多模態(tài)納米粒靶向動脈粥樣硬化易損斑塊SR-A的體外研究

葉曼，鐘毅欣，汪星月，郭大靜，周君*

動脈粥樣硬化是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎，而心血管疾病是一種嚴重影響和危害人類生命健康的疾病，有較高的致病率和致死率[1]。動脈粥樣硬化斑塊的病理特征、組成成分與斑塊的易損性、斑塊的破裂以及破裂后導致的嚴重后果息息相關[2]，因此，能夠在體無創(chuàng)性地檢測動脈粥樣硬化斑塊的組成成分，將對患者的治療和預后評估有著極其重要的臨床價值。目前臨床常用的影像技術對動脈粥樣硬化斑塊的病理成分及穩(wěn)定性判斷具有一定的局限性，而分子影像學的發(fā)展使得準確地測定斑塊的組成成分成為可能，并且具有識別易損和高風險斑塊的潛能[3-4]，可以在疾病表現(xiàn)出臨床癥狀之前便提供相關的病理生理學信息。本研究用聚乳酸/羥基乙酸[poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA]作為載體，制備載配體硫酸葡聚糖(dextran sulfate，DS)的磁共振及光聲雙模態(tài)分子探針，以期借助分子影像技術從細胞及分子水平分析動脈粥樣硬化斑塊的清道夫受體A (scavenger receptor A，SR-A)，實現(xiàn)對動脈粥樣硬化斑塊的早期精準診斷，為疾病的治療及預后判斷提供重要的基礎信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

PLGA (丙交酯：乙交酯為75∶25，分子量為8000 Da，濟南岱罡生物材料有限公司)、油酸修飾的Fe3O4(10 nm，25 mg/mL，美國大洋科技有限公司)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA，分子量為30000～70000 Da，美國Sigma公司)、殼聚糖(chitosan，CS，分子量為50000 Da，上海麥金林生化有限公司)、DS (分子量為5000 Da，上海阿拉丁試劑有限公司)、DiI和DAPI染色劑(美國Sigma公司)、CCK8檢測試劑盒(日本同仁)，所有試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

超聲振蕩儀(VCY-500，YYSonics有限公司，中國上海)、動態(tài)光散射檢測器(Malvern Instruments，馬爾文有限公司)、透射電鏡(日立7500，日立公司)、光學顯微鏡(Leica DMI8，Leica有限公司)、流式細胞儀(FACSVantage，美國)、1.5 T MRI掃描儀(HDXT2012，GE Medical Systems，美國)、光聲成像儀(Vevo Laser，VisualSonics，加拿大)、激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1，日本)、酶標儀(Synergy HT，BioTek Instruments，美國)。

1.2 雙模態(tài)納米粒的制備及表征

1.2.1 非靶向納米粒的制備

采用雙乳化法，首先將50 mg PLGA加入到2 mL二氯甲烷中，制備DiI染色納米粒時在此過程中加入少量DiI，待其完全溶解后滴加100 μL油酸修飾的Fe3O4，輕微搖晃至完全混合。加入200 μL的雙蒸水作為內(nèi)水相，在常溫條件下用聲振儀聲振3 min，功率為130 W×40%，產(chǎn)生咖色初乳液。接著加入6 mL 4%的PVA溶液作為外水相，聲振儀聲振5 min，形成棕色復乳液。然后加入10 mL 2%的異丙醇，將上述溶液在冰浴條件下置于通風櫥連續(xù)攪拌3 h，使得有機溶劑完全揮發(fā)，非靶向納米粒(PLGA-Fe3O4)表面固化。最后經(jīng)雙蒸水離心洗滌3次除去上清液，將收集的納米粒置于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 靶向納米粒的制備

在上述制備過程中，將6 mL 4%的PVA溶液替換為3 mL 4%的PVA溶液和3 mL 2%的CS溶液(溶解于3%的乙酸)混合液，除去上清液后，用雙蒸水將納米粒重懸至5 mL，然后加入10 mg DS，冰浴搖床1 h通過靜電吸附作用制備PLGA-Fe3O4-DS納米粒，離心洗滌后稀釋至10 mg/mL并置于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.3 納米粒的理化性質(zhì)

用動態(tài)光散射檢測器測定PLGA-Fe3O4-DS納米粒的平均粒徑、表面電位和多分散指數(shù)(polydispersity index，PDI)，使用透射電鏡分析其內(nèi)部結構，用光學顯微鏡連續(xù)一周觀察其分布及形態(tài)特征，用流式細胞儀檢測DS的連接率。

1.3 納米粒磁共振成像及光聲成像研究

1.3.1 納米粒磁共振成像

將PLGA-Fe3O4-DS納米粒與1%的瓊脂溶液混合，產(chǎn)生濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的納米粒后，轉(zhuǎn)至5 mL Eppendorf管中，將其依次置于充滿水的塑料容器中，以減少空氣偽影。使用1.5 T磁共振掃描儀進行T2*WI掃描，采用頭顱專用單通道正交線圈，梯度回波序列(gradient echo sequence，GRE)。掃描參數(shù)為：回波時間(echo time，TE)=10.7 ms，重復時間(repetition time，TR)=520 ms，掃描層厚=3 mm，掃描視野(field of view，F(xiàn)OV)=180 mm，翻轉(zhuǎn)角(flip angle，F(xiàn)A)=45°。

1.3.2 納米粒光聲成像

依次將100 μL濃度為 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL的PLGA-Fe3O4-DS納米粒加入到帶孔的凝膠模型中，用波長為706 nm的激光輻照60 s后，以光聲成像系統(tǒng)采集納米粒的光聲圖。

1.4 細胞實驗

1.4.1 納米粒對巨噬細胞的靶向性

體外培養(yǎng)小鼠巨噬細胞RAW 264.7，用100 ng/mL脂多糖對其進行活化24 h，取對數(shù)生長期細胞，以2.0×105/孔接種于直徑為15 mm培養(yǎng)皿中24 h后，用0.5 mg/mL的DiI標記的PLGA-Fe3O4或PLGA-Fe3O4-DS納米粒培養(yǎng)基替換原始培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h。用PBS洗滌細胞3次，用4%的多聚甲醛在室溫下固定15 min，再次洗滌細胞并用DAPI將細胞核染色10 min，洗掉多余的染料，放置于激光共聚焦顯微鏡上對固定的細胞進行觀察并采集圖像。

1.4.2 納米粒的細胞毒性

將活化的RAW 264.7以1×104/孔接種于96孔板中，孵育24 h，用濃度0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL的PLGA-Fe3O4-DS納米粒培養(yǎng)基替換原始培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱后孵育24 h，然后用PBS洗滌細胞3次，加入10μL的CCK8溶液后繼續(xù)孵育2 h，最后用酶標儀在450 nm處測量溶液的吸光度，分別計算每個孔中細胞的存活率。

2 結果

2.1 納米粒的理化特征

制備的PLGA-Fe3O4-DS納米粒經(jīng)動態(tài)光散射檢測器測得平均粒徑為(263.93±21.38 nm (圖1A)，表面電位為(-20.63±2.61) mV (圖1B)，PDI為0.099±0.068。透射電鏡下觀察納米粒大小約260 nm，油酸修飾的Fe3O4分布在納米粒的殼上，納米粒外膜可見DS的透明結構(圖1C)。在光鏡下納米粒形態(tài)規(guī)則呈球形，大小均勻，分散性好(圖1D)，連續(xù)一周內(nèi)觀察該納米粒大小形態(tài)無明顯變化。與對照組相比，PLGA-Fe3O4-DS納米粒外殼波長發(fā)生了改變，流式細胞儀測得含有DS的納米粒其連接率為90.06%(圖2)。

2.2 納米粒的多模態(tài)成像

2.2.1 納米粒磁共振成像

磁共振掃描圖顯示，PLGA-Fe3O4-DS納米?？捎行Ы档蚑2*信號，隨著樣品中納米粒濃度的增加，T2*信號強度降低越明顯(圖3A)。

2.2.2 納米粒光聲成像

在激光照射下，與無光聲信號的水溶液相比，不同濃度的PLGA-Fe3O4-DS納米粒均顯示出紅色的光聲信號，并且隨著濃度的遞增，光聲信號強度逐漸增強(圖3B)。

2.3 納米粒的體外靶向性

激光共聚焦顯微鏡下可以看到，納米粒與活化的RAW 264.7共孵育2 h后，DiI標記的PLGA-Fe3O4-DS帶紅色熒光納米粒聚集在細胞核周邊，而在非靶向組中未觀察到DiI標記的PLGA-Fe3O4納米粒在細胞周圍聚集(圖4)。

2.4 納米粒的細胞毒性

將RAW 264.7細胞與不同濃度的PLGA-Fe3O4-DS納米粒共孵育24 h后，在濃度為8 mg/mL以下時細胞存活率均在85%以上(圖5)。

3 討論

動脈粥樣硬化斑塊的細胞及組織成分多樣，在納米粒的制備過程中，原材料之間的相互作用及復雜繁瑣的制備步驟會在一定程度上影響納米粒對斑塊的診斷效能。因此，本研究在課題組前期研究的基礎上用改良的雙乳化法和靜電吸附法制備PLGA-Fe3O4-DS納米粒[5-7]，該制作步驟簡便可操作性強，且制備的納米粒大小均一、分散性好，在連續(xù)一周內(nèi)觀察無明顯大小形態(tài)變化，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。得到的納米粒平均粒徑為(263.93±21.38) nm，可減少被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲[8]，縮短了在血液循環(huán)中的持續(xù)時間，能夠充分聚集于動脈粥樣硬化病變處，更好地對疾病進行動態(tài)檢測。

目前，國內(nèi)外學者基于不同的影像技術制備了靶向動脈粥樣硬化斑塊的各種分子探針[9-10]，單一模式的成像技術對病變的顯示有自身的局限性，存在一定的偏差，而多模態(tài)成像運用兩種或兩種以上的成像模式，使各種成像技術能夠優(yōu)勢互補，提供更加全面的相關組織和疾病病理生理學信息。磁共振成像技術具有軟組織分辨率高、多方位、多參數(shù)成像的特點，能夠進行深部及小血管檢測[11]，但噪音大、時間分辨率低。光聲成像技術利用組織光能量的吸收分布推測內(nèi)部結構，是生物醫(yī)學領域新興的一種成像技術，結合了純光學與純聲學顯像空間分辨率高、對比度好等優(yōu)點，但其對深部組織的穿透力不如磁共振[12]。Fe3O4可用作磁共振顯像劑[13]，同時作為“光吸收子”，也可用于光聲成像。在本研究中，磁共振掃描結果顯示不同濃度的PLGA-Fe3O4-DS納米粒均能降低T2*信號，且隨著樣品中納米粒濃度的增加，T2*信號強度降低越明顯，油酸修飾的Fe3O4嵌于納米粒殼上，不會發(fā)生明顯的突釋現(xiàn)象，穩(wěn)定性優(yōu)良，該納米粒能夠有效降低T2*信號，具有良好的磁共振負性增強效果。在體外光聲成像中，納米粒在激光照射下能將光信號轉(zhuǎn)化為可觀測的聲信號，隨著納米粒濃度遞增，光聲信號逐漸增強，說明納米粒具有較強的光穩(wěn)定性，能夠很好地進行光聲成影。因此，本研究制備的PLGA-Fe3O4-DS納米粒能夠結合磁共振成像及光聲成像技術的優(yōu)勢，期望從分子水平對動脈粥樣硬化斑塊實現(xiàn)更全面的影像學分析。

動脈粥樣硬化易損斑塊的細胞成分中巨噬細胞的含量是最為豐富的，病變的早期特征性病理變化便是巨噬細胞的活化，活化的細胞表面過表達SR-A[14-15]，本研究選擇活化巨噬細胞中的SR-A作為靶點。硫酸葡聚糖是巨噬細胞表面SR-A的配體之一，生物相容性、生物降解性良好，可降低患者血液中低密度脂蛋白的含量，具有逆轉(zhuǎn)和穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的潛能[16]。在細胞靶向?qū)嶒炛校{米粒與活化的RAW264.7細胞共孵育2 h后，在靶向組中可以觀察到大量帶紅色熒光的PLGAFe3O4-DS聚集在細胞核周圍，非靶向組中PLGA-Fe3O4納米粒不含配體DS，對細胞沒有親和力，在實驗過程中被PBS洗掉后幾乎觀察不到紅色熒光，表明PLGAFe3O4-DS納米粒在靶向受體作用介導下可被巨噬細胞內(nèi)吞，這種靶向作用可以在一定程度上抵抗動脈血流的剪切力，使納米粒與巨噬細胞結合以進一步實現(xiàn)成像及治療潛能。此外，細胞毒性結果顯示，將細胞置于各種濃度納米粒24 h后，細胞增殖沒有受到阻礙，細胞存活率都大于85%，表明納米粒的細胞毒性作用甚低，有很好的生物安全性。

綜上所述，本研究制備的PLGA-Fe3O4-DS納米粒具備良好的磁共振成像和光聲成像能力，對活化RAW264.7細胞的SR-A有較高的親和力，有望在分子水平分析SR-A在動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過程中的規(guī)律，為易損斑塊的準確診斷、無創(chuàng)性治療及活體動態(tài)評價其療效提供新的思路。

利益沖突：無。