真菌致齲機(jī)制的研究進(jìn)展

張璐瑾，商慶龍

在人類口腔中存在著由700多種微生物構(gòu)成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，這個(gè)生態(tài)系統(tǒng)包括大量細(xì)菌和少量真菌[1]，兒童和健康成年人口腔真菌分別有46種和101種[2-3]。目前認(rèn)為齲齒發(fā)生與口腔微生物群落組成和相對豐度的變化有關(guān)[4]。細(xì)菌致齲的研究較多，包括生物膜、細(xì)菌間協(xié)同致齲等，而口腔真菌致齲的研究較少，真菌在齲病發(fā)生過程中的作用尚不清楚，本文就真菌致齲的相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

1 核心口腔真菌

由于部分真菌無法培養(yǎng)，不同真菌個(gè)體間存在巨大的差異，真菌數(shù)據(jù)庫不完善，近年來在真菌致齲研究中引入了“核心口腔真菌”的概念[5]。“核心口腔真菌”是指在超過20%的抽樣樣本中普遍存在的口腔真菌群的核心成分，目前包括了假絲酵母菌屬、枝孢屬、曲霉菌屬、鐮胞菌屬、鏈格孢菌屬、隱球菌屬和短梗霉菌屬等被公認(rèn)的7種真菌[3,6-7]。其中，假絲酵母菌屬是目前主要的研究對象，但是假絲酵母菌屬與齲病的關(guān)系尚不清楚。核心真菌群在齲病中所發(fā)揮的作用也有待闡明。

2 經(jīng)典的致齲機(jī)制研究

2.1 齲病

齲病是細(xì)菌等因素引起的慢性、進(jìn)行性牙齒硬組織破壞的疾病[8]。在齲病發(fā)生過程中，糖類助長了相關(guān)病原體增殖，致使生物膜微環(huán)境酸化，使牙齒硬組織脫礦，并破壞有機(jī)質(zhì)，導(dǎo)致齲齒[9]。在臨床上，齲病可進(jìn)展至牙髓炎、牙周感染等。齲病的影響因素還包括宿主易感性、環(huán)境因素、教育和社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況等[10-11]。齲病治療包括了致齲菌抑制、脫礦抑制與再礦化[12]。

2.2 細(xì)菌致齲的支持證據(jù)

在齲齒中分離到的多種口腔細(xì)菌被作為齲病潛在的病原體，其中，變異鏈球菌、糞腸球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌和唾液鏈球菌等參與了生物膜形成[13]，粘附在牙體硬組織表面并使局部酸化[14]。齲病沒有特定的病原體，如變異鏈球菌是齲齒發(fā)生與發(fā)展的潛在參與者[15]，但變異鏈球菌不存在時(shí)，韋格斯卡多維亞菌也與幼兒齲病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[16]。

2.3 致齲研究中遇到的問題

首先，單獨(dú)抗細(xì)菌治療無法治愈齲病[17]。常規(guī)齲病的抗細(xì)菌治療使口腔齲病相關(guān)細(xì)菌數(shù)量減少，但病灶中卻殘留大量真菌如假絲酵母菌，輔以抗真菌藥物有助于齲病治療[18]。其次，部分乳桿菌有抑制齲齒作用。格氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌等乳桿菌屬細(xì)菌能夠抑制致齲病原體生存、生長和增殖[19]，通過聚集形成屏障，抑制病原菌的粘附作用[20]。乳酸菌屬產(chǎn)生的細(xì)菌素及生物表面活性劑和丁酸鈉等代謝物能抑制假絲酵母菌菌群，副干酪乳桿菌能通過調(diào)控關(guān)鍵基因TEC1和UME6顯著下調(diào)白假絲酵母菌菌絲形成[19-21]。隨著研究的深入，細(xì)菌之外的病原體作用也受到了關(guān)注。

3 真菌致齲的研究

3.1 真菌通過產(chǎn)酸致齲

3.1.1 部分真菌具有較高產(chǎn)酸性及耐酸性 白假絲酵母菌合并高糖飲食可引起齲病[2]。白假絲酵母菌能產(chǎn)生乳酸和其他有機(jī)酸[22]。假絲酵母菌通過溶解羥基磷灰石引起牙釉質(zhì)脫礦[23]，這種溶解能力高于變異鏈球菌[2]。另一方面，細(xì)胞膜H+-ATPase使白假絲酵母菌具有極高抗酸性[24]，與對照組相比，患齲病例中分離的白假絲酵母菌菌株的基因型不同，抗酸性更強(qiáng)[25]。

3.1.2 真菌增加多物種混合生物膜酸性 高水平蔗糖增強(qiáng)了假絲酵母菌與齲病相關(guān)細(xì)菌之間的相互作用以及與牙體的物理粘附性，細(xì)胞外間質(zhì)產(chǎn)量和微生物生物量，促進(jìn)了生物膜形成。白假絲酵母菌的存在增加了白假絲酵母菌-變異鏈球菌混合生物膜的酸性[22,26]，也使白假絲酵母菌-粘性放線菌混合生物膜pH值明顯下降[22]。

3.2 真菌通過參與生物膜形成致齲

3.2.1 真菌參與生物膜結(jié)構(gòu) 真菌在齲壞部位可以單獨(dú)存在，還可以與細(xì)菌形成混合小菌落，以生物膜形式參與致齲過程，生物膜內(nèi)的假絲酵母屬對多種抗真菌藥物的敏感性比游離真菌低1 000倍[19]。白假絲酵母菌和都柏林假絲酵母菌是咬合面和牙根表面齲病病變部分生物膜的重要組分。結(jié)構(gòu)分為兩種形式：一種是由假絲酵母菌菌絲網(wǎng)絡(luò)混合大量絲狀細(xì)菌、球菌和棒狀細(xì)菌組成了貫穿整個(gè)生物膜的區(qū)域，另一種是假絲酵母菌與鏈球菌在生物膜表層形成了玉米棒樣的構(gòu)型，這些鏈球菌包括了格氏鏈球菌和口腔鏈球菌等小群體鏈球菌種(mitis group streptococci，MGS)[27]。

3.2.2 真菌增促進(jìn)生物膜增長 ①粘附性增加，口腔真菌與細(xì)菌的混合感染主要通過增加細(xì)菌胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)產(chǎn)量，以增強(qiáng)微生物之間、微生物與牙面之間的粘附性，促進(jìn)體外生物膜形成。真菌產(chǎn)生EPS，受鏈球菌屬胞外酶—葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase，GTF)誘導(dǎo)分泌，受體為白假絲酵母菌表面甘露聚糖分子。白假絲酵母菌-變異鏈球菌混合生物膜中，EPS總量高于單物種生物膜，白假絲酵母菌細(xì)胞被EPS包被，粘附性增加[28]。白假絲酵母菌在人類唾液中粘附性大幅增加。其分子機(jī)制是口腔唾液中富含脯氨酸的蛋白質(zhì)附著于細(xì)菌，為真菌粘附提供額外受體[28]。② 生物量增加，白假絲酵母菌與變異鏈球菌等齲病相關(guān)細(xì)菌的混合生物膜生物量高于任何單菌種生物膜[26]。分子水平上，白假絲酵母菌與變異鏈球菌共同感染時(shí)，變異鏈球菌抗原Ⅰ/Ⅱ與其對應(yīng)的受體為凝集素樣序列基因(agglutinin-like sequence，ALS)編碼的粘附蛋白是細(xì)菌定植需要的。在蔗糖存在環(huán)境中，抗原Ⅰ/Ⅱ也促進(jìn)白假絲酵母菌定植，并提高了其致病性[29]。格氏鏈球菌細(xì)胞壁蛋白SspB與白假絲酵母菌表面凝集素樣序列基因3(agglutinin-like sequence 3，ALS3)的N端結(jié)合能促進(jìn)共感染，提高了混合生物膜的生物量[30]。③假絲酵母菌菌絲形成，白假絲酵母菌-口腔鏈球菌生物膜通過增強(qiáng)菌絲生長基因(enhanced filamentous growth 1，Efg1)成絲途徑促進(jìn)白假絲酵母菌菌絲形成，Efg1調(diào)節(jié)的粘附素ALS1是這種混合生物膜的關(guān)鍵介質(zhì)。Efg1的缺失不影響白假絲酵母菌-變異鏈球菌混合生物膜中真菌細(xì)胞的數(shù)量，可能因?yàn)槠咸腔D(zhuǎn)移酶B(glucosyltransferase B，GtfB)通過Bcr1獨(dú)立機(jī)制促進(jìn)白假絲酵母菌-變異鏈球菌生物膜形成[26]。

3.3 真菌通過與細(xì)菌協(xié)同致齲

3.3.1 真菌-細(xì)菌協(xié)同作用間接影響齲病發(fā)生發(fā)展 在口腔，真菌與細(xì)菌以及宿主之間在物理、化學(xué)和代謝方面建立了緊密的生態(tài)關(guān)系[31]?？谇徽婢龠M(jìn)了細(xì)菌粘附、增殖和侵襲，而細(xì)菌也影響了真菌的增殖、發(fā)展和侵襲[32]，兩者的協(xié)同作用間接地影響了齲病的發(fā)生發(fā)展。一方面，真菌和細(xì)菌的協(xié)同促進(jìn)了對糖類的分解，代謝產(chǎn)物為真菌和細(xì)菌的生存與增殖提供能量，雙物種生物膜的密度增大，比單物種生物膜形成了更多的微生物菌落，EPS的產(chǎn)量和附著力也明顯提高[22]。細(xì)菌胞外多糖結(jié)合在真菌細(xì)胞表面，發(fā)揮了合成葡聚糖的功能[21]，使白假絲酵母菌成為物理支架拓展胞外多糖的粘附作用。另一方面，某些真菌與細(xì)菌互相提供新的粘附位點(diǎn)。假絲酵母菌通過與早期定植菌(如鏈球菌屬和放線菌屬)結(jié)合在牙齒定植[33]。

3.3.2 真菌-細(xì)菌協(xié)同致齲的分子機(jī)制 ①真菌-細(xì)菌的細(xì)胞壁表面蛋白質(zhì)/受體相互作用：白假絲酵母菌與MGS有特定的細(xì)胞壁表面蛋白質(zhì)/受體，其相互作用受白假絲酵母菌細(xì)胞壁ALS和HWP1粘附素介導(dǎo)，這些結(jié)合也可能涉及到SspA、SspB、ALS1、ALS3、ALS5、O-甘露糖基殘基、天冬氨酸蛋白酶Sap9等[26,28]。②真菌-細(xì)菌的QS系統(tǒng)相互作用：鏈球菌屬與白假絲酵母菌具有一種依賴于自動(dòng)誘導(dǎo)、細(xì)胞密度分子依賴性的毒力特異性，稱為群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)[34]。鏈球菌屬的QS分子影響白假絲酵母菌的毒力：鏈球菌屬Q(mào)S分子包括自體誘導(dǎo)信號(hào)分子-2(autoinducer-2，AI-2)、肽聚糖片段、外源酶和過氧化氫(H2O2)和法尼醇等[26]。與對照組相比，AI-2缺失的鏈球菌屬與白假絲酵母菌的混合生物膜中，白假絲酵母菌菌絲減少30%，AI-2以及其他信號(hào)分子能加強(qiáng)菌絲形成[28]。格氏鏈球菌的營養(yǎng)副產(chǎn)物以及H2O2刺激生物膜內(nèi)白假絲酵母菌菌絲的發(fā)育，口腔鏈球菌激活真菌天冬蛋白酶的表達(dá)[26]。白假絲酵母菌激活變異鏈球菌QS系統(tǒng)：白假絲酵母菌通過法尼醇等QS分子，激活變異鏈球菌的毒力基因和GtfB的生產(chǎn)，并通過提供生長刺激因子和降低氧緊張促進(jìn)鏈球菌增殖[28]。

4 真菌致齲研究中需要解決的問題

4.1 關(guān)注部分真菌具有抑齲作用

真菌產(chǎn)生的抑制因子能抑制細(xì)菌生物膜形成，為真菌提供了競爭優(yōu)勢。出芽短梗霉菌產(chǎn)生的多元醇酯(liamocins)能殺滅或抑制變異鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌，抑制細(xì)菌粘附、生物膜形成及牙菌斑的發(fā)展，并隨著時(shí)間推移去除生物膜，從而抑制齲病，在這個(gè)過程中，不會(huì)破壞口腔正常的微生物[35]。這一類真菌的作用機(jī)制仍需深入研究，以用于預(yù)防和治療齲病。

4.2 推進(jìn)真菌-細(xì)菌相互作用的研究

真菌-細(xì)菌之間的協(xié)同或抑制作用的機(jī)制仍需要深入研究，尤其在產(chǎn)酸、生物膜、生物學(xué)特性和致病機(jī)制等方面的研究。采用多學(xué)科合作研究的模式，推進(jìn)真菌-細(xì)菌相關(guān)研究。采取活細(xì)胞成像技術(shù)，動(dòng)態(tài)反映牙菌斑群落致齲過程；使用基于代謝組學(xué)的功能分析、群體感應(yīng)分析和轉(zhuǎn)錄譜上調(diào)或下調(diào)基因的鑒定以進(jìn)一步研究真菌-細(xì)菌相互作用。

4.3 需要加強(qiáng)口腔真菌菌群的研究

一方面，需要增加對致齲真菌群體的細(xì)分研究，區(qū)分致齲和抑齲類真菌。在齲病病程中，口腔微生物組成與結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[36]，需要對患齲時(shí)口腔真菌菌群的作用進(jìn)行深入研究。選取口腔真菌進(jìn)行全基因組測序，建立齲齒相關(guān)的口腔真菌數(shù)據(jù)庫。另一方面，加強(qiáng)口腔核心真菌菌群的研究，按照菌群類型細(xì)分的原則，深入研究致病性真菌的生物學(xué)和致齲機(jī)制，并對細(xì)菌與真菌在致齲與抑齲中的協(xié)同與抑制機(jī)制深入研究，揭示真菌致齲的機(jī)制。

5 總 結(jié)

口腔真菌致齲作用有研究數(shù)據(jù)支持，但部分真菌和細(xì)菌具有抑制齲病的作用，且機(jī)制尚不清楚。因此，未來的研究需要區(qū)分出致齲真菌和抑齲真菌。口腔真菌與口腔細(xì)菌之間的協(xié)同或拮抗需要進(jìn)一步研究。未來仍需要針對口腔真菌群進(jìn)行深入研究，以探索真菌致齲機(jī)制，為齲病的防控尋找新線索。