不同地區(qū)野生及栽培息半夏的品質(zhì)特性分析*

謝其亮，耿曉桐，汪港，周斌，楊偉明，陳瓊

1.河南羚銳制藥股份有限公司，河南 信陽465550；2.信陽農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽464000

半夏為天南星科植物半夏［Pinellia ternata（Thunb.）Breit.］的干燥塊莖，據(jù)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院統(tǒng)計(jì)，在558種中藥處方中，半夏使用頻率居第22位［1］，并且在抗疫“三藥三方”中有二方均用到了半夏。半夏具有燥濕化痰［2］、降逆止嘔［3］、清痞散結(jié)［4］、鎮(zhèn) 咳［5－6］、鎮(zhèn) 吐［7－9］、抗 腫 瘤［10－11］、抗 生育［12－13］、降血脂［14］、治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病［15］等多種藥理作用。

息半夏是河南省信陽市息縣產(chǎn)旱半夏，因其個(gè)大、粉性足、品質(zhì)優(yōu)良、療效顯著廣受歡迎。多年來，息半夏以質(zhì)量地道，信譽(yù)卓著而馳名中外，在同類藥材中被視為珍品。近年來，隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，息半夏遠(yuǎn)銷日、韓及歐美市場(chǎng)，長(zhǎng)期供不應(yīng)求。但息半夏野生資源被過度采挖，加之農(nóng)田生態(tài)環(huán)境改變，部分地區(qū)息半夏野生資源已瀕臨滅絕［16］，目前栽培息半夏已形成一定的規(guī)模，但尚缺乏整體質(zhì)量評(píng)價(jià)。目前有關(guān)息半夏的質(zhì)量評(píng)價(jià)多為生物堿［17］、水分［18］等有效成分的質(zhì)量分析，但并未有文獻(xiàn)利用總生物堿、總有機(jī)酸、總灰分、浸出物等綜合指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行整體分析。

息半夏化學(xué)成分復(fù)雜，含總生物堿［17］、總有機(jī)酸［2］、蛋白質(zhì)［3］、核苷［2］等成分，其中張科衛(wèi)等［19］發(fā)現(xiàn)半夏總有機(jī)酸成分具有鎮(zhèn)咳、祛痰作用，張啟龍等［20］發(fā)現(xiàn)半夏生物堿類成分對(duì)豚鼠回腸的收縮張力有明顯的抑制作用，推測(cè)可能是其防治化療性嘔吐的作用機(jī)制之一。此外，總灰分、浸出物在中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)中也占據(jù)著一定的地位。中藥以多成分、多靶點(diǎn)、多層次發(fā)揮治療作用［21］，因此，本研究基于息半夏的總灰分、浸出物、有機(jī)酸、生物堿為考察指標(biāo)，采用多組分對(duì)息半夏進(jìn)行整體質(zhì)量評(píng)價(jià)，全面反映野生與栽培息半夏整體質(zhì)量特征。研究證實(shí)，栽培息半夏與野生息半夏質(zhì)量指標(biāo)成分無明顯差異，為栽培息半夏的推廣應(yīng)用提供理論支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器紫外可見分光光度計(jì)（TU－1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；高速冷凍離心機(jī)（T GL－16M，常州金壇良友儀器有限公司）；全自動(dòng)滴定儀（T906，濟(jì)南海能儀器股份有限公司）；磨粉機(jī)（914B，中山市方天電器制造有限公司）；電熱套（ZHW，杭州振和儀器廠）；超聲波清洗器（KQ－500B，昆山市超聲儀器有限公司）；循環(huán)水真空泵（SH2－Ⅲ型，上海亞榮生化儀器廠）；水浴振蕩器（SH－B，金壇市神科儀器廠）。

1.2 試劑鹽酸麻黃堿（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：171241－201508，純度：99.7%）；氨水（分析純，德州金和化工經(jīng)貿(mào)有限公司，批號(hào)：20180402）、三氯甲烷（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170802）、枸櫞酸（分析純，蘇州智翔精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：180417）、枸櫞酸鈉（分析純，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：851067）、溴麝香草酚藍(lán)（分析純，上海撫生生物科技有限公司，批號(hào)：20190210）、乙醇（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160704）、氫氧化鈉（分析純，濟(jì)南創(chuàng)世化工有限公司，批號(hào)：20181018）、鹽酸（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180201）、純化水（自制）。

1.3 試樣樣品來自河南省信陽市息縣不同村莊的野生息半夏和栽培息半夏，經(jīng)信陽農(nóng)林學(xué)院副教授梁利香鑒定為息半夏。于2019年7月至11月每月10－15日，到采集地采集的半夏鮮品，每次隨機(jī)選取50～100株代表性半夏植株，去皮，干燥，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 水分的測(cè)定（烘干法）分別取粉碎過二號(hào)篩的樣品粉末2.0 g，置于干燥至恒質(zhì)量的稱量瓶中，精密稱定，于105℃條件下干燥5 h，移置干燥器中，放冷30 min，精密稱定，再在105℃下繼續(xù)干燥1 h，放冷，精密稱定，至連續(xù)兩次稱質(zhì)量的差異不超過5 mg為止。根據(jù)減失的質(zhì)量，計(jì)算供試品中含水量（%）。計(jì)算出的含水量數(shù)值僅供供試品其他質(zhì)量指標(biāo)計(jì)算用。結(jié)果見表1，圖1。

表1 野生息半夏和栽培息半夏水分測(cè)定結(jié)果（%）

圖1 野生和栽培息半夏水分結(jié)果圖

由于水分是衡量息半夏的干燥程度，目的是為保證息半夏貯存期間的質(zhì)量，本研究水分不作為判定息半夏品質(zhì)的指標(biāo)，僅參與后期半夏其他質(zhì)量指標(biāo)的計(jì)算。

2.2 總灰分的測(cè)定分別取粉碎過二號(hào)篩混合均勻的供試品2.0 g，置于熾灼至恒質(zhì)量的坩堝中，稱定質(zhì)量（準(zhǔn)確至0.01 g），通過設(shè)置緩緩升高溫度的方法緩慢熾熱，避免樣品燃燒，待樣品粉末完全炭化時(shí)，逐漸升高溫度至550℃，使樣品完全灰化并至恒質(zhì)量。根據(jù)剩余的殘?jiān)|(zhì)量，計(jì)算不同月份的息半夏樣品的總灰分含量（%）。結(jié)果見表2，圖2。

表2 野生息半夏和栽培息半夏總灰分測(cè)定結(jié)果 （%）

圖2 野生和栽培息半夏總灰分結(jié)果圖

野生和栽培息半夏總灰分檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)“N”型變化趨勢(shì)，且栽培息半夏總灰分略高于野生息半夏。部分樣品的總灰分含量高于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的4.0%，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，半夏的灰分與其生長(zhǎng)周期有直接關(guān)系，而本文考查的是7－11月份生長(zhǎng)時(shí)期的半夏樣品，半夏的最佳采收期是6月底至7月初，這時(shí)半夏的灰分極少不合格，有機(jī)酸、浸出物等有效成分含量也最高，半夏處于倒苗期，此時(shí)適合半夏的采收；7月底至8月份半夏的灰分達(dá)到峰值，到11月后半夏的灰分會(huì)達(dá)到第2個(gè)峰值，特別是有些多年生的半夏灰分就會(huì)超標(biāo)，如果是重新種植對(duì)半夏的灰分影響不大。為了進(jìn)一步分析野生和栽培息半夏總灰分的差異，利用Simca軟件對(duì)野生和栽培息半夏總灰分歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，利用Outlier剔除異常樣本，建立無監(jiān)督的主成分分析模型（PCA模型，PCA－X）（見圖3）。PCA得分圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)息半夏樣品，橢圓為95%置信區(qū)間。由結(jié)果可知所有樣品均位于可信區(qū)間內(nèi)，不同地區(qū)的野生和栽培息半夏樣品特征接近，并無明顯分類。

圖3 野生和栽培息半夏總灰分成分PCA圖

2.3 浸出物的測(cè)定（冷浸法）分別取粉碎過二號(hào)篩混合均勻的供試品約4.0 g，精密稱定，置250 mL的錐形瓶，精密加純化水100 mL，密塞，冷浸，前6 h內(nèi)時(shí)時(shí)振搖，再靜置18 h，用干燥濾器迅速濾過，精密量取濾液20 mL，置已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量。除另有規(guī)定外，以干燥品計(jì)算供試品中水溶性浸出物的含量（%）。結(jié)果見表3，圖4。

表3 野生和栽培息半夏浸出物檢測(cè)結(jié)果 （%）

圖4 野生和栽培息半夏浸出物檢測(cè)結(jié)果圖

野生和栽培息半夏浸出物含量隨生長(zhǎng)周期逐漸增加，其變化趨勢(shì)基本保持一致，其中，栽培息半夏浸出物含量略微高于野生息半夏。為了進(jìn)一步分析野生和栽培息半夏浸出物含量的差異，通過Simca軟件對(duì)野生和栽培息半夏浸出物含量歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，利用Outlier剔除異常樣本，建立無監(jiān)督的PCA模型（PCA－X）（見圖5）。PCA得分圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)息半夏樣品，橢圓為95%置信區(qū)間。由結(jié)果可知所有樣品均位于可信區(qū)間內(nèi)，每個(gè)地區(qū)野生息半夏和栽培息半夏樣品各自聚為一類。

圖5 野生和栽培息半夏浸出物成分PCA圖

2.4 有機(jī)酸的測(cè)定分別取粉碎過四號(hào)篩混合均勻的供試品粉末5.0 g，精密稱定后置于錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（分析純）50 mL，加熱回流提取1 h，再重復(fù)提取2次，共提取3次。放冷之后進(jìn)行過濾，將濾液合并后蒸干，殘?jiān)芗尤霘溲趸c滴定液（0.106 4 mol·L－1）10 mL，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min后轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，加新沸過的冷水定容并搖勻［2］。精密量取25 mL，用鹽酸滴定液（0.101 8 mol·L－1）按照電位滴定法滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 mL氫氧化鈉滴定液（0.1 mol·L－1）相當(dāng)于5.904 mg琥珀酸（C4H6O4）。結(jié)果見表4，圖6。

表4 野生和栽培息半夏有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果 （%）

野生和栽培息半夏有機(jī)酸含量呈現(xiàn)“W”形變化趨勢(shì)，其中野生息半夏有機(jī)酸含量高于栽培息半夏有機(jī)酸含量。為了進(jìn)一步分析野生和栽培息半夏有機(jī)酸含量的差異，通過Simca軟件對(duì)野生和栽培息半夏有機(jī)酸成分歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，利用Outlier剔除異常樣本，建立無監(jiān)督的PCA模型（PCA－X）（見圖7）。PCA得分圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)息半夏樣品，橢圓為95%置信區(qū)間。由結(jié)果可知，所有樣品均位于可信區(qū)間內(nèi)，野生息半夏和栽培息半夏樣品各自聚為一類。

圖6 野生和栽培息半夏有機(jī)酸含量圖

圖7 野生和栽培息半夏有機(jī)酸成分PCA圖

2.5 生物堿的測(cè)定

2.5.1 鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液的制備精密稱取5.456 mg鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度為1.091 2 g·L－1的鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，用新沸過冷卻的純化水稀釋成濃度為0.103 6 g·L－1的對(duì)照品溶液，備用。

2.5.2 供試品溶液的制備與生物堿的測(cè)定采用熱浸法將0.5 g半夏粉末與0.5 mL、體積分?jǐn)?shù)為25%氨水和5 mL三氯甲烷混合，在35～40℃水浴條件下提取1 h，將息半夏生物堿提取溶液以5 000 r·min－1進(jìn)行離心操作5 min，取上清液［22］。將2 mL上清液、8 mL三氯甲烷、10 mL枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液（pH＝5.40）和1 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%溴麝香草酚藍(lán)溶液混合，振蕩1 min后，靜置1 h，于416 nm［23］波長(zhǎng)下測(cè)定三氯甲烷層溶液吸光度。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備準(zhǔn)確移取鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液0.20 mL、0.35 mL、0.50 mL、0.65 mL、0.80 mL置于分液漏斗中，分別加純化水至1.0 mL。將10 mL pH5.40的枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液、1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%溴百里酚藍(lán)溶液及10 mL三氯甲烷依次加入分液漏斗中；振蕩1 min后，靜置1 h。于416 nm波長(zhǎng)下測(cè)量三氯甲烷層的吸收值。以鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y＝0.014 21x＋0.017，r＝0.999 2，說明在0.020 72～0.082 88 g·L－1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5.4 重復(fù)性考察隨機(jī)取長(zhǎng)陵野生7月息半夏樣品，按供試品溶液制備方法平行處理6份，測(cè)定其吸光度，測(cè)得含量RSD值為1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性考察隨機(jī)取長(zhǎng)陵野生7月息半夏樣品供試品溶液，按0 h、1 h、2 h、3 h、4 h測(cè)定吸光度，連續(xù)4 h，結(jié)果RSD值為2.3%，表明該供試品在4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 精密度考察隨機(jī)取長(zhǎng)陵野生7月息半夏樣品供試品溶液，平行操作6次測(cè)其吸光度，測(cè)得結(jié)果RSD值為0.9%，表明儀器精密度良好。

2.5.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)隨機(jī)取已知含量的樣品9份，每份0.25 g，分別置于錐形瓶中，精密加入一定量的鹽酸麻黃堿對(duì)照品，按2.5.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)其吸光度，計(jì)算其加樣回收率，結(jié)果生物堿平均加樣回收率為97.81%，RSD值為0.56%。見表5。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.8 樣品含量測(cè)定樣品含量測(cè)定方法按2.5.2項(xiàng)下內(nèi)容。樣品含量結(jié)果見表6，圖8。

表6 野生和栽培息半夏生物堿含量測(cè)定結(jié)果 （%）

圖8 野生和栽培息半夏生物堿含量圖

野生和栽培息半夏生物堿含量在8月份略微下降后又持續(xù)增加，直至11月份時(shí)含量再次降低，其中野生息半夏生物堿含量高于栽培息半夏生物堿含量。為了進(jìn)一步分析野生和栽培息半夏生物堿含量的差異，通過Simca軟件對(duì)野生和栽培息半夏生物堿成分歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，利用Outlier剔除異常樣本，建立無監(jiān)督的PCA模型（PCA－X）（見圖9）。PCA得分圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)息半夏樣品，橢圓為95%置信區(qū)間。由結(jié)果可知所有樣品均位于可信區(qū)間內(nèi)，各地區(qū)野生和栽培息半夏均各自聚為一類。

圖9 野生和栽培息半夏生物堿成分PCA圖

2.6 野生息半夏及栽培息半夏主成分分析通過Simca（14.1）的PCA－X及SPSS（19.0）分析發(fā)現(xiàn)，野生息半夏和栽培息半夏的浸出物、生物堿、有機(jī)酸等成分具有差異性，為進(jìn)一步探討野生及栽培息半夏的化學(xué)成分間的聯(lián)系，本研究利用主成分分析法進(jìn)行分析，其主要是利用降維思想，將多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。其目的之一主要是在盡可能減少損失的基礎(chǔ)上，得到幾個(gè)綜合因子代表原來的眾多變量［21］。因?yàn)橄胂氖嵌嘟M分的復(fù)合體，因此，采用主成分分析法對(duì)本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的4類化學(xué)成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，綜合考察息半夏藥材的品質(zhì)特征。

將不同地區(qū)野生息半夏及栽培息半夏各成分含量數(shù)據(jù)分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，利用SPSS（19.0）對(duì)其進(jìn)行分析。結(jié)合表7中的數(shù)據(jù)可知（野生息半夏）：第一主成分與浸出物、有機(jī)酸、生物堿的相關(guān)性較強(qiáng)，基本能夠代表野生息半夏中此3種化學(xué)組分的綜合水平，貢獻(xiàn)率為48.977%；第二主成分主要與生物堿、總灰分存在較強(qiáng)的相關(guān)性，貢獻(xiàn)率為36.385%，因此這兩個(gè)主成分基本反映了原始數(shù)據(jù)的大部分信息，可以體現(xiàn)野生息半夏藥效成分的整體水平。

結(jié)合表8中的數(shù)據(jù)可知（栽培息半夏）：第一主成分與浸出物、有機(jī)酸、生物堿的相關(guān)性較強(qiáng)，基本能夠代表栽培息半夏中此3種化學(xué)組分的綜合水平，貢獻(xiàn)率為43.869%；第二主成分主要與總灰分、生物堿存在較強(qiáng)的相關(guān)性，貢獻(xiàn)率為37.231%，因此這兩個(gè)主成分基本反映了原始數(shù)據(jù)的大部分信息，可以體現(xiàn)栽培息半夏藥效成分的整體水平。

表7 野生息半夏主成分載荷矩陣及解釋的總方差

表8 栽培息半夏主成分載荷矩陣及解釋的總方差

分別以F1和F2的貢獻(xiàn)率與兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率的比值作為權(quán)數(shù)，并以F＝0.574F1＋0.426 F2求出綜合野生息半夏得分值，以F＝0.541F1＋0.459 F2求出綜合栽培息半夏得分值。由表9、表10結(jié)果可知，基于第一主成分和綜合主成分得分［21］：關(guān)店、陸灣栽培息半夏與三地區(qū)野生息半夏在浸出物、生物堿、有機(jī)酸化學(xué)組分含量接近，整體水平較高，說明關(guān)店、陸灣栽培息半夏作為野生息半夏替代品具備一定的合理性。

表9 各地區(qū)野生及栽培息半夏樣品主成分值、綜合主成分值

表10 各地區(qū)野生及栽培息半夏樣品主成分均值、綜合主成分得分均值

3 討論

通過對(duì)3個(gè)不同地區(qū)的野生息半夏及栽培息半夏各成分含量的分析，表明栽培息半夏的浸出物指標(biāo)含量較野生息半夏高，野生息半夏總灰分指標(biāo)低于栽培息半夏，但生物堿、有機(jī)酸含量高于栽培息半夏，這可能是因?yàn)橐吧胂脑谧匀画h(huán)境下，其生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)且緩慢，因此其次生代謝產(chǎn)物積累較為豐富，但栽培息半夏水肥條件優(yōu)越，土壤營(yíng)養(yǎng)充足，在整個(gè)生長(zhǎng)過程中，生物量增加較快，塊莖體積較大，次生代謝產(chǎn)物累積卻相對(duì)較少［16］。

基于此，利用Simca PCA－X分析發(fā)現(xiàn)野生息半夏總灰分、浸出物等指標(biāo)特征與栽培息半夏并無顯著區(qū)分，而野生息半夏的生物堿及有機(jī)酸指標(biāo)和栽培息半夏能夠明顯區(qū)分，在PCA－X模型中各自聚為一類，生物堿類［17］、有機(jī)酸［2］類成分是息半夏的主要藥用成分之一，但目前由于野生資源匱乏，為了響應(yīng)國(guó)家保護(hù)野生種質(zhì)資源的號(hào)召，息半夏道地產(chǎn)區(qū)的農(nóng)戶不得不對(duì)息半夏進(jìn)行人工繁育。通過對(duì)各地區(qū)野生息半夏及栽培息半夏主成分及綜合主成分質(zhì)量評(píng)價(jià)得分結(jié)果發(fā)現(xiàn)，栽培息半夏作為野生息半夏替代品具備一定的合理性。

另外，由于本研究中所采用的息半夏樣品僅為信陽市息縣的部分地區(qū)野生及栽培品息半夏，并未完全涵蓋所有息半夏的樣品信息，因此，后期將擴(kuò)大樣品范圍，并利用LC－MS、GC－MS等儀器對(duì)野生及栽培息半夏的其他有效成分進(jìn)行相關(guān)分析，并對(duì)野生息半夏及栽培息半夏的藥理作用進(jìn)行全面系統(tǒng)地對(duì)比研究，以期對(duì)野生息半夏及栽培息半夏有更全面的了解。