肝巨噬細(xì)胞在原發(fā)性膽汁性膽管炎發(fā)生發(fā)展中的作用

楊文霞， 唐映梅

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 昆明 650000

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)原稱為“原發(fā)性膽汁性肝硬化”，2014年-2015年在國內(nèi)外專家聯(lián)合聲明[1]下更名為“原發(fā)性膽汁性膽管炎”。PBC是一種慢性膽汁淤積性自身免疫性肝病，其病理特征為小葉間膽管上皮細(xì)胞進(jìn)行性非化膿性變性、壞死，及炎性細(xì)胞浸潤，最終形成膽汁淤積，病情進(jìn)展可出現(xiàn)肝纖維化、肝硬化；血清學(xué)主要表現(xiàn)為抗線粒體抗體(AMA)尤其是抗M2亞型陽性，以及膽汁淤積相關(guān)酶學(xué)指標(biāo),如ALP、GGT的改變，其常見臨床表現(xiàn)為乏力、黃疸、瘙癢、高脂血癥、骨質(zhì)減少以及與其他自身免疫性疾病(最常見為干燥綜合征)的合并癥，約90%見于40～60歲女性，具體發(fā)病機制尚未完全清楚[2-3]。在其發(fā)病過程中，肝巨噬細(xì)胞發(fā)揮了重要作用[3]。

肝巨噬細(xì)胞包括骨髓來源的單核細(xì)胞和常駐于肝臟的Kupffer細(xì)胞，Kupffer細(xì)胞來源于胚胎時期卵黃囊的紅血球樣細(xì)胞，在胚胎時期即定植于肝臟，能夠自我更新。與單核細(xì)胞相比，Kupffer細(xì)胞是靜止的，以微絨毛固定于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的窗孔內(nèi)，以利于吞噬血源性抗原及衰老紅細(xì)胞細(xì)胞碎片等，在肝臟先天性免疫及內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[4]。病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，及損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMPs)可激活Kupffer細(xì)胞，釋放炎性因子和趨化因子，募集循環(huán)血液中的單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，參與肝臟的固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[5]。因此，穩(wěn)態(tài)條件下，Kupffer細(xì)胞組成了肝臟吞噬細(xì)胞的大部分，炎性條件下肝巨噬細(xì)胞則由Kupffer細(xì)胞和單核細(xì)胞構(gòu)成[6-7]。Kupffer細(xì)胞和單核細(xì)胞被證明具有高度不同的功能，特定巨噬細(xì)胞亞群的特定功能仍然未知，在PBC中可能也很重要；巨噬細(xì)胞的功能異質(zhì)性和起源的相關(guān)性，是目前巨噬細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點[3,6-7]。

1 PBC單核巨噬細(xì)胞浸潤及免疫表型的改變

單核細(xì)胞占浸潤門靜脈區(qū)域細(xì)胞的30%，大多集中在受損膽管周圍[8]。在PBC患者的肝臟中，各種單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein, MCP)(如MCP-1、MCP-2和MCP-3)增多；浸潤的單核細(xì)胞主要以趨化因子受體(CCR)2依賴方式大量募集入肝臟，在PBC晚期階段更為明顯[2]。CCR2缺陷對自身免疫性膽管炎的發(fā)展具有保護作用；雙重趨化因子受體CCR2/CCR5拮抗劑Cenicriviroc阻斷CCR2/CCR5可抑制單核細(xì)胞浸潤，改善PBC的嚴(yán)重程度，如血清總膽汁酸水平、門靜脈炎癥和纖維化[2,9]。

外周血單核細(xì)胞主要分為CD14highCD16-經(jīng)典單核細(xì)胞群(約占血液單核細(xì)胞的90%)和CD16+單核細(xì)胞群(約占血液單核細(xì)胞的10%)，后者進(jìn)一步分為CD14highCD16+中間子集和CD14lowCD16+非經(jīng)典子集；CD16+單核細(xì)胞通常被稱為促炎性單核細(xì)胞。PBC患者具有獨特的單核細(xì)胞免疫表型。PBC患者外周血CD16+單核細(xì)胞明顯增加，且CD14lowCD16+細(xì)胞的數(shù)量與疾病進(jìn)展呈正相關(guān)，與肝損傷指標(biāo)和血清CRP呈正相關(guān)，尤其在肝硬化的PBC患者更為明顯，可促進(jìn)PBC患者的炎癥反應(yīng)和肝損傷；在PBC單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型中，CD14lowCD16+單核細(xì)胞可通過IL-12和直接接觸促進(jìn)輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)1分化，且PBC患者循環(huán)中CD14lowCD16+單核細(xì)胞與Th1細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)[10]。CD14highCD16+單核細(xì)胞可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化并分泌高水平的IL-17，Th17細(xì)胞可能在PBC發(fā)病機理中起作用[3]。此外，還發(fā)現(xiàn)其他分子如唾液酸黏附素在PBC單核細(xì)胞異常過表達(dá)，唾液酸黏附素在免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控作用；介導(dǎo)炎癥信號的CD40配體水平在PBC單核巨噬細(xì)胞中顯著升高[11]。

2 肝巨噬細(xì)胞極化在PBC發(fā)病中的作用

巨噬細(xì)胞具有高可塑性，其表型和功能隨著微環(huán)境的變化而發(fā)生改變。根據(jù)局部微環(huán)境的改變，巨噬細(xì)胞可極化為M1及M2型，M1即經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞，主要由脂多糖(LPS) 和IFNγ誘導(dǎo)，活化后可分泌促炎因子，如IL-12、IL-1、TNFα及促炎介質(zhì)NO等，具有高效的抗原遞呈能力，促進(jìn)Th1和Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)，其殺菌能力增強，發(fā)揮促炎、促纖維化及抗腫瘤作用。M2即替代活化型巨噬細(xì)胞，可分為M2a、M2b、M2c、M2d四種亞型，主要由IL-4等誘導(dǎo)，活化后可產(chǎn)生IL-10等抗炎細(xì)胞因子，能有效吞噬凋亡細(xì)胞殘骸，促進(jìn)血管形成、組織修復(fù)和重塑，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞反應(yīng)，發(fā)揮抗炎、抗纖維化及促腫瘤作用，殺菌作用則很弱。正常狀況下，M1和M2處于動態(tài)平衡中，在炎癥反應(yīng)中能夠相互轉(zhuǎn)換；在炎癥早期, M1型巨噬細(xì)胞釋放促炎因子和趨化因子, 招募和激活免疫細(xì)胞，但可能造成組織損傷，而在炎癥恢復(fù)階段, M1型可轉(zhuǎn)化為M2型巨噬細(xì)胞,發(fā)揮抗炎效應(yīng),參與組織愈合及修復(fù)[6,12-13]。PBC中M1/M2的動態(tài)平衡被打破，內(nèi)穩(wěn)態(tài)向炎癥方向進(jìn)展并造成組織損傷，可能參與了PBC的發(fā)生發(fā)展[14]。

已有研究[14-15]表明，在PBC的早期炎癥階段，巨噬細(xì)胞主要向M1方向極化，中晚期肝纖維化、肝硬化階段，巨噬細(xì)胞主要向M2方向極化，M1、M2型巨噬細(xì)胞可能參與了PBC的炎癥損傷及纖維化。M2/M1的比值在疾病的進(jìn)展過程中處于動態(tài)變化中，在PBC的早期明顯低于中晚期，PBC患者血清中M2/M1的比值與膽汁淤積相關(guān)指標(biāo)如DBil、ALP的表達(dá)呈正相關(guān)，提示M2/M1的比值可有效反應(yīng)血清中DBil、ALP的濃度；而M1與血清總膽汁酸、ALP呈負(fù)相關(guān)，M2只與ALP呈正相關(guān)。

諸多因素可影響PBC肝巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)。TYRO3、AXL和MERTK受體酪氨酸激酶組成TAM受體家族，其共同配體為生長停滯特異性基因6(Gas6)和S蛋白(ProS)[16]；TAM受體信號系統(tǒng)異?？蓪?dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生，MER受體為其中最重要的一員。研究[17]發(fā)現(xiàn)，MER受體的表達(dá)在PBC晚期階段高于早期階段，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2方向極化，其潛在機制是MER受體通過調(diào)控磷酸化蛋白激酶B水平進(jìn)而增加M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)因子的表達(dá)與分泌,促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。IL-17可通過激活核因子-κB(NF-κB)途徑使巨噬細(xì)胞向M1方向極化。IL-17主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，Th17細(xì)胞大量浸潤于PBC晚期患者肝臟中，主要集中在受損膽管周圍及匯管區(qū)；IL-17發(fā)揮促炎和促纖維化作用，是改變PBC肝巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵細(xì)胞因子；IL-17可使M1相關(guān)炎性因子高表達(dá)，M2標(biāo)志物及相關(guān)細(xì)胞因子如IL-10的表達(dá)則受到抑制，可致PBC的炎癥發(fā)展[18]；IL-17可能成為PBC的藥物治療靶點之一。此外，最近有研究[19]發(fā)現(xiàn)，促胰液素及其受體軸在PBC早期患者表達(dá)增加，可促進(jìn)PBC中M1巨噬細(xì)胞極化及炎癥損傷?？傊?，巨噬細(xì)胞可通過不同途徑活化為不同狀態(tài)，參與PBC炎癥反應(yīng)，其他促巨噬細(xì)胞極化因素有望進(jìn)一步研究和闡明。

3 肝巨噬細(xì)胞中NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protien3, NLRP3)炎性體在PBC發(fā)病中的作用

NLRP3炎性體主要存在于巨噬細(xì)胞中，由NOD樣受體蛋白3、接頭分子凋亡相關(guān)斑點樣蛋白及效應(yīng)分子前體半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1組成，是迄今為止最典型的炎性小體。多種危險信號可激活NLRP3炎性體，包括細(xì)胞內(nèi)的PAMPs和DAMPs[20]。肝巨噬細(xì)胞中NLRP3炎性體的激活可能參與PBC的炎癥反應(yīng)及纖維化。

PBC患者高表達(dá)的胃泌素D(gasder-min D, GSDMD)可激活NLRP3炎性體，促進(jìn)caspase-1、IL-1β與IL-18的釋放，促進(jìn)PBC炎癥反應(yīng)的發(fā)生；GSDMD、caspase-1、IL-18在PBC患者中表達(dá)明顯高于健康對照組。正常情況下，GSDMD蛋白的C端和N端結(jié)構(gòu)域相互抑制，GSDMD處于無活性的自抑狀態(tài)，NLRP3炎性體激活后釋放的caspase-1可水解GSDMD導(dǎo)致N端活性結(jié)構(gòu)域釋放，進(jìn)一步激活NLRP3炎性體，形成惡性循環(huán)的炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致膽管損傷，可能參與了PBC的發(fā)生和發(fā)展[21]。

研究[22-23]顯示，PBC中NLRP3炎性體的激活有賴于半乳糖凝集素3(galectin-3,Gal-3)。正常肝臟中，Gal-3表達(dá)水平很低，主要在肝巨噬細(xì)胞中表達(dá)；在PBC患者肝臟中，Gal-3 mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)增高，其N末端結(jié)構(gòu)域可與NLRP3直接結(jié)合并介導(dǎo)NLRP3炎性體的組裝和激活，導(dǎo)致caspase-1活性增強及IL-1β分泌，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，這可能參與了PBC的炎癥反應(yīng)及纖維化。Gal-3缺失或Gal-3抑制劑可減輕PBC小鼠模型的膽管損傷[22]。因此，Gal-3或NLRP3炎性體的抑制劑阻斷信號傳導(dǎo)可能是PBC的潛在治療策略。

PBC為膽汁淤積性疾病，膽汁淤積時，疏水性膽汁酸如鵝脫氧膽酸可劑量依賴性引起NLRP3炎性體激活以及IL-1β分泌，這可能是PBC炎性巨噬細(xì)胞活化的重要機制[24]。此外，G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(G protein-coupled bile acid receptor 1, TGR5)可特異性感受膽汁酸，激活TGR5-cAMP-PKA軸抑制NLRP3炎性體的活化[25]。TGR5是一種膽汁酸受體，在非實質(zhì)細(xì)胞如Kupffer細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等高表達(dá)，介導(dǎo)抗炎、抗膽汁淤積和抗纖維化作用[26-28]。TGR5激動劑可改善炎癥和膽汁淤積性肝病的發(fā)展，TGR5拮抗劑可減弱多囊性肝病和膽管癌的疾病進(jìn)展，需進(jìn)一步試驗確定TGR5藥理活性在相關(guān)膽道疾病中的治療潛力[26]。

4 肝巨噬細(xì)胞Toll樣受體(TLR)在PBC發(fā)病中的作用

TLR為細(xì)胞表面的模式識別受體，在機體防御外來微生物感染及先天性免疫反應(yīng)中起重要作用[29]。TLR4為革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分LPS的模式識別受體，可大量表達(dá)于Kupffer細(xì)胞等細(xì)胞表面；近年來研究[30-31]顯示,PBC患者血清LPS水平明顯升高；膽道上皮細(xì)胞、門靜脈區(qū)肝細(xì)胞以及各種免疫細(xì)胞中TLR4表達(dá)上調(diào)，LPS可激活TLR4，激活TLR4/MyD88/NF-κB信號傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子如TNFα、IL-1β、IL-6的分泌，可能參與了PBC患者的膽管損傷。此外，研究[11]顯示，TLR4及其負(fù)調(diào)節(jié)劑RP105(CD180)的表達(dá)在PBC單核細(xì)胞上發(fā)生改變，使PBC患者單核細(xì)胞TLR4通路對LPS反應(yīng)性增高。研究[31]顯示，表達(dá)于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞表面的線粒體M2蛋白可以活化TLR4并以NF-кB途徑激活單核巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其分泌促炎因子，引起肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的損傷。PBC患者外周血單核細(xì)胞TLR-4 mRNA表達(dá)上調(diào)，但與血漿中ALP、GGT的水平無相關(guān)性，提示TLR4的異常表達(dá)和活化可能參與了PBC的發(fā)病，但與PBC病情進(jìn)展無顯著相關(guān)性[32]。

肝巨噬細(xì)胞除了可以表達(dá)TLR4，還可以表達(dá)TLR2、TLR3、TLR5以及TLR9，這些受體由配體激活后，PBC肝巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子數(shù)量明顯增加，尤其是IL-1β，IL-6，IL-8和TNFα，這可能與PBC患者自身免疫耐受破壞有關(guān)[33]。在PBC患者中，TLR9的高表達(dá)可導(dǎo)致B細(xì)胞的AMA產(chǎn)生增加；PBC患者TLR3在肝巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，TLR3的配體聚肌胞苷酸( Poly Ⅰ∶C )處理后的PBC小鼠模型可誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤、炎性細(xì)胞因子表達(dá)及纖維化；肝巨噬細(xì)胞可通過TLR3信號傳導(dǎo)產(chǎn)生IFNα，IFNα可激活NK細(xì)胞并增強NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性[8,34]。調(diào)節(jié)TLR通路對PBC患者的治療具有潛在意義。

5 小結(jié)

綜上所述，肝巨噬細(xì)胞具有可塑性，隨著肝臟微環(huán)境的變化可分化為不同的表型，這些異質(zhì)性細(xì)胞在PBC的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮不同的作用甚至相互拮抗；肝巨噬細(xì)胞可通過模式識別受體TLR及NLRP3炎性體等途徑被激活，參與PBC的炎癥反應(yīng)。深入研究肝巨噬細(xì)胞在PBC發(fā)生發(fā)展中的作用，將有利于了解PBC患者炎癥及免疫反應(yīng)機制，最終將改善PBC患者的治療及預(yù)后，肝巨噬細(xì)胞在PBC中的作用機制有待進(jìn)一步研究。