HBV持續(xù)感染及其機(jī)制的研究進(jìn)展

陳 歡，楊燕卿，儲(chǔ) 君，張國(guó)遠(yuǎn)，林世德

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 感染科，貴州 遵義 563003

根據(jù)2016年全球疾病負(fù)擔(dān)研究報(bào)告，每年高達(dá)80萬(wàn)患者死于HBV感染和其所致的終末期肝病(肝硬化、肝衰竭、肝癌等)[1-2]。目前批準(zhǔn)用于治療慢性乙型肝炎的藥物包括干擾素和核苷(酸)類似物。由于干擾素治療的副作用，只有一小部分慢性乙型肝炎符合其使用指征，且療效有限，干擾素治療后不到10%的患者能實(shí)現(xiàn)持續(xù)HBsAg陰轉(zhuǎn)[2-3]。核苷(酸)類似物治療的耐受性較好，可以明顯降低HBV載量，但其對(duì)HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換影響不大，且在停止治療后存在病毒反彈、肝炎復(fù)發(fā)、肝衰竭、失代償，甚至死亡的風(fēng)險(xiǎn)，故大多數(shù)患者需要長(zhǎng)期口服抗病毒藥物維持治療[4-5]。經(jīng)治療后達(dá)到病毒抑制或已治愈的急性或慢性乙型肝炎患者，在接受免疫抑制治療或免疫力低下的情況下，HBV可發(fā)生再活化，這表明該病毒并沒(méi)有徹底被消滅[3]?；谶@一現(xiàn)狀，迫切需要認(rèn)識(shí)HBV持續(xù)感染的機(jī)制，以實(shí)現(xiàn)慢性乙型肝炎治療上的突破。

HBV屬嗜肝DNA病毒科，大小約3.2 kb，其感染肝細(xì)胞后，在細(xì)胞核內(nèi)釋放松弛環(huán)狀DNA(relax circular DNA，rcDNA)，rcDNA經(jīng)過(guò)某種修復(fù)機(jī)制，修復(fù)正鏈轉(zhuǎn)變成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)[5]。細(xì)胞RNA聚合酶Ⅱ以cccDNA 負(fù)鏈(包含4個(gè)開(kāi)放讀碼框，即S、C、P、X區(qū))為模板，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生4種mRNA，大小分別為3.5、2.4、2.1和0.7 kb，其中3.5 kb mRNA又稱為前基因組RNA(pregenome RNA，pgRNA)。mRNAs從細(xì)胞核移至細(xì)胞質(zhì)，翻譯成HBcAg、HBeAg、病毒DNA聚合酶、HBsAg、HBx蛋白，也可組裝形成成熟的病毒衣殼。成熟的病毒衣殼可經(jīng)過(guò)包膜蛋白包裹，以病毒顆粒的形式分泌到細(xì)胞外，也可再次進(jìn)入細(xì)胞核以補(bǔ)充或擴(kuò)增cccDNA池[4-5]。這些HBV病毒組分、病毒顆粒及cccDNA是HBV生命周期中的產(chǎn)物，可作用于自身，同時(shí)又可與宿主相互作用，促進(jìn)HBV的復(fù)制，負(fù)向調(diào)節(jié)免疫功能，引起HBV慢性感染，促進(jìn)疾病的進(jìn)展。下面將闡述cccDNA、HBV顆粒及病毒蛋白成分維持HBV持續(xù)感染的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 cccDNA與HBV持續(xù)感染

cccDNA是HBV復(fù)制周期的一個(gè)關(guān)鍵復(fù)制中間體，在細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞組蛋白和非組蛋白形成一個(gè)微型染色體。它不包含復(fù)制起點(diǎn)，不能在受感染的肝細(xì)胞中自我復(fù)制。理論上cccDNA應(yīng)隨著細(xì)胞分裂而丟失，然而，盡管誘導(dǎo)細(xì)胞分裂后cccDNA顯著減少，但通過(guò)cccDNA的不斷補(bǔ)充，及其在細(xì)胞核中的穩(wěn)定性，使cccDNA在細(xì)胞核中仍持續(xù)存在[6]。到目前為止，已經(jīng)確定了3種補(bǔ)充cccDNA的途徑：病毒顆粒通過(guò)與肝細(xì)胞上的鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體結(jié)合，感染肝細(xì)胞，這是cccDNA生成的典型途徑；第2條途徑是細(xì)胞質(zhì)中HBcAg的富精氨酸碳端域觸發(fā)含rcDNA的衣殼進(jìn)入細(xì)胞核，rcDNA通過(guò)細(xì)胞內(nèi)途徑轉(zhuǎn)化為cccDNA；第3條途徑是肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA孵育活化，這是HBV復(fù)發(fā)的主要因素[7]。Ko等[8]也再次證實(shí)HBV基因組的細(xì)胞內(nèi)循環(huán)以及病毒粒子感染細(xì)胞促進(jìn)了cccDNA的形成。cccDNA在細(xì)胞核中的穩(wěn)定性可能與泛素結(jié)合酶E2L3誘導(dǎo)載脂蛋白B mRNA編輯酶催化亞基3A的蛋白酶體依賴性降解有關(guān)[9]，同時(shí)也可能與HBx蛋白穩(wěn)定cccDNA的核定位有關(guān)[10]。由此可見(jiàn)HBV持續(xù)感染與cccDNA的不斷補(bǔ)充及其在細(xì)胞核中的穩(wěn)定存在密切關(guān)系。

cccDNA的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)受到宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[7]，Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)類視黃醇X受體α可直接與cccDNA結(jié)合，促進(jìn)HBV復(fù)制，其潛在機(jī)制可能與促進(jìn)cccDNA對(duì)乙酰轉(zhuǎn)移酶p300的招募有關(guān)；也有研究[12]發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞核因子可通過(guò)與cccDNA結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。另外，cccDNA結(jié)合組蛋白表觀遺傳修飾也可調(diào)控cccDNA轉(zhuǎn)錄，如cccDNA結(jié)合組蛋白乙酰化可使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松弛，從而激活轉(zhuǎn)錄活性，而去乙?；瘎t誘導(dǎo)染色質(zhì)處于濃縮或非活性狀態(tài)[13]。除此之外，cccDNA轉(zhuǎn)錄活動(dòng)也與HBx及HBcAg關(guān)系密切，如HBx蛋白與DNA損傷特異性結(jié)合蛋白1相互作用，通過(guò)降解Smc5/6蛋白，促進(jìn)HBV轉(zhuǎn)錄[14]； Kinoshita等[15]也發(fā)現(xiàn)前體mRNA加工因子31與細(xì)胞核內(nèi)的HBx相互作用，并通過(guò)HBx增強(qiáng)了cccDNA的形成；HBcAg的富精氨酸碳端域?qū)BV轉(zhuǎn)錄以及隨后的復(fù)制步驟起重要作用，可能與減少HBcAg與cccDNA的相互作用和減少與cccDNA結(jié)合的組蛋白乙酰化有關(guān)[16]。cccDNA的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)受到諸多因子調(diào)控，此處沒(méi)有一一羅列，而這些因子使cccDNA在細(xì)胞核持續(xù)存在，鑒于目前沒(méi)有靶向清除cccDNA的抗病毒藥物，這就使得徹底治愈慢性乙型肝炎變得異常艱難。

2 HBV顆粒與HBV持續(xù)感染

HBV顆粒包含HBV DNA顆粒、HBV RNA顆粒及亞病毒顆粒。HBV DNA顆粒即Dane顆粒由包膜和核衣殼組成。包膜由表面抗原組成；核衣殼由240個(gè)核心蛋白組成，其內(nèi)包含HBV聚合酶和rcDNA，具有傳染性。HBV RNA顆粒與HBV DNA形態(tài)類似，兩者包膜和核衣殼組分相同，但RNA顆粒的核衣殼內(nèi)是pgRNA，其是否具有傳染性，目前尚不清楚[17]；亞病毒顆粒呈絲狀或小球型，22 nm，僅由表面抗原組成，且數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了Dane顆粒，達(dá)10～10 000倍[18]。幾種病毒顆粒組成上的不同，使其在HBV持續(xù)感染中發(fā)揮不同的作用。

過(guò)量的亞病毒顆粒可作為HBV特異性體液免疫的誘餌，持續(xù)觸發(fā)抗原特異性T淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路而導(dǎo)致病毒特異性T淋巴細(xì)胞的衰竭；亞病毒顆粒也可以負(fù)調(diào)節(jié)先天免疫信號(hào)通路,如通過(guò)干擾c-Jun 氨基末端激酶激活，選擇性抑制Toll樣受體2配體，使單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞下調(diào)IL-12的表達(dá)[3,19]，這促進(jìn)了HBV感染的慢性化。

pgRNA作為新的肝內(nèi)HBV復(fù)制和治療反應(yīng)的標(biāo)志物，一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[20]表明，在未抗病毒治療以前，血清中的pgRNA與肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA顯著相關(guān)(r=0.89，P<0.000 1)，但治療以后，兩者無(wú)相關(guān)關(guān)系(r=0.13，P=0.733)，此項(xiàng)結(jié)果提示在未抗病毒治療以前，pgRNA可較準(zhǔn)確反映HBV在體內(nèi)復(fù)制情況。也有研究[17]表明在首次治療的慢性乙型肝炎患者血清中，HBV pgRNA顆粒顯著低于HBV DNA顆粒(P=0.007)，但給予核苷(酸)類似物抗病毒治療后，HBV pgRNA/HBV DNA顯著升高(P<0.000 1)，這可能與核苷(酸)類似物抑制HBV pgRNA逆轉(zhuǎn)錄有關(guān)。在停用核苷(酸)類似物抗病毒治療時(shí)，患者血清中若能檢測(cè)到HBV pgRNA顆粒，其在停藥后24周發(fā)生病毒反彈概率為100%。提示HBV pgRNA可能與HBV的持續(xù)感染和病毒反彈存在聯(lián)系。

3 HBV蛋白與HBV持續(xù)感染

3.1 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) HBV表達(dá)3個(gè)包膜蛋白，即小蛋白、中蛋白、大蛋白[21]。小蛋白含226個(gè)氨基酸，即HBsAg；中蛋白在小蛋白基礎(chǔ)上有一個(gè)額外的Pre-S2結(jié)構(gòu)域，Pre-S2含55個(gè)氨基酸，其中包含人多聚白蛋白受體，HBV可通過(guò)多聚白蛋白受體與肝細(xì)胞間接結(jié)合，參與HBV感染肝細(xì)胞[22]；大蛋白在中蛋白基礎(chǔ)上有一個(gè)額外的Pre-S1結(jié)構(gòu)域，Pre-S1含108或119個(gè)氨基酸，據(jù)不同基因型而定，其中第21～47位氨基酸殘基是肝細(xì)胞HBV受體的配體，對(duì)HBV感染肝細(xì)胞至關(guān)重要[23]。

HBsAg是HBV分泌到血清中的主要病毒蛋白，其定量?jī)r(jià)值是評(píng)價(jià)慢性HBV感染和抗病毒反應(yīng)的重要標(biāo)志。有研究[24]發(fā)現(xiàn)HBsAg中一些氨基酸替換可能損害病毒粒子的分泌，改變HBsAg與抗體結(jié)合的能力，或影響HBV復(fù)制，使得血清HBsAg、HBV DNA檢測(cè)水平下降；同樣，在宿主HBV免疫清除過(guò)程中，可能會(huì)誘導(dǎo)HBV Pre-S基因的許多位點(diǎn)發(fā)生突變，這些突變可能與HBV復(fù)制缺陷有關(guān)，可能是HBV發(fā)生免疫逃逸、隱匿性HBV感染的原因之一[23]。Bi等[21]也發(fā)現(xiàn)免疫突變株如N146Q、G145R等可使包膜蛋白S域的N端糖基化受損，從而影響病毒顆粒的分泌，且這些突變株可降低突變包膜蛋白對(duì)HBV抗體的親和力，從而導(dǎo)致診斷失敗、HBV隱匿性感染或疫苗接種失敗。此外，HBV S基因可整合到宿主啟動(dòng)子序列和啟動(dòng)子側(cè)翼調(diào)控序列中(整合位點(diǎn)：3q26、10q23、10q22、15p11.1、3p13、12q13)，通過(guò)宿主啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄HBsAg，并從肝細(xì)胞釋放到外周血中，導(dǎo)致血清中HBsAg持續(xù)存在，甚至有時(shí)維持在較高水平[25]。而外周循環(huán)中的高水平HBsAg可引起樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞功能受損，誘導(dǎo)宿主免疫耐受，從而導(dǎo)致HBV持續(xù)感染[26]。

3.2 乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg) HBcAg是一種結(jié)構(gòu)蛋白，分子量為21 kD，包含183個(gè)氨基酸，前149個(gè)殘基組成N端域，對(duì)衣殼組裝至關(guān)重要；其余34個(gè)殘基形成一個(gè)富含精氨酸的C端域，與核酸結(jié)合，并發(fā)出核定位和輸出信號(hào)[27]。HBcAg在病毒復(fù)制中發(fā)揮著多種重要作用，包括衣殼組裝、pgRNA包裝、病毒逆轉(zhuǎn)錄以及病毒粒子分泌。MxA蛋白可抑制HBV mRNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及在不影響HBcAg的情況下抑制HBsAg和HBV DNA產(chǎn)生[28]，而Fernandez等[29]研究發(fā)現(xiàn)HBcAg可與MxA啟動(dòng)子相互作用而顯著下調(diào)MxA蛋白表達(dá)以影響其抗病毒作用。有研究[30]發(fā)現(xiàn)HBcAg可顯著抑制人類死亡受體5基因的啟動(dòng)子活性，下調(diào)人類死亡受體5蛋白表達(dá)，使感染HBV的肝細(xì)胞對(duì)TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的凋亡不敏感，從而在慢性感染中發(fā)揮作用。樹(shù)突狀細(xì)胞是最有效的抗原呈遞細(xì)胞類型，具有獨(dú)特的能力，不僅能誘導(dǎo)對(duì)入侵病原體的初級(jí)免疫反應(yīng)，還具有免疫耐受作用。Li等[31]發(fā)現(xiàn)HBcAg通過(guò)激活PI3K/AKT、ERK和P38信號(hào)通路，誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞上調(diào)CD274(又稱程序性死亡配體1或B7-H1)表達(dá)，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞凋亡，抑制HBV DNA的清除。而樹(shù)突狀細(xì)胞的減少有助于免疫耐受，這也可能是HBV持續(xù)感染的潛在機(jī)制之一。然而，也有報(bào)道[32]稱HBcAg通過(guò)PKC/NF-κB/bcl-2信號(hào)通路，促進(jìn)DC2.4小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞增殖和抑制其凋亡。鑒于HBcAg對(duì)免疫系統(tǒng)作用的復(fù)雜，更加深層次、全面的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

3.3 乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg) Pre-C基因和C基因共同編碼HBeAg的前體，HBeAg前體通過(guò)蛋白水解過(guò)程去除氨基端的19個(gè)氨基酸殘基、羧基端的34個(gè)氨基酸疏水多肽，即形成HBeAg，有159個(gè)氨基酸殘基，分子量為18 kD[33]。HBeAg作為一種具有重要免疫調(diào)節(jié)作用的非結(jié)構(gòu)性病毒蛋白，參與調(diào)節(jié)先天、適應(yīng)性免疫反應(yīng)和維持HBV的持續(xù)感染[34]。Lu等[35]發(fā)現(xiàn)HBeAg可以抑制組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞(U937細(xì)胞)的遷移，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生，包括B淋巴細(xì)胞激活因子、IL-6和IL-10；HBeAg還可通過(guò)直接誘導(dǎo)方式促進(jìn)人B淋巴母細(xì)胞活化和增殖。這些結(jié)果提示HBeAg在調(diào)節(jié)單核細(xì)胞功能和促進(jìn)B淋巴細(xì)胞活化方面發(fā)揮一定作用。單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的聚集對(duì)炎癥的發(fā)生至關(guān)重要，而Leu等[36]發(fā)現(xiàn)HBeAg可抑制人單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)和遷移，這可能會(huì)干擾隨后針對(duì)HBV的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致慢性感染的形成。除此之外，也有研究[33]表明HBeAg通過(guò)與Toll樣受體2、β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白接相關(guān)受體分子的相互作用抑制先天性免疫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；HBeAg可能促進(jìn)HBeAg特異性和HBcAg特異性1型輔助性T淋巴細(xì)胞耗竭，并阻斷抗-HBc反應(yīng)；HBeAg還可阻礙樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟[37]。上述證據(jù)均提示HBeAg對(duì)HBV免疫治療有負(fù)作用，有利于維持HBV慢性感染。

3.4 DNA聚合酶 HBV DNA聚合酶(P蛋白)為含有832個(gè)氨基酸的多功能蛋白，含有多個(gè)功能區(qū)，從N端至C端依次為：末端蛋白域、間隔域、逆轉(zhuǎn)錄酶和核糖核酸酶域。末端蛋白域?yàn)槭雀尾《舅?dú)有的，包含合成負(fù)鏈的起始引物；間隔域是一個(gè)在P蛋白內(nèi)保守性較差的區(qū)域，能夠承受各種缺失和插入，而不會(huì)顯著改變P蛋白基因組復(fù)制功能，逆轉(zhuǎn)錄酶和核糖核酸酶域負(fù)責(zé)逆轉(zhuǎn)錄和降解pgRNA[38]。P蛋白沒(méi)有3′-5′核酸外切酶活性，缺乏校對(duì)能力，病毒基因組復(fù)制的錯(cuò)誤率高達(dá)10-7/個(gè)核苷酸，是其他DNA病毒的10倍，易導(dǎo)致突變株的出現(xiàn)。然而用于HBV治療的藥物核苷(酸)類似物都是以P蛋白的DNA聚合酶活性為靶點(diǎn)，這就使得治療過(guò)程中出現(xiàn)的HBV耐藥，成了影響長(zhǎng)期治療的一個(gè)主要問(wèn)題。末端蛋白域的8個(gè)突變株(rtL80I、rtD134N、rtN139K/T/H、rtY141F、rtM204I/V、rtF221Y、rtI224V及rtM309K)與病情進(jìn)展顯著相關(guān)[39-40]。

3.5 HBx蛋白 HBx蛋白是一種非結(jié)構(gòu)蛋白, 含154個(gè)氨基酸，分子量為17 kD。X蛋白對(duì)病毒復(fù)制的啟動(dòng)和維持起著至關(guān)重要的作用，當(dāng)沒(méi)有X蛋白表達(dá)時(shí)，幾乎檢測(cè)不到HBV的轉(zhuǎn)錄[41]。有研究[12]發(fā)現(xiàn)X蛋白在細(xì)胞核，通過(guò)招募P300/CBP相關(guān)因子，P300/CBP等組蛋白修飾物，調(diào)節(jié)cccDNA、激活HBV轉(zhuǎn)錄；在細(xì)胞質(zhì)中刺激代謝、增殖等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以促進(jìn)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；部分細(xì)胞質(zhì)的X蛋白定位在線粒體的外膜，并與依賴電壓的陰離子通道相互作用，從而改變線粒體的膜電位，這可能與HBV誘導(dǎo)的肝損傷、肝癌的發(fā)生有關(guān)[14,42]；定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的X蛋白與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78直接作用，導(dǎo)致真核細(xì)胞起始因子2α磷酸化的抑制，抑制下游蛋白即活化轉(zhuǎn)錄因子4、DNA損害誘導(dǎo)基因153、Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶和γH2AX蛋白水平，使感染HBV的肝細(xì)胞逃避內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡[43]。Jessica等[44]首次提出X蛋白可調(diào)節(jié)人類原代肝細(xì)胞內(nèi)的Ca2+信號(hào)，并作為上游信號(hào)啟動(dòng)X蛋白的其他效應(yīng)，包括X蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白、刺激病毒復(fù)制。HBx作為HBV復(fù)制和HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌變的重要輔激活劑，可以增強(qiáng)FoxA1與MSL2啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的能力，上調(diào)的MSL2蛋白可通過(guò)泛素化APOBEC3B使其降解，來(lái)維持HBV cccDNA的穩(wěn)定性，形成HBx/MSL2/cccDNA/HBV的正反饋回路，促進(jìn)肝癌的發(fā)生[45]。而持續(xù)穩(wěn)定的cccDNA水平與細(xì)胞內(nèi)HBV基因再循環(huán)和繼發(fā)感染關(guān)系密切[8]。

4 小結(jié)

HBV可通過(guò)自身病毒成分之間的相互作用以及與宿主發(fā)生相互作用，維持cccDNA在細(xì)胞核的穩(wěn)定性，促進(jìn)HBV的復(fù)制，負(fù)向調(diào)節(jié)免疫功能，建立HBV慢性感染；HBV也可發(fā)生突變，產(chǎn)生免疫逃逸株、耐藥株等，降低對(duì)抗病毒藥物的敏感性。這些方面的因素均使得治愈乙型肝炎變得困難。幸運(yùn)的是，一系列針對(duì)HBV持續(xù)感染藥物，從干擾和破壞病毒RNA、干擾病毒DNA蛋白合成、干擾HBsAg產(chǎn)生、激活人體免疫系統(tǒng)等方面都有了新的進(jìn)展。希望能早日通過(guò)藥物試驗(yàn)，盡早實(shí)現(xiàn)乙型肝炎的徹底治愈。