞再生等病理生理過程。越來越多的研究表明，外泌體在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。本文就外泌體與非腫瘤性肝臟疾病診療相關(guān)的最新研究進(jìn)行綜述，以期為臨床診治提供新的思路。

1 外泌體的基本特性

外泌體是細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡之一，1983年首次由Pan和Johnstone發(fā)現(xiàn)于成熟的哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞中[1]。外泌體為脂質(zhì)雙分子層架構(gòu)，直徑為30～100 nm，密度為1.1～1.2 g/ml，電鏡下呈杯狀或球形，其大小、形狀和密度等受特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、酶和礦物質(zhì)含量的影響，且在不同的囊泡之間存在較大差異[2]。外泌體主要來源于細(xì)胞內(nèi)多囊泡體(multivesicular bodies，MVBs)，MVBs可以通過與溶酶體融合或與細(xì)胞膜融合而降解，其內(nèi)容物被分泌出細(xì)胞膜[3]。外泌體可存在于人體多種體液中，如血液、尿液、唾液、羊水、母乳、胸水、腹水、膽汁等，大多數(shù)細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等都可以產(chǎn)生并釋放外泌體。

外泌體富含各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和RNA，參與人體多種生命活動[4]。最常見的蛋白質(zhì)是四聚體蛋白(CD9、CD82、 CD81、CD63)，其中CD63和CD81是最為常用的特異性標(biāo)志物。還富含與膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合相關(guān)的蛋白(如GTPases)，MVB合成相關(guān)蛋白(如Alix、TSG101)，熱休克蛋白(如HSC70、HSC90)等[5]。最外層為附著于表面蛋白和某些外小葉脂質(zhì)的糖基冠層，糖基冠層下面的外泌體膜含有膽固醇、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、糖磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酸等脂質(zhì)[6]。外泌體中的核酸包括mRNA、microRNA(miRNA)、長鏈非編碼 RNA等，近年來，單鏈DNA和線粒體DNA也被證實存在于外泌體中[7]。

外泌體常用的提取方法有超速離心技術(shù)、尺寸排阻色譜法、超濾分離法、免疫親和捕獲方法、聚合物沉淀、微流體芯片分離技術(shù)[8]，由于每項技術(shù)都具有明顯的優(yōu)缺點，目前仍沒有一種方法能作為金標(biāo)準(zhǔn)。近年來，研究者[9]開發(fā)出針對不同樣本的商用外泌體提取試劑盒，能夠避免復(fù)雜的操作步驟和取得更高的純度和回收率。外泌體的具體功能與其所來源的細(xì)胞類型有關(guān)。在早期，人們認(rèn)為外泌體主要起著處理細(xì)胞垃圾的作用，20世紀(jì)末才發(fā)現(xiàn)外泌體具有免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞間通訊的作用。他們參與免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、炎癥、凝血、泌乳和維持神經(jīng)功能等正常生理過程，同時還在肝臟疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥以及移植物排斥反應(yīng)等過程中發(fā)揮作用[10]。同時由于外泌體具有較小的分子結(jié)構(gòu)、天然的分子轉(zhuǎn)運(yùn)特性和良好的生物相容性，作為藥物遞送載體具有廣闊應(yīng)用空間[11]。

2 外泌體與肝臟疾病的相關(guān)性

2.1 外泌體與病毒性肝炎 病毒性肝炎是嚴(yán)重影響人類健康的公共衛(wèi)生問題，主要以HBV和HCV感染為主。慢性病毒性肝炎反復(fù)遷延，可導(dǎo)致肝纖維化，并逐步進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。外泌體可通過轉(zhuǎn)運(yùn)病毒相關(guān)分子促進(jìn)細(xì)胞間的病毒感染，亦可通過細(xì)胞間的通信作用參與病毒感染后的免疫調(diào)控和抗病毒過程。

研究[12]表明HBV通過外泌體進(jìn)入自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)，抑制視黃酸誘導(dǎo)基因I的表達(dá)，并使NF-κB和p38信號通路失活而誘導(dǎo)NK細(xì)胞功能障礙。HBV感染肝細(xì)胞后，外泌體中免疫調(diào)節(jié)的miRNA水平升高，同時他們被轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞中，繼而抑制巨噬細(xì)胞中IL-12p35 mRNA的表達(dá)，抵抗宿主的先天免疫應(yīng)答[13]。干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(interferon-induced transmembrane protein 2，IFITM2)是HBV宿主抗病毒治療的負(fù)調(diào)控因子，其作用于I型干擾素信號的上游，外泌體介導(dǎo)IFITM2從肝細(xì)胞到樹突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)了IFITM2對內(nèi)源性干擾素α合成的抑制作用，從而阻斷了外源性干擾素α的抗HBV作用[14]。

Karamichali等[15]發(fā)現(xiàn)外泌體能夠通過介導(dǎo)框內(nèi)缺失突變體的轉(zhuǎn)移來調(diào)節(jié)HCV病毒復(fù)制并使病毒持續(xù)感染。HCV外泌體攜帶的miR-19a可以靶向肝星狀細(xì)胞(HSC)中細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)3的抑制因子，導(dǎo)致信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3介導(dǎo)的TGFβ信號傳導(dǎo)激活，使促纖維化標(biāo)志物高表達(dá)以及增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)HCV包膜糖蛋白E2可通過外泌體途徑釋放到細(xì)胞外且該過程受到syntenin蛋白的調(diào)控，E2包被的外泌體能夠幫助病毒逃逸抗體的中和。這些結(jié)果表明外泌體在病毒性肝炎的病毒傳播中起著重要作用，并且破壞宿主的先天免疫反應(yīng)，使病毒持續(xù)感染，因此外泌體可作為病毒性肝炎潛在的分子標(biāo)志物和治療手段。

2.2 外泌體與酒精性、非酒精性脂肪性肝病 肝臟是人體代謝的重要器官，在脂肪的消化、吸收、氧化、分解、合成和運(yùn)輸中起著關(guān)鍵作用。在酒精性肝病(ALD)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的肝損傷進(jìn)展過程中，炎癥、血管生成失調(diào)和纖維化是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，且相互之間密切相關(guān)。

研究[18]顯示ALD小鼠循環(huán)外泌體數(shù)量增加，接受ALD誘導(dǎo)外泌體的小鼠TNF、IL和單核細(xì)胞增多，而CD206、CD163比例下降，同時能夠激活HSP90從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化。實驗[19-20]表明，對miR-155基因敲除小鼠進(jìn)行酒精誘導(dǎo)，其肝臟脂肪變性、血漿ALT水平、氧化應(yīng)激反應(yīng)、自噬相關(guān)通路和蛋白明顯低于對照組小鼠，人體肝活檢亦表明ALD患者肝組織中miR-155的表達(dá)顯著增加。

NAFLD被認(rèn)為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，脂毒性在其發(fā)展中具有重要作用，脂肪沉積是主要的病理特征。研究[21]發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)實驗?zāi)Ｐ椭?，從受損/應(yīng)激肝細(xì)胞中釋放的肝細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡通過激活肝內(nèi)皮細(xì)胞、HSC、肝巨噬細(xì)胞等促進(jìn)肝臟疾病的進(jìn)展。巨噬細(xì)胞的M1促炎表型是NAFLD進(jìn)展中的重要過程，研究[22]發(fā)現(xiàn)NAFLD患者的血清miR-192-5p水平與肝炎性活動評分和疾病進(jìn)展呈正相關(guān)；NAFLD大鼠模型中，脂毒性肝細(xì)胞釋放出比對照組更多的富含miR-192-5p的外泌體，誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞(CD11b+/CD86+)活化并增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、IL-6和TNFα的表達(dá)，誘導(dǎo)脂肪變性的肝臟發(fā)生炎癥損傷。

2.3 外泌體與肝纖維化 肝纖維化是由很多因素引起的慢性肝損傷的傷口愈合反應(yīng)，HSC活化是導(dǎo)致肝纖維化的主要原因。研究[23]發(fā)現(xiàn)有氧糖酵解對于將靜息HSC重編程為活化的HSC至關(guān)重要，來自缺氧誘導(dǎo)因子1介導(dǎo)的活性HSC分泌外泌體，傳遞特異性糖酵解相關(guān)蛋白GLUT1和PKM2，它們在活化HSC的衍生外泌體中表達(dá)增加，并誘導(dǎo)靜止的HSC產(chǎn)生Warburg效應(yīng)。外泌體釋放被阻斷時，HSC的激活和糖酵解被抑制，提示外泌體可能通過調(diào)節(jié)糖酵解影響肝臟非實質(zhì)細(xì)胞之間的代謝轉(zhuǎn)換。對自噬與肝纖維化的研究[24]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激升高的TRIB3與SQSTM1相互作用，干擾SQSTM1在肝實質(zhì)細(xì)胞中的功能并激活HSC而促進(jìn)肝纖維化，因此靶向TRIB3-SQSTM1相互作用也為治療纖維增生性肝病提供了新思路。外泌體RNA在HSC活化過程中也發(fā)揮重要作用。研究[25]發(fā)現(xiàn)含miR-192的外泌體數(shù)量通過HCV復(fù)制而增加，它們從病毒復(fù)制的肝細(xì)胞中釋放出來，然后被傳遞到HSC中，激活和誘導(dǎo)細(xì)胞分化，同時促進(jìn)人原發(fā)性肝干細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。肝細(xì)胞外泌體MALAT1通過miR-26b參與亞砷酸鹽誘導(dǎo)的纖維化過程中HSC的活化[26]。肝纖維化還受到結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CCN2)的控制，體內(nèi)研究[27]表明，來源于原代小鼠活化 HSC的外泌體中CCN2 增加，利用從活化 HSC中分離的外泌體孵育靜態(tài) HSC，可促進(jìn)CCN2 和α平滑肌肌動蛋白的高表達(dá)。另有體外實驗[28]表明，膽管細(xì)胞來源的外泌體H19通過促進(jìn)HSC活化和增殖，在膽汁淤積性肝纖維化進(jìn)展中發(fā)揮作用，無論是小鼠膽汁淤積性肝損傷模型，還是原發(fā)性硬化性膽管炎和原發(fā)性膽汁性膽管炎患者，血清外泌體H19水平與肝纖維化嚴(yán)重程度相關(guān)。

2.4 外泌體與肝損傷 肝損傷可由多種理化及生物因素導(dǎo)致，可出現(xiàn)多種肝臟疾病的臨床表現(xiàn)，個體之間發(fā)病時間差異較大。由于我國人口基數(shù)龐大，各地醫(yī)療水平發(fā)展不均，部分地區(qū)存在用藥不當(dāng)以及人們對藥物安全性問題的認(rèn)知不夠，藥物性肝損傷(DILI)發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，嚴(yán)重者可導(dǎo)致急性肝衰竭。因此對肝損傷進(jìn)行早期診斷、控制病情進(jìn)展、減少肝衰竭發(fā)生是至關(guān)重要的。

研究[29]發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞釋放的脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的外泌體通過調(diào)節(jié)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小體通路的激活參與膿毒癥導(dǎo)致的急性肝損傷過程，與正常對照組相比，注射LPS外泌體的小鼠ALT、AST和乳酸脫氫酶水平升高，肝臟有大范圍的炎癥細(xì)胞浸潤。在對乙酰氨基酚(APAP)所致肝損傷小鼠的研究[30]中發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠外泌體肝特異性蛋白精氨酸酶-1水平高于對照組，且APAP衍生的外泌體提高了與細(xì)胞毒性相關(guān)的mRNA轉(zhuǎn)錄的表達(dá)，激活激酶介導(dǎo)的原代肝細(xì)胞和各種肝癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡信號，導(dǎo)致肝細(xì)胞增殖減少。另一項關(guān)于APAP誘導(dǎo)肝損傷的研究[31]表明，外泌體miR-122a-5p、miR-192-5p、miR-193a-3p和miR-194-5p的表達(dá)水平在肝組織中顯著下調(diào)，而在血清中同時上調(diào)，這可能是由于肝損傷導(dǎo)致miRNA釋放到循環(huán)中，同時miRNA-193a-3p在給藥后12 h即顯著升高。在氯吡格雷處理的HepG2細(xì)胞中分別觀察到miR-26a-5p的上調(diào)和miR-15b-5p的下調(diào)及其靶mRNAs表達(dá)異常，且該變化與血清AST、ALT變化沒有相關(guān)性[32]。由此可見外泌體miRNA表達(dá)的變化或許可作為藥物性肝損傷的早期標(biāo)志物。

3 外泌體作為肝臟疾病診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)志物作用

對于肝臟疾病的診斷，早期以血液標(biāo)志物檢測和影像學(xué)檢查等方法為主，雖具較高診療價值，但相對缺乏敏感性和特異性。肝活檢作為一種侵入性檢查手段具有一定局限性。尋找針對肝臟疾病早期、無創(chuàng)的診療方法具有重要意義。外泌體存在于多種體液中，含有反映細(xì)胞功能和條件的各種特定類型的蛋白質(zhì)、核酸等，可作為包括急性和慢性肝病在內(nèi)的多種疾病的潛在生物標(biāo)志物，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種miRNA與肝臟疾病有關(guān)。

miR-122是目前研究最充分的肝臟特異性miRNA，參與多種肝臟生理病理過程。有報道[33]內(nèi)源性miR-122的下調(diào)可增強(qiáng)HBV復(fù)制，而miR-122上調(diào)則導(dǎo)致HBV抑制。此外，循環(huán)miR-122在慢性乙型肝炎患者中被發(fā)現(xiàn)與ALT和HBV DNA水平呈正相關(guān)，這意味著循環(huán)miR-122水平有可能反映肝損傷和病毒感染的程度，并可能進(jìn)一步影響抗病毒治療的預(yù)后。通過測定血清miR-122水平的動態(tài)變化表明miR-122在第12和24周的變化可能成為核苷(酸)類藥物治療慢性乙型肝炎患者病毒應(yīng)答的獨立預(yù)測因子。另有研究[34]發(fā)現(xiàn)，ALT水平正常但有嚴(yán)重肝損傷患者的血漿miR-122水平顯著高于對照組，同時miR-151a-3p水平明顯低于對照組，因此可以提前識別部分正在經(jīng)歷肝損傷但ALT水平正常的患者。

研究[35]發(fā)現(xiàn)與早期NAFLD患者相比，晚期NAFLD患者血清中循環(huán)外泌體miR-192的水平升高，表明miR-192可能是NASH進(jìn)展相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。與原發(fā)性肝癌患者相比，轉(zhuǎn)移性肝腫瘤中miR-1246和miR-210的表達(dá)水平顯著升高，因此miR-1246和miR-210可以作為區(qū)分肝細(xì)胞癌和肝轉(zhuǎn)移瘤的潛在生物標(biāo)志物[36]。

急性細(xì)胞排斥反應(yīng)是肝移植術(shù)后的主要問題，對肝移植術(shù)后患者觀察發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素9在發(fā)生急性細(xì)胞排斥反應(yīng)患者的循環(huán)外泌體和切除的肝臟中均表達(dá)增高[37]，說明外泌體衍生的半乳糖凝集素9水平可能是肝移植后排斥反應(yīng)和預(yù)后的預(yù)測因子。

4 外泌體在肝臟疾病治療中的作用

外泌體因其可由多種細(xì)胞分泌，能夠直接轉(zhuǎn)移多種細(xì)胞生物活性分子包括mRNAs、miRNA等，已經(jīng)報道其在糾正代謝缺陷、改善肝功能、促進(jìn)肝臟再生、預(yù)防腫瘤進(jìn)展等方面對肝臟疾病具有潛在的治療作用。除直接治療作用外，外泌體還能夠作為載體將特異性生物分子遞送至靶細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。

間充質(zhì)干細(xì)胞移植作為慢性肝病的一種新興療法越來越受到人們的關(guān)注，外泌體在治療過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究[38]表明羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能夠顯著減少NASH大鼠Kupffer細(xì)胞的數(shù)量以及TNFα、IL-1β、IL- 6和TGFβ等炎癥因子的mRNA表達(dá)水平，還顯著降低了肝纖維化大鼠的纖維積累、Kupffer細(xì)胞數(shù)，抑制HSC活化。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能夠減輕肝臟缺血再灌注損傷，實驗組炎癥標(biāo)志物、肝組織凋亡標(biāo)志物caspase-3、bax水平明顯低于對照組[39]。肝細(xì)胞來源的外泌體能夠促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和肝再生，而從Kupffer細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞分離的外泌體則無此作用[40]。另有研究[41]發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性肝炎實驗?zāi)Ｐ椭?，NLRP3及caspase-1蛋白的表達(dá)增高，骨髓干細(xì)胞來源的外泌體具有保護(hù)肝損傷的作用，miR-223能夠降低NLRP3及caspase-1蛋白的表達(dá)，這可能為自身免疫性肝炎的治療提供一定的方向和依據(jù)。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過miR-17靶向硫氧還蛋白相互作用蛋白并抑制異?；罨木奘杉?xì)胞及由LPS或TNFα誘導(dǎo)的炎癥體激活，而發(fā)揮對急性肝衰竭的治療作用[42]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種新型基因編輯技術(shù)，對HBV的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中存在完整的功能性gRNA和Cas9蛋白，且CRISPR/Cas9系統(tǒng)可通過外泌體傳遞gRNA和Cas9蛋白至周圍的細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮其基因編輯功能[43]。這一作用雖然可以避免病毒載體系統(tǒng)本身帶來的副作用，但由于外泌體的釋放可能通過細(xì)胞間通訊影響周圍和遠(yuǎn)端組織或細(xì)胞，使得脫靶效應(yīng)和安全性問題更加復(fù)雜化。

5 結(jié)語和展望

外泌體作為一種大多數(shù)細(xì)胞類型產(chǎn)生的細(xì)胞外小泡，其介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊通過將各種生物活性成分從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞來調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能，可作為診斷和預(yù)后的有效生物標(biāo)志物，以及藥物和基因靶向傳遞的載體。其在肝臟炎癥、肝纖維化、肝硬化及肝衰竭這一系列病理過程中均發(fā)揮重要作用。血清外泌體有望作為肝臟疾病的液體活檢，代替有創(chuàng)的肝組織活檢。盡管外泌體的應(yīng)用潛力巨大，目前仍存在一定的問題，例如沒有標(biāo)準(zhǔn)化的分離方法，常用分離方法存在過程耗時、產(chǎn)量較低、容易污染的問題。另外，關(guān)于外泌體的生物發(fā)生、釋放、靶向及與靶細(xì)胞相互作用的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探索，才能更好的將其應(yīng)用于臨床和研究當(dāng)中。