全收糞法和三氧化二鉻法測定藍(lán)狐對不同硒含量日糧的營養(yǎng)物質(zhì)消化率

劉可園，劉晗璐，王卓，張婷，李光玉

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

研究動物營養(yǎng)物質(zhì)消化率時，需要測定動物的采食量和排糞量[1-2]。全收糞法測定的消化率結(jié)果比較準(zhǔn)確，但是比較費時費工，尋找一種可以替代其的方法是十分必要的。指示劑法因操作簡單、只需要收集較少的糞便就可[3]，而被作為替代全收糞的方法。這種指示劑必需滿足在胃腸道內(nèi)不可消化吸收；不具有生理功能；不被飼料或組織細(xì)胞顆粒吸附[4]；是一種惰性物質(zhì)，被動物攝入后幾乎不發(fā)生變化地從消化道排出[5]。指示劑分為內(nèi)源和外源2 種，前者是指飼料本身含有的不能被動物體吸收的物質(zhì)，而后者是在飼料中添加不能被動物體吸收的物質(zhì)。Kane 等[6]為尋找一種能夠準(zhǔn)確計算放牧草食動物采食量和消化率的方法，分別分析內(nèi)源指示劑（木質(zhì)素、植物色素和不可消化蛋白質(zhì)）、外源指示劑[三氧化二鉻（Cr2O3）、硫酸鋇]、放射性同位素和染料在飼料和糞便中的含量，通過計算發(fā)現(xiàn)以植物色素、不可消化蛋白質(zhì)和Cr2O3為標(biāo)記物得到的結(jié)果與常規(guī)方法相同。Hill 等[2]研究指出Cr2O3可作為研究犬營養(yǎng)物質(zhì)小腸消化率的指示劑。Carciofi 等[4]研究也發(fā)現(xiàn)以Cr2O3法和全收糞法測定犬的營養(yǎng)物質(zhì)消化率結(jié)果相近。Cr2O3是最早被用于測定飼料消化率的外源標(biāo)記物，但其回收率受到飼料特性[7]、動物種類[3]、投給方式[8]和測定方法[4]等多種因素的影響。

硒是動物體必需的微量元素，是硒代半胱氨酸的組成成分，是一些抗氧化酶（包括谷胱甘肽過氧化物酶和某些硫氧還蛋白氧化還原酶等）的活性中心[9]，可以清除自由基，保護細(xì)胞膜免遭損害。許多研究表明，日糧中添加硒可以顯著提高畜禽對干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的消化率[10-14]。目前，還沒有關(guān)于利用Cr2O3法測定藍(lán)狐營養(yǎng)物質(zhì)消化率的報道，日糧中硒含量是否對Cr2O3法測定結(jié)果有影響還不清楚。

本研究利用全收糞法和Cr2O3法測定藍(lán)狐對不同硒含量日糧中各種營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，研究硒對藍(lán)狐消化各種營養(yǎng)物質(zhì)的影響，同時比較日糧中硒含量不同時全收糞法和Cr2O3法測定藍(lán)狐對干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物消化率的差異和相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組及飼養(yǎng)管理

選取 120 日齡左右、體重相近（5.14±0.03 kg）的健康雄性藍(lán)狐30 只，隨機分為2 組，每組15 個重復(fù)，每個重復(fù)1 只。參照NRC（1982）[15]和中國飼料成分與營養(yǎng)價值表（2017年第28 版）[16]，以膨化玉米、豆粕、玉米蛋白粉、肉骨粉和雞油等為主要原料，配制基礎(chǔ)日糧（硒含量為0.096 mg/kg）以及添加0.2 mg/kg 硒（添加形式為含硒量為1%的甘氨酸硒）的試驗日糧?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。試驗開始于9 月中旬，試驗期為35 d，前7 d 為適應(yīng)期，在農(nóng)業(yè)部長白山野生生物資源重點野外科學(xué)觀測站開展。根據(jù)動物習(xí)性將干粉飼料與水按照一定比例飼喂，每天07: 00和15:00 各飼喂1 次，自由飲水。試驗動物單獨飼養(yǎng)于常規(guī)籠（1.0 0.8 0.8 m）中，按照常規(guī)進行疫苗接種和飼養(yǎng)管理。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Ingredient and nutritional level of the basal diet （g/kg DM）

1.2 消化代謝試驗

1.2.1 全收糞法 飼喂試驗日糧27 d后，將接糞盤放置到每只動物籠子下，收集連續(xù)3 d（72 h）的糞便。每天收集的糞便樣本稱重后，按照鮮重5%加入10%硫酸溶液和少量甲苯防腐，20 ℃保存?zhèn)溆?。? d 收集的糞便樣本混合均勻后，先在80 ℃下殺菌2 h，然后降到65 ℃烘干至恒重，粉碎后過40 目篩，然后測定各營養(yǎng)物質(zhì)含量。

1.2.2 Cr2O3法 全收糞法試驗結(jié)束后，參照Carciofi等[4]的方法，將純度為99%（w/w）Cr2O3粉末均勻混合至干粉日糧中，使日糧中的Cr2O3含量為3.5 g/kg 左右，并準(zhǔn)確記錄Cr2O3的添加量。在飼喂混合Cr2O3日糧1 d 后，在糞盤中選取幾個點連續(xù)3 d 收集糞便，每天收集約50 g，稱重，將3 d 收集的糞便混合均勻，按照全收糞法處理樣本。同時記錄連續(xù)3 d 糞便的總重，用于計算Cr2O3回收率。

1.3 樣本測定

參照AOAC（2003）[17]方法，測定飼料和糞便樣本干物質(zhì)（DM）、粗蛋白質(zhì)（CP）、粗脂肪（EE）以及飼料中的鈣（Ca）和總磷（TP）含量。飼料中的硒參照AOAC（2000）[18]的方法進行處理。硒標(biāo)準(zhǔn)液為1 mg/mL 1%HNO3溶液（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心），然后用0.1 mol/L HCl稀釋成10g/L 備用。經(jīng)過處理的飼料和標(biāo)準(zhǔn)液使用原子熒光光譜儀（Anton Paar，澳大利亞）進行測定。飼料和糞便中鉻含量測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB5009.123—2014）的方法利用原子吸收光譜儀進行測定。

1.4 消化率計算

1.4.1 全收糞法 碳水化合物含量由干物質(zhì)總量減去粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分總量求得。各營養(yǎng)物質(zhì)消化率及氮代謝相關(guān)指標(biāo)公式如下：

1.4.2 Cr2O3法 Cr2O3回收率和消化率計算公式如下：

其中，A 為飼料中某成分的含量（%）；A1為糞便中相應(yīng)成分的含量（%）；B 為飼料中指示劑的含量（%）；B1 為糞便中指示劑的含量（%）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用 SAS 9.2 統(tǒng)計軟件的GLM 過程進行單因素方差分析，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，P＜0.05 為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著 利用PROC CORR 過程，對全收糞法和Cr2O3法測定的數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析，使用Pearson方法進行檢驗，P＜0.05表示顯著相關(guān)，P＞0.05 表示不相關(guān)。利用PROC REG過程對2 種方法測定數(shù)據(jù)進行一元回歸分析，并利用最小二乘法進行參數(shù)估計，變異系數(shù)（CV）和決定系數(shù)（R2）對方程進行檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料硒含量對糞便干物質(zhì)組成和Cr2O3回收率的影響

從表2 可以看出，在藍(lán)狐日糧中添加硒對糞便的排出量沒有顯著的影響（P＞0.05），而對糞便中Cr2O3的回收率有顯著的影響，添加硒組糞便中Cr2O3的回收率顯著低于基礎(chǔ)日糧組（P ＜0.05）。

表2 糞便干物質(zhì)和Cr2O3 的回收率Table 2 Recovery rate of fecal matter and Cr2O3

2.2 全收糞法和Cr2O3法測定藍(lán)狐對不同硒含量日糧消化率

由表3 可知，日糧中添加硒能夠顯著地提高藍(lán)狐營養(yǎng)物質(zhì)的消化率（P ＜0.05），且全收糞法測得的消化率較Cr2O3法測得的低（P ＜0.05）。用全收糞法測得的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的消化率受到飼料硒含量的顯著影響（P ＜0.05），而用Cr2O3法測得的脂肪消化率差異顯著（P ＜0.05），其他各物質(zhì)的消化率差異不顯著（P ＞0.05）。利用Cr2O3法得到的各營養(yǎng)物質(zhì)消化率均高于全收糞法，干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物消化率在基礎(chǔ)日糧組分別高32.9%、14.2%、4.4%和5.9%，添加硒組分別高26.2%、14.2%、3.5%和6.1%。

表3 全收糞法和Cr2O3 法測定的藍(lán)狐對不同硒含量日糧消化率Table 3 Digestibility in different dietary selenium supplementation by total feces collection and Cr2O3 methods for bule foxes （%）

2.3 全收糞法和Cr2O3法測定的各種養(yǎng)分消化率的相關(guān)性

由表4 可知，基礎(chǔ)日糧組2 種方法測定的各營養(yǎng)物質(zhì)消化率均顯著正相關(guān)，且回歸分析得到的方程的決定系數(shù) R2在0.5 左右。添加硒組2 種方法測定的干物質(zhì)消化率顯著相關(guān)，其他營養(yǎng)物質(zhì)消化率不相關(guān)，得到的回歸方程的R2值較低。以全收糞法測定的各營養(yǎng)物質(zhì)消化率的數(shù)據(jù)為自變量、Cr2O3法測定的相應(yīng)數(shù)據(jù)為因變量得到的一元回歸方程的變異系數(shù)差別較大，其中干物質(zhì)和脂肪消化率方程的較小，而蛋白質(zhì)和碳水化合物消化率方程的較大。

表4 全收糞法和Cr2O3 法測定的各種養(yǎng)分消化率的相關(guān)性Table 4 Correlation of various nutrient digestibility measured by the total feces colletion method and Cr2O3 method

3 討論

利用糞中指示劑含量估測營養(yǎng)物質(zhì)消化率準(zhǔn)確性受許多因素的影響[21]，其中指示劑在糞中的回收率是否接近于100%是最主要的因素[19]。本研究中糞便中Cr2O3的回收率不足80%，其中添加硒組回收率還不足70%，而且個體間差異較大，這是導(dǎo)致利用Cr2O3法測定的結(jié)果較全收糞法高的主要原因。陳瑤等[19]使用全收糞和指示劑法測定閹牛對8 種不同日糧有機物的消化率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糞便中Cr2O3的回收率不同動物個體間差異也較大。

鐘偉等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在藍(lán)狐日糧中添加適量的以維生素、礦物質(zhì)元素和益生菌制劑等為主要成分的預(yù)混合飼料，能夠促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用；飼料中添加硒可提高藍(lán)狐各營養(yǎng)物質(zhì)的消化率。在其他家畜禽的研究中也得到了相似的結(jié)果，如Adkins等[10]和Nuijten等[11]研究表明在豬飼料中添加硒可以顯著提高干物質(zhì)的消化率；Malhi[12]研究發(fā)現(xiàn)山羊日糧中添加硒可顯著提高干物質(zhì)和蛋白質(zhì)的消化率；Liu 等[13]在藍(lán)狐冬毛期日糧中添加不同水平的硒和維生素E，發(fā)現(xiàn)硒對雄性藍(lán)狐的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂肪的消化率有顯著的影響；弓劍等[14]研究發(fā)現(xiàn)在奶牛日糧中添加有機硒可顯著提高粗脂肪消化率，粗蛋白消化率也有一定的提高。

任慧波等[21]利用全收糞法和Cr2O3法測定犢牛液體飼料的養(yǎng)分消化率，發(fā)現(xiàn)Cr2O3法測定的粗蛋白、粗脂肪和有機物的消化率均高于全收糞法得到的結(jié)果，這與該研究得到的結(jié)果相一致。同時，任慧波等[21]分析了這2 種方法測定的結(jié)果呈中度相關(guān)，本研究中日糧中無硒添加組也得到了相似的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)，Cr2O3作為指示劑具有回收率變異大[22-23]、在體內(nèi)可以氧化不飽和脂肪酸[5]的缺陷，而且回收率還受到日糧特性的影響，當(dāng)日糧中粗蛋白質(zhì)的消化率較高、粗纖維較低時，回收率較高[7]。本研究中日糧中添加硒提高了藍(lán)狐粗蛋白質(zhì)的消化率，Cr2O3的回收率反而較低。這可能是由于藍(lán)狐日糧中多不飽和脂肪酸（PUFA）含量較高，硒的抗氧化作用可以更好地保護飼料中PUFA 免受空氣的氧化，從而使得添加硒組藍(lán)狐食入的PUFA較多，動物機體消耗的Cr2O3相對較多，導(dǎo)致回收率降低。添加硒組2 種方法測定結(jié)果的相關(guān)性低于無硒添加組，這也是糞便中Cr2O3回收率低導(dǎo)致的。鉻與其他的礦物質(zhì)之間也存在著拮抗作用[24]。李靜等[25]研究硒和鉻對蛋雞脂質(zhì)代謝及雞蛋硒含量的影響發(fā)現(xiàn)，硒與鉻在動物體內(nèi)存在一定的拮抗作用，原因是硒與鉻能形成溶解度很低的復(fù)合物，這可能會進一步地促進Cr2O3在體內(nèi)的消耗，使添加硒組糞便中鉻的回收率較無硒添加組低，進而導(dǎo)致2 種方法測定的結(jié)果間相關(guān)性低。

4 結(jié)論

本試驗中，利用Cr2O3法測定的藍(lán)狐對不同硒含量日糧的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的消化率較全收糞法測定的結(jié)果高。日糧中硒含量為0.096mg/kg時，2 種方法測定的結(jié)果顯著相關(guān)。藍(lán)狐日糧中添加硒會降低糞中Cr2O3的回收率。