牛病毒性腹瀉病毒的檢測方法及凈化研究進展

王廷龍,劉俊峰,張淑琴

（1．塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

牛病毒性腹瀉又叫牛病毒性腹瀉粘膜?。˙ovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD），是由牛病毒性腹瀉病病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起的一種以腹瀉為主的粘膜病。該病流行范圍極廣，在全世界各地都有流行記錄。在國際上，已經(jīng)有國家宣稱已徹底消滅凈化BVD。隨著養(yǎng)牛業(yè)飛速發(fā)展，因本土牛種的缺陷和不足，需要從國外引進牛胚胎、精液等產(chǎn)品，導(dǎo)致BVD 的傳入機會增加。該病在我國20 多個省（市、自治區(qū)）均有檢出[1]。

健康牛感染BVDV 后，可引發(fā)多種臨床癥狀。發(fā)病時多數(shù)牛臨床癥狀表現(xiàn)不明顯，牛群中可見少數(shù)輕型病例，有時也引起全牛群突然發(fā)病。急性病牛，腹瀉是特征性癥狀，可持續(xù)1～3 周。病牛糞便水樣、惡臭，有大量粘液和氣泡，體溫升高達40～42℃。慢性病牛，出現(xiàn)間歇性腹瀉，病程較長，一般2～5 個月，表現(xiàn)為消瘦、生長發(fā)育受阻，有的出現(xiàn)跛行，部分牛逐漸發(fā)展成持續(xù)性感染（Persistent infection，PI）牛。BVDV 導(dǎo)致的病變主要集中在消化道粘膜和淋巴結(jié)，BVDV 若感染妊娠母?？赡軙?dǎo)致產(chǎn)畸形胎兒、流產(chǎn)或產(chǎn)出PI牛[2]，造成較大的經(jīng)濟損失。該病毒主要在偶蹄類動物中廣泛傳播，嚴重危害全球牛、羊等反芻動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，造成的經(jīng)濟損失不容小覷[3]。

PI牛對養(yǎng)牛業(yè)的危害最大，PI牛指的是BVDV在牛體內(nèi)長期存在而未被清除，其在宿主體內(nèi)潛伏長達數(shù)月至數(shù)年，甚至宿主不能清除病毒而終生攜帶病毒。PI牛隱藏在健康牛群中難以發(fā)現(xiàn)，不表現(xiàn)出臨床癥狀。犢牛在胚胎發(fā)育早期或初生期時，機體免疫器官、免疫組織尚未發(fā)育成熟，BVDV 進入免疫器官，會導(dǎo)致免疫細胞的程序性死亡，從而產(chǎn)生病毒的持續(xù)性感染，成為PI 牛。PI 牛向環(huán)境中散播著大量的病毒顆粒，成為牛群中的主要傳染源。由于PI 牛免疫力下降，易受機會致病菌侵襲，感染其他疾病的幾率相較于正常牛要高，由此所造成的間接經(jīng)濟損失巨大。全世界各地區(qū)每年死于BVD 的牛不少于500 萬頭，BVDV 造成的經(jīng)濟損失并不僅僅體現(xiàn)在病牛的死亡，感染BVDV后病牛生產(chǎn)性能下降，料肉比升高；此外，懷孕母牛感染BVDV 會出現(xiàn)胎兒流產(chǎn)、死亡等現(xiàn)象。隨著國民經(jīng)濟的發(fā)展，國內(nèi)消費者對肉類等動物性食品的需求結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而國內(nèi)的牛肉產(chǎn)能不足，為了滿足國內(nèi)消費者對于牛肉、牛奶等動物類食品的消費的要求，近年來，我國從澳大利亞、新西蘭進口的種牛、乳用牛、牛肉類產(chǎn)品數(shù)量急劇增加，牛類副產(chǎn)品進口貿(mào)易的頻繁，導(dǎo)致BVDV 傳入國內(nèi)的幾率也隨之增高。因此加強我國規(guī)?；B(yǎng)牛場BVDV的檢疫和防治刻不容緩，本文將該病的最新研究進展進行了簡要綜述。

1 檢測方法

BVDV 的檢測方法有電鏡檢查、間接免疫熒光染色技術(shù)（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）、反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）、基因芯片等技術(shù)。每種方法都有其自身的特點，電鏡檢查對設(shè)備的要求較高，只適用于實驗室檢查；IFA技術(shù)由于檢測周期長，操作繁瑣，固不適用于規(guī)?；龅拇笠?guī)模篩查；RT-PCR 由于對操作人員素質(zhì)要求較高，檢查成本高，不適合用于生產(chǎn)中?；蛐酒瑑r格昂貴，篩查成本極高，ELISA 方法因準確率高、成本低，適用于大規(guī)模檢測等特性而被廣泛用于生產(chǎn)中[4-5]。

1.1 電子顯微鏡檢查

將采集病料研磨，離心（約4 500 r/min）后，取上清液，濾器（0.22m）濾過得到BVDV 液，將病毒液加入單層易感細胞，孵育約1 h，孵育期間每隔15 min 晃勻1 次，保持細胞與病毒液充分接觸，使得病毒充分的吸附在易感細胞表面；1 h后棄去病毒液并加入含有3.5%馬血清的 DMEM 作為維持液；約3 d 后（72 h 左右），將細胞反復(fù)凍融，并使用磷酸鎢染色在電鏡下觀察病毒顆粒。由于磷酸鎢的原子較有機物中的C、H 原子更易能阻擋電子，電子無法透過磷酸鎢染色的區(qū)域。因此，在電鏡下黑色區(qū)域為磷酸鎢，而BVDV 顆粒的顏色則較淺或者無色；可以觀察到成熟的BVDV粒子呈球形，病毒顆粒直徑約46 nm[6]。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附實驗，是利用抗原體之間專一性結(jié)合的特點對待檢測物進行檢測。由于結(jié)合于固相載體的抗原或抗體仍具有生物學(xué)活性，配合酶聯(lián)抗體呈色反應(yīng)，根據(jù)其顯色與否來判斷抗原或抗體是否存在，然后再進行定性分析，也可利用析光度進行定量分析。酶聯(lián)免疫吸附試驗方法包括間接ELISA，雙抗體夾心、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA、抗體捕捉ELISA、斑點 ELISA、布 ELISA 等方法。

雙抗體夾心法屬于酶聯(lián)免疫吸附試驗的一種。將含有已知對BVDV 具有特異性的抗體吸附在固相載體上。加待測抗原，如兩者是特異的，則發(fā)生結(jié)合，洗去多余待檢抗原，加入與待測抗原呈特異反應(yīng)的酶聯(lián)抗體，形成“夾心”；加放顯色劑孵育顯色，用酶標儀檢測每個孔的吸光度，按照說明書上給出的公式判斷是否有效并確定樣品中是否含有BVDV 抗原。

1.3 免疫熒光染色技術(shù)（IFA）

免疫熒光染色技術(shù)的基本原理并不復(fù)雜，用具有熒光效應(yīng)的標記物標記特異性抗體，由于抗原抗體特異性反應(yīng)，可以通過標記物判斷出抗原所在的位置和抗原的量。熒光素標記的特異性抗體可用于檢測臨床樣本中是否含有BVDV，只有BVDV所具有的抗原表位和熒光素所標記的特異性抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，IFA 才具有有效性。

免疫熒光技術(shù)分為間接免疫熒光技術(shù)和直接免疫熒光技術(shù)，間接免疫熒光技術(shù)通過特異性一抗和相應(yīng)抗原特異性結(jié)合，結(jié)合后用PBS 洗去未結(jié)合的一抗，再加入和一抗特異性結(jié)合標記有熒光素的二抗，在熒光顯微鏡下觀測熒光；直接免疫熒光技術(shù)在一抗上標記有熒光素，和抗原特異性結(jié)合后，PBS 洗滌，直接在熒光顯微鏡下觀察熒光。兩種方法相比較而言，直接免疫熒光法比間接免疫熒光法要更加簡便，但由于間接熒光檢測法可能會出現(xiàn)非特異性染色，準確性比直接熒光檢測法差[7]。

抗原抗體結(jié)合形成引物二聚體后，通過洗滌除去未與相應(yīng)抗原結(jié)合的帶有熒光素標記的抗體，再通過熒光顯微鏡觀察，如若視野中出現(xiàn)熒光，則該樣本就被該種病毒所侵襲；反之，該樣本未被該病毒所侵襲。

1.4 基因芯片檢測方法

基因芯片的測序原理是雜交測序，雜交測序的基本原理就是堿基互補配對原理。通過人工設(shè)計并合成一組已知序列的寡核酸探針，人工合成的寡核苷酸序列和待檢測基因遵循堿基互補配對原則進行結(jié)合，即在一塊固態(tài)基片表面固定已知序列的寡核苷酸，當待檢測溶液中帶有熒光標記的待檢核酸序列與基因芯片上對應(yīng)位置的寡核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，可確定待檢基因的序列。魏春霞等[8]報道了牛布魯氏菌病、結(jié)核、炭疽、口蹄疫、病毒性腹瀉黏膜病、副流感、傳染性鼻氣管炎的可視化基因芯片檢測方法。

1.5 反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）

通過Trizol 提取試劑盒提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。以 cDNA 為模板進行PCR 擴增，獲得目的條帶后送樣測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI 比對。采用此種方法可以用于特異性檢測病料組織、體外細胞培養(yǎng)物中的BVDV，檢測結(jié)果可與豬瘟、邊界病病毒以及BVDV 不同毒株區(qū)分出來，準確性極高，且具有較高的區(qū)分度。

1.6 納米PCR檢測方法

納米PCR 技術(shù)是新型的PCR 技術(shù)。米麗娟等[9]發(fā)現(xiàn)納米金粒子的濃度和酶量比值的不同，PCR 反應(yīng)體系中DNA 聚合酶的活性會發(fā)生相應(yīng)的改變，由此推測 DNA 聚合酶會與納米金之間結(jié)合是可逆性的，通過動態(tài)調(diào)節(jié)聚合酶的更替頻率，進而可影響聚合酶活性的PCR 的擴增結(jié)果。由于納米金良好的導(dǎo)熱性，在PCR 反應(yīng)體系中加入納米金后可以使其更快達到目標溫度，降溫時也能更快地降溫，使得升溫、降溫過程變短，從而減少了非特異性擴增物的產(chǎn)量，使得PCR反應(yīng)的特異性升高，縮短了PCR 的反應(yīng)時間[10-15]。

2 牛病毒性腹瀉的凈化

2.1 世界各國對牛病毒性腹瀉的凈化措施

BVDV 在世界范圍內(nèi)流行程度有所有同。據(jù)報道，美國牛群中BVDV 的血清學(xué)檢測陽性率約50%；加拿大有些地區(qū)血清學(xué)陽性率甚至超過80%；澳大利亞牛群中BVDV的血清學(xué)檢測陽性率為89%，以上地區(qū)的血清學(xué)陽性率平均為 70 %，而臨床發(fā)病率為24%～47%。北美地區(qū)分離到的BVDV 毒株50%以上為 BVDV2（基因 2 型），而歐洲分離株的 90%是BVDV1（基因 1 型）[16-17]。

世界各國對BVD 防控凈化措施存在很大差異。其中，瑞士、挪威、丹麥等北歐發(fā)達國家對BVD 的重視程度較高，由國家引導(dǎo)對BVD 進行防控與凈化，取得了良好的效果；新西蘭、美國等國家部分地區(qū)完成了對BVD 的凈化；而從整體來看，我國BVD 的流行還未得到有效控制。

當缺乏抗體保護的牛受到BVDV強毒株感染后，會引發(fā)嚴重的臨床癥狀[18-19]。BVDV 在牛體內(nèi)經(jīng)過一段短暫的潛伏期后，就可能發(fā)展成病毒血癥，約在感染后4～15 d，BVDV 會隨著動物的唾液、精液、乳汁等分泌物排出體外[20]。PI 牛與急性BVDV 感染牛相比，其病毒血癥會更嚴重、更持久。PI 牛體內(nèi)的病毒會隨著分泌物而排出體外，與分泌物相比，通過糞便所排毒量是最少的[21-23]。妊娠母牛被BVDV 感染后可能導(dǎo)致流產(chǎn)，流產(chǎn)的胎兒、胎盤、胎液中都可檢測到BVDV[1]。Traven 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，BVDV 血清陰性牛與一只PI牛直接接觸僅1 h就會通過水平傳播途徑感染BVDV，BVDV 的疫苗注射對于BVD 的防控十分重要[25-26]。

2.2 我國凈化牛病毒性腹瀉的相關(guān)建議

BVDV 在牛群中的傳播主要是以PI 牛為重要的傳染源，所以，淘汰PI 牛是控制BVDV 感染及傳播的首要任務(wù)。母牛可以通過母嬰傳播將病毒傳染給胎兒，所以，繁殖季節(jié)來臨前要篩查出牛群的PI母牛，并將其清除干凈。同時也要采取必要措施使感染BVDV病牛和PI牛盡可能遠離繁殖種群，防止發(fā)生水平傳播使懷孕母牛感染，盡而發(fā)展為垂直傳播。養(yǎng)牛場應(yīng)對所有參加繁殖的母牛進行檢測，以確保所產(chǎn)的小牛為BVDV 陰性牛。PI ?？梢酝ㄟ^全血（白細胞）或其他組織分離和檢測到BVDV，而處于潛伏期未顯示出臨床癥狀的帶毒牛，可以通過IPMA、IHC、ELISA和PCR方法加以檢測[27]。

對BVDV的防控和凈化的基本方案有2 種，一種是“篩查-淘汰”方案，即對牛群中做抗原篩查，篩選出所有抗原呈陽性的牛，并予以淘汰，徹底清除BVDV的傳染源。如篩查-淘汰后較長一段時間內(nèi)監(jiān)測不到陽性牛，說明篩查-淘汰方案成功，否則將繼續(xù)進行篩查淘汰，直至測底清除為止。該策略在瑞典、挪威等國家已取得成功，此種方案適用于養(yǎng)牛密度較低的地區(qū)，同時需要配合實施嚴格的生物安全管理和防疫制度，才能徹底凈化BVDV。另一種是“免疫+淘汰”方案，其核心是用疫苗高強度免疫，同時加強血清抗原檢測，在免疫后一段時間進行血液抗原檢測，發(fā)現(xiàn)抗原呈陽性個體則立即清除，同樣需要配合嚴格的生物安全控制和防疫制度，逐步實現(xiàn)BVDV 的凈化。這一策略在美國和德國已取得成功，適用于養(yǎng)牛密度較高的地區(qū)。

從我國國情來看，既有大規(guī)模養(yǎng)殖，也有小規(guī)模養(yǎng)殖。因此，對于養(yǎng)殖規(guī)模小而分散的地區(qū)，可采取“篩查-淘汰”方案，其凈化速度快、損失?。粚τ陴B(yǎng)殖規(guī)模大而集中的地區(qū)可以采取“免疫+淘汰”方案，通過免疫可以對健康牛進行有效保護，從而避免造成更大損失。

2.2.1 建立有效的免疫 疫苗免疫在實現(xiàn)BVDV 凈化的過渡階段中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因為在逐步凈化BVDV 的過程中仍然存在一過性感染，或者逃避過監(jiān)測的PI 牛，在凈化過程中仍然不斷感染健康牛群，給凈化帶來了更大的難度。因此，在凈化BVDV 的過程中，仍然需要加強BVDV 的免疫。但是，血清的抗體檢測要在免疫之前進行，因為注射疫苗后會產(chǎn)生抗體干擾檢測結(jié)果。注射疫苗后，采取免疫組化方法來檢測BVDV 的感染牛。

2.2.2 清除PI 牛 牛病毒性腹瀉病群內(nèi)流行的主要傳播源就是PI 牛。由于PI 牛對病毒的抵抗力幾乎為零，病毒在PI 牛體內(nèi)的繁殖極為迅速，使得PI 牛成為病毒培養(yǎng)的溫床，同時PI牛向周圍環(huán)境中散播大量的病毒顆粒，使得病毒在牛群中傳播。因此，篩查并清除PI 牛是有效控制和凈化BVDV 的最佳方法[28-29]。

目前，采用皮膚免病組化法是對牛群進行BVDV凈化最好的方法。BVDV 一過性感染牛的內(nèi)臟器官經(jīng)免疫組化檢驗呈陽性，當采用皮膚樣品檢測時，一過性感染牛的樣品不著色或者僅僅角質(zhì)細胞和濾泡著色，但PI牛的表皮所有細胞均著色，包括毛囊和毛球。該方法適用于區(qū)分PI 牛和一過性感染的牛。

免疫組化檢驗適用于對任何日齡牛群的篩查。免疫組化法檢驗皮膚樣品，不會因使用BVDV弱毒疫苗免疫動物而導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。此外，皮膚樣品易采集、方便操作和運輸，對于PI 牛的檢驗敏感且具有特異性，因此，對PI 牛的淘汰具有重要意義。

當被檢驗牛的臨床癥狀和病史與免疫組化法檢驗結(jié)果不一致時，還應(yīng)采用其他檢驗方法進行重復(fù)檢驗。應(yīng)用病毒分離或者PCR 方法鑒定PI 牛，需要至少在3 d后對陽性樣本進行二次檢驗，才能區(qū)別其是BVDV一過性感染還是持續(xù)性感染，因為牛感染BVDV可能會自愈，并不一定是持續(xù)性感染。

2.2.3 生物安全 大型養(yǎng)殖場引進國外的優(yōu)良種牛、精液、卵子等生物產(chǎn)品時，必須進行嚴格的檢疫合格方可入場使用，堅決杜絕外源感染。BVDV 感染不僅對多種動物（其中也包括野生動物）健康造成直接影響，而且它還是牛源和豬源生物制品潛在污染源?！吨袊幍洹返谌浚?010 版）將BVDV 列為犢牛血清的必檢項目，也是我國活牛進口重點檢疫的疫病之一[30]。

精液 在配種過程中，未經(jīng)檢疫的種公牛的精液，存在種公牛為PI 牛的風(fēng)險。根據(jù)對PI 牛精液中BVDV含量檢測結(jié)果可知，其精液中 BVDV 排出量很高(104～106TCID50/mL)[31]。當含有 BVDV 的精液進入母牛子宮，母牛體內(nèi)不具有BVDV 抗體時，母牛的受孕率就會大幅度降低；若母牛體內(nèi)含有BVDV 抗體，則BVDV 對母牛的影響不大，仍可受孕[32]。規(guī)模化養(yǎng)牛場，種公牛和母牛之間的主要傳播途徑為本交或人工授精[33]。若使用PI 種公牛自然配種，具有抗體的母牛（血清學(xué)呈陽性的母牛）能順利受孕且產(chǎn)出健康的犢牛[34]。如果感染BVDV 的種公牛精液用于人工授精時，盡管多數(shù)血清學(xué)陽性的懷孕牛不會生出PI 牛，但多數(shù)沒有BVDV 抗體的母牛將被BVDV 感染[35]。

BVDV 感染，病毒會潛伏在生殖腺和附睪內(nèi)，因此，對于感染BVDV 后痊愈的牛，或者那些對BVDV具有免疫力的牛（血液中含有BVDV抗體的牛），即使血清學(xué)檢測是陰性的牛，用作種用時仍需要檢測精液是否含有BVDV[36-37]。雖然PI 種公牛通過精液排毒延長了排毒期，但一過性感染BVDV的種公牛從精液中排毒時間是在痊愈后10～14 d，而且一過性感染的公牛比PI 公牛的精液中BVDV 的滴度要低得多[38]。由此可見，種公牛感染BVDV痊愈后最好在半個月之后再留作種用，如果經(jīng)濟允許最好將其淘汰。

胚胎移植 胚胎移植是BVDV 在大型養(yǎng)牛場傳播的一種途徑，如果胚胎的接受者是PI 母牛，移植的胚胎將經(jīng)過垂直傳播成為PI 犢牛[39]。

污染物 PI ?？梢酝ㄟ^體液傳染BVDV 給易感牛。使用給PI 牛抽過血的針頭未經(jīng)過任何消毒就直接給易感牛進行肌肉注射，便可以使易感牛感染BVDV[40]。若將經(jīng)PI 牛使用過的鼻鉗再給健康牛使用，便有機會使得健康牛感染BVDV。BVDV 也可能經(jīng)過觸診套筒從PI 母牛傳播給其他易感母牛[40]。

蚊蟲叮咬 試驗表明，蚊蟲也可能傳播BVDV。當50 只蜱蠅在持續(xù)性感染牛體表停留5 min 后，在15 min內(nèi)叮咬未感染BVDV的健康牛，就可以完成BVDV的傳播[40-41]。在實際生產(chǎn)中，應(yīng)注意蚊蟲的殺滅工作。

牛副產(chǎn)品 近年來，牛血清和生物制品中檢出BVDV 污染的情況并不少見，其中進口胎牛血清和國產(chǎn)胎牛血清、小牛血清及豬瘟疫苗等生物產(chǎn)品均檢出過BVDV 病毒的核酸或者抗原物質(zhì)。其中，國產(chǎn)胎牛血清、含牛血清的細胞培養(yǎng)物和進口牛血清等牛副產(chǎn)品中檢測出BVDV 的陽性率高達80%，以MDBK（牛腎細胞）細胞中檢出BVDV 感染的概率最高，占80%以上。推測其最根本的原因可能就是培養(yǎng)細胞用的胎牛血清被BVDV 污染，從而導(dǎo)致了MDBK 細胞和其他易感細胞被BVDV 所污染[38-41]。

我國很多小型養(yǎng)殖戶經(jīng)常使用一些自家疫苗，優(yōu)點是免疫效果良好、抗原特異性強、針對性強，但小養(yǎng)殖戶由于操作或者檢測消毒不規(guī)范，導(dǎo)致疫苗質(zhì)量并不高，經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗，并可能導(dǎo)致牛群中出現(xiàn)BVDV 大規(guī)模流行，帶來嚴重的經(jīng)濟損失。

采用疫苗接種、加強監(jiān)測、淘汰持續(xù)感染和提高動物免疫力等綜合措施是控制和根除BVDV 的最好手段。德國、瑞士、挪威、蘇格蘭等國家均已實現(xiàn)BVD 的凈化，美國通過疫苗免疫也基本控制了BVD，其中部分地區(qū)開始逐步實施凈化計劃。

2.2.4 戰(zhàn)略管理凈化 BVDV 凈化是一項長期的任務(wù)，應(yīng)開展定期的BVDV 血清學(xué)監(jiān)測，了解牛群感染與免疫狀態(tài)、調(diào)整疫苗的接種方案，以期獲得更好的免疫效果，全面提高牛場的防疫管理水平，嚴格控制生物制品的流入并及時控制其他呼吸道及繁殖類疾病，避免因牛的免疫力而成為BVDV 易感牛。

3 小結(jié)

牛病毒性腹瀉病在我國流行廣泛，主要原因是對牛BVDV的檢測不嚴格，加上近幾年養(yǎng)牛業(yè)的飛速發(fā)展導(dǎo)致活牛的流動增加。一些大型養(yǎng)牛場存在PI 牛，PI 牛是BVD 的最主要傳染源。其中，PI 牛由于免疫缺陷更容易感染其他疾病，造成牛群內(nèi)流行其他牛病。感染孕期母?？稍斐赡概Ａ鳟a(chǎn)或者產(chǎn)下PI 牛。BVD所造成的經(jīng)濟損失不可估量，因此，對規(guī)?；B(yǎng)牛場BVD 牛的檢測和凈化是極為重要的。