益腎通絡(luò)方調(diào)控PI3K/Akt通路對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)無精/少精癥大鼠模型的保護作用研究

李勛，陳建設(shè)△，門波，李暉，陳翔，張輝，郝高利，樊立鵬，張幸華，董亞洲

無精/少精癥又叫男性生精功能障礙癥，指男性睪丸發(fā)育不良，生精細胞萎縮、退化，不能生成精子，或由于輸精管阻塞或附睪體炎癥等多種原因引起生精細胞分裂停滯、成熟精子不能產(chǎn)生和排出，從而導(dǎo)致男性生殖功能障礙和不育性疾?。?-2］。據(jù)流行病學(xué)分析，近年來男性生殖功能障礙和不育癥發(fā)生率逐漸升高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和家庭和諧［3-4］。中醫(yī)藥在治療男性不育及生精障礙方面具有獨特優(yōu)勢和較好療效［5-6］。益腎通絡(luò)方（YTF）為名醫(yī)驗方，功效為健脾益腎、化瘀通絡(luò)，主治膜性腎病、腎絡(luò)瘀阻癥。近期研究發(fā)現(xiàn)，YTF 可治療精索靜脈曲張性不育，對大鼠睪丸生精功能有保護作用［7］。YTF 對無精/少精癥是否具有治療作用尚少見相關(guān)研究。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路參與睪丸生長發(fā)育和精子生成過程［8］。本研究通過環(huán)磷酰胺（CP）誘導(dǎo)建立大鼠無精/少精癥模型，并用PI3K/Akt 通路抑制劑（LY294002）阻斷PI3K/Akt 蛋白表達，探討YTF 對無精/少精癥模型大鼠的治療作用及對PI3K/Akt 通路的調(diào)控作用，為探索YTF新的藥理作用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD 大鼠62 只，體質(zhì)量200～220 g，購自河南省實驗動物中心，生產(chǎn)許可號為SCXK（豫）2017-0001。所有大鼠于本院動物房中飼養(yǎng)，使用許可證號為SCXK（豫）2017-0001。飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對濕度50%，噪音低于80 dB，保持動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本研究經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)同意，實驗符合3R（減少、替代、優(yōu)化）原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 CP（貨號：6055-19-2；規(guī)格：1 g/瓶）購自北京百奧萊博科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶（貨號分別為P0768、P0231）均購自美國Pierce 公司；LY294002（規(guī)格：5 mg；批號039K4625）購自美國Sigma公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號：LMO105）購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；性激素睪酮（sex hormone testosterone，T）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（貨號：YE02503）購自上海遠慕生物科技有限公司；卵泡刺激素（FSH）ELISA 試劑盒（貨號：ER0960）購自武漢菲恩生物科技有限公司；PI3K抗體（貨號：ab39307）、Akt 抗體（貨號：ab8805）、磷酸化Akt（p-Akt）抗體（貨號：ab38449）、雷帕霉素靶分子（mTOR）抗體（貨號：ab2732）、成纖維細胞生長因子（bFGF）抗體（ab208687）、早幼粒細胞白血病鋅指（PLZF）抗體（貨號：ab39354）、跨膜酪氨酸激酶受體（C-kit）抗體（貨號：ab256345）等均購自美國Abcam 公司；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀（型號1659001、Trans-Blot SD）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠無精/少精癥模型建立及分組 參照文獻［9］構(gòu)建無精/少精癥模型，具體操作方法為：取52只大鼠禁食禁水12 h 后，3%戊巴比妥鈉麻醉，用生理鹽水配置3.5 g/L 的CP溶液，并按35 mg/（kg·d）的劑量經(jīng)腹腔注射給藥，連續(xù)5 d后，隨機取2只大鼠，取睪丸組織固定、常規(guī)透明、浸蠟、包埋、切片（5 μm），行HE染色，置顯微鏡下觀察可見睪丸生精細胞紊亂、數(shù)量減少、未見精子細胞，且管腔中無絮狀精子形成，表明造模成功。

將建模成功的50只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組（Model 組）、PI3K/Akt 通路抑制劑［10］（LY294002）組（LY 組，0.3 mg/kg）、YTF［7］低劑量組（3 g/kg）、高劑量組（12 g/kg）以及YTF（12 g/kg）+LY（0.3 mg/kg）組，每組10只；另外10只大鼠，麻醉后經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水，作為空白對照（Control）組。各組均于造模成功后第2天開始給藥，LY294002用DMSO溶液配制為0.03 g/L的混懸液，YTF用生理鹽水配置為0.30、1.20 g/mL 的混懸液，LY 組灌胃給予生理鹽水和注射給予LY294002 混懸液，YTF 低、高劑量組灌胃給予相應(yīng)劑量YTF溶液并腹腔注射給予DMSO 溶液，YTF+LY 組灌胃給予1.20 g/mL YTF溶液和注射給予0.03 g/L的LY294002溶液；Control組及Model組分別灌胃給予生理鹽水和注射給予DMSO溶液，各組均以10 mL/kg的劑量給藥，1次/d，連續(xù)給藥4周。

1.2.2 標(biāo)本采集與制備 各組大鼠于末次給藥12 h后，麻醉后稱取大鼠體質(zhì)量，取腹主動脈血2 mL，3 000 r/min 離心10 min 后，取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書方法檢測血清T及FSH水平；斷頭處死大鼠，取雙側(cè)睪丸組織，并稱取睪丸質(zhì)量，按公式睪丸指數(shù)=大鼠雙側(cè)睪丸質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）計算睪丸指數(shù)；迅速取睪丸0.5 g置于-80 ℃冰箱保存，剩余組織置于波恩（Bouin’s）固定液中固定24 h。

1.2.3 各組大鼠睪丸組織HE染色、生精小管直徑（MSTD）檢測及Johnsen 評分檢測 取1.2.2 中Bouin’s 固定液中固定24 h 的睪丸組織，進行常規(guī)透明、浸蠟、包埋、切片（5 μm）。將切片脫蠟、水化后，按HE 試劑盒說明書行常規(guī)染色、中性光學(xué)樹脂封片后，置于顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化。采用Image-proplus 6.0 圖像處理系統(tǒng)測量MSTD。在光鏡下選取10 個生精小管，按照Johnsen 10 級評分法［9］評價大鼠生精上皮細胞發(fā)育情況。評分標(biāo)準(zhǔn)為：1分，無細胞；2分，僅支持細胞；3 分，僅精原細胞，無生精細胞；4 分，精母細胞為5 個；5分，精母細胞＞5個；6分，精子細胞有1～5個；7分，精子細胞＞5個，但無分化；8分，存在晚期精子細胞；9分，精子有1～5個；10分，精子＞5個。

1.2.4 Western blot 檢 測PI3K、p-Akt/Akt、mTOR、bFGF、PLZF、C-kit 蛋白表達 取1.2.2 中-80 ℃保存的睪丸組織，4 ℃條件下解凍后，用組織勻漿器勻漿，3 000 r/min 離心15 min 后，取上清液，用蛋白提取試劑盒提取蛋白并按BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度后，取50 μg蛋白進行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)后，置于5%的脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，TBST清洗后，加入抗體（PI3K、p-Akt、Akt、mTOR、bFGF、PLZF、C-kit，稀釋比例為1∶500）、β-actin（內(nèi)參，稀釋比例為1∶2 000），于4 ℃冰箱中孵育過夜、TBST 漂洗3次后，加入1∶1 000的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h、TBST 再次漂洗3 次后，采用增強化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 以SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠睪丸指數(shù)及血清指標(biāo)T 和FSH 水平 與Control 組比較，除YTF 高劑量組T 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各組睪丸指數(shù)和T水平均降低，F(xiàn)SH水平均升高（P＜0.05）。與Model組比較，LY組睪丸指數(shù)和T 水平降低，F(xiàn)SH 水平升高；YTF 低、高劑量組睪丸指數(shù)和T水平升高，F(xiàn)SH水平降低（P＜0.05）；YTF+LY 組與Model 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與YTF低劑量組比較，YTF 高劑量組睪丸指數(shù)和T 水平升高，F(xiàn)SH 水平降低；YTF+LY 組睪丸指數(shù)和T 水平降低，F(xiàn)SH水平升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of testis index,serum levels of T and FSH between six groups of rats表1 6組大鼠睪丸指數(shù)及血清T和FSH比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of testis index,serum levels of T and FSH between six groups of rats表1 6組大鼠睪丸指數(shù)及血清T和FSH比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Control 組比較，b與Model 組比較，c與LY 組比較，d與YTF低劑量組比較，e與YTF高劑量組比較，P＜0.05；表2～4同

組別Control組Model組LY組YTF低劑量組YTF高劑量組YTF+LY組F睪丸指數(shù)8.96±0.39 6.39±0.32a 5.55±0.20ab 7.11±0.29abc 8.05±0.28abcd 6.38±0.36acde 159.214＊T（μg/L）21.68±2.39 14.46±2.21a 11.55±2.25ab 17.31±2.29abc 20.15±2.38bcd 14.38±2.31acde 27.805＊FSH（IU/L）6.63±0.99 13.52±1.11a 15.98±1.25ab 11.11±1.09abc 8.83±1.08abcd 13.32±1.16acde 93.812＊

2.2 大鼠睪丸組織HE染色病理結(jié)果 Control組大鼠睪丸組織生精細胞排列整齊，生精小管管腔結(jié)構(gòu)正常；Model組及YTF+LY組大鼠睪丸組織生精小管管腔縮窄，生精細胞紊亂、數(shù)量減少或消失；LY組生精小管管腔縮窄、生精細胞排列紊亂及減少等病理現(xiàn)象最為嚴(yán)重；YTF低、高劑量組大鼠睪丸組織生精細胞排列較為整齊，且YTF高劑量組優(yōu)于低劑量組，見圖1。與Control組比較，除YTF高劑量組MSTD差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各組MSTD 及生精細胞發(fā)育評分均降低（P＜0.05）；與Model 組比較，LY 組MSTD 及生精細胞發(fā)育評分降低，YTF 低、高劑量組MSTD及生精細胞發(fā)育評分升高（P＜0.05），YTF+LY組與Model 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與YTF 低劑量組比較，YTF 高劑量組MSTD 及生精細胞發(fā)育評分升高，YTF+LY組MSTD及生精細胞發(fā)育評分降低（P＜0.05），見表2。

2.3 大鼠睪丸組織bFGF、PLZF、C-kit 蛋白的表達水平 與Control 組比較，其余各組睪丸組織bFGF、PLZF、C-kit 蛋白表達水平均降低（P＜0.05）；與Model 組比較，LY 組bFGF、PLZF、C-kit 蛋白表達水平降低，YTF低、高劑量組bFGF、PLZF、C-kit蛋白表達水平升高（P＜0.05），YTF+LY 組與Model 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與YTF低劑量組比較，YTF高劑量組bFGF、PLZF、C-kit 蛋白表達水平升高，YTF+LY 組bFGF、PLZF、C-kit 蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖2、表3。

2.4 大鼠睪丸組織PI3K/Akt/mTOR 蛋白相對表達水平 與Control 組比較，其余各組睪丸組織PI3K、p-Akt/Akt、mTOR 蛋白表達水平均降低（P＜0.05）；與Model 組比較，LY 組PI3K、p-Akt/Akt、mTOR 蛋白表達水平降低，YTF 低、高劑量組PI3K、p-Akt/Akt、mTOR 蛋白表達水平升高（P＜0.05），YTF+LY 組與Model 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與YTF 低劑量組比較，YTF高劑量組PI3K、p-Akt/Akt、mTOR蛋白表達水平升高，YTF+LY 組PI3K、p-Akt/Akt、mTOR 蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖3、表4。

Fig.1 Pathological damages of rat testis（HE，×200）圖1 大鼠睪丸組織病理損傷情況（HE，×200）

Tab.2 Comparison of testicular MSTD and spermatogenic cell development scores between six groups of rats表2 6組大鼠睪丸MSTD及生精細胞發(fā)育評分比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of testicular MSTD and spermatogenic cell development scores between six groups of rats表2 6組大鼠睪丸MSTD及生精細胞發(fā)育評分比較（n=10，±s）

組別Control組Model組LY組YTF低劑量組YTF高劑量組YTF+LY組F MSTD（μm）228.96±20.26 164.23±15.32a 135.55±15.20ab 186.81±17.86abc 207.91±17.08bcd 162.95±16.36acde 39.194＊生精細胞發(fā)育評分（分）9.88±0.82 5.32±0.71a 4.35±0.69ab 6.98±0.72abc 8.12±0.76abcd 5.28±0.79acde 76.989＊

Fig.2 Western blot results of bFGF,PLZF and C-kit protein expression in rat testis圖2 Western blot檢測大鼠睪丸組織bFGF、PLZF、C-kit蛋白的表達

Tab.3 Comparison of bFGF,PLZF and C-kit in testis between six groups of rats表3 6組大鼠睪丸組織bFGF、PLZF、C-kit蛋白表達的比較（n=10，±s）

Tab.3 Comparison of bFGF,PLZF and C-kit in testis between six groups of rats表3 6組大鼠睪丸組織bFGF、PLZF、C-kit蛋白表達的比較（n=10，±s）

組別Control組Model組LY組YTF低劑量組YTF高劑量組YTF+LY組F bFGF/β-actin 1.39±0.13 0.62±0.12a 0.23±0.14ab 0.92±0.16abc 1.11±0.14abcd 0.60±0.13acde 90.805＊PLZF/β-actin 1.36±0.12 0.55±0.15a 0.26±0.16ab 0.82±0.15abc 1.09±0.13abcd 0.53±0.13acde 82.736＊C-kit/β-actin 1.37±0.16 0.59±0.15a 0.29±0.14ab 0.83±0.13abc 1.06±0.12abcd 0.56±0.12acde 79.739＊

Fig.3 Western blot results of PI3K，p-Akt/Akt and mTOR protein expression in rat testis圖3 Western blot檢測大鼠睪丸組織PI3K、p-Akt/Akt、mTOR蛋白的表達

3 討論

男性不育已成為當(dāng)今研究的熱點問題，睪丸組織基因表達及信號傳導(dǎo)異常引起的精子減少或消失等生精功能障礙是導(dǎo)致男性生育力降低的主要原因［11］。血清T及FSH是影響睪丸生精功能的重要因素。鄧智標(biāo)［12］研究發(fā)現(xiàn)男性患者少精程度越嚴(yán)重，血清T越低，而FSH越高，提示血清T及FSH水平變化可能作為評價睪丸生精作用的重要指標(biāo)。睪丸是男性的重要生殖器官，其組織病理改變和質(zhì)量減輕，不僅會造成精子減少和精子畸形，還會影響男性的生精功能和生育能力［13］。而CP 可導(dǎo)致大鼠睪丸質(zhì)量減輕、精子生成減少及生精小管管腔變窄等病理損傷，是少精/無精癥動物造模的常用藥物［14］。本研究給予大鼠腹腔注射CP 后發(fā)現(xiàn)，與Control 組比較，大鼠睪丸組織出現(xiàn)生精細胞數(shù)量減少或消失、生精小管管腔變窄、絮狀精子減少等病理損傷，睪丸指數(shù)、MSTD 及生精上皮細胞發(fā)育情況評分、血清T 水平降低，F(xiàn)SH 水平升高，表明無精少精癥模型制備成功。

中醫(yī)認為腎瘀血虛、精血阻絡(luò)、瘀阻精室是造成男性精液不化、精子減少、消失、畸形及不育的主要原因，而用活血化瘀通絡(luò)藥進行補腎、助精血、化瘀血可改善男性不育癥狀［6］。YTF方中熟地補腎益精血、菟絲子補腎填精；淫羊藿、巴戟天補腎助陽，丹參活血、牛膝引血下行并化瘀通絡(luò)；水蛭入血并搜剔瘀血、散結(jié)通絡(luò)；方中諸藥配以黃芪，可益氣活血通絡(luò)、補腎助精。王祖龍等［7］研究發(fā)現(xiàn)YTF可通過抑制大鼠生精細胞凋亡來提高睪丸生精能力?；赮TF補腎助精及抑制生精細胞凋亡的作用，筆者推測YTF對無精/少精癥性不育也可能有較好的治療效果。本研究在給予無精/少精癥大鼠YTF治療后發(fā)現(xiàn)，與Model 組比較，YTF 低、高劑量組大鼠睪丸組織生精小管管腔內(nèi)有少量絮狀精子形成，睪丸指數(shù)、MSTD、生精上皮細胞發(fā)育情況評分及血清T 水平升高，血清FSH水平降低，提示經(jīng)YTF治療后，大鼠血清T及FSH水平趨于正常，睪丸質(zhì)量增加，睪丸病理損傷減輕，精子生成增多，表明YTF 可提高無精/少精癥大鼠精子生成能力，改善睪丸生精功能異常。

精子生成過程包括精原細胞增殖、分化，精母細胞減數(shù)分裂和精子形成，任一過程異常均可降低睪丸生精作用［15］。bFGF可促進生精上皮細胞增殖［16］，PLZF 可調(diào)控精原干細胞增殖和自我修復(fù)［17］，C-kit水平可反映精原細胞分化強弱，是精原細胞分化的標(biāo)志物［18］。本研究結(jié)果顯示，Model 組大鼠睪丸組織bFGF、PLZF、C-kit蛋白表水平均明顯低于Control組，提示無精/少精癥大鼠精子生成異?？赡芘c精原細胞增殖分化減弱有關(guān)。Akt 為PI3K 的直接靶基因，PI3K 活化可促進Akt 磷酸化，磷酸化的Akt 可直接磷酸化mTOR，而活化的mTOR 不僅可調(diào)控血-睪屏障的形成、開放和閉合，還可調(diào)控下游靶分子核糖體蛋白S6 激酶（ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）及真核翻譯起始因子4E 結(jié)合蛋白（recombinant eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）的表達來調(diào)控精原細胞的增殖、分化與精子形成［8，19］。Busada 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR 通路表達后，睪丸組織中調(diào)節(jié)細胞分化因子C-kit基因翻譯受阻，精原母細胞分化減弱而使未分化精原細胞在生精小管內(nèi)累積，提示抑制mTOR 通路可能會抑制睪丸生精功能而不利于精子的形成。本研究結(jié)果顯示，無精/少精癥大鼠睪丸組織中PI3K、p-Akt/Akt 及mTOR 蛋白表達均低于Control組，提示Model 組大鼠睪丸生精功能異?？赡芘cPI3K/Akt/mTOR通路表達受抑制有關(guān)。給予無精/少精癥大鼠PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002 后，LY 組大鼠PI3K/Akt/mTOR 通路蛋白、精原細胞增殖分化相關(guān)指標(biāo)bFGF、PLZF、C-kit 均低于Model 組，而大鼠睪丸質(zhì)量降低、睪丸病理損傷程度及睪丸生精作用評價指標(biāo)異常程度均加重，提示阻斷PI3K/Akt/mTOR 通路蛋白表達后，大鼠睪丸生精功能減弱。而YTF 低、高劑量組大鼠PI3K、p-Akt/Akt、mTOR 通路蛋白、精原細胞增殖分化相關(guān)指標(biāo)bFGF、PLZF及C-kit表達則高于Model組，提示YTF改善無精/少精癥大鼠生精作用可能是通過激活PI3K/Akt/mTOR通路來實現(xiàn)的。而YTF與LY294002聯(lián)用后，大鼠睪丸組織PI3K/Akt/mTOR通路及上述睪丸生精作用指標(biāo)變化均與YTF 低、高劑量組相反，提示LY294002 可逆轉(zhuǎn)YTF對無精/少精癥大鼠生精功能的改善作用。

Tab.4 Expression levels of PI3K,p-Akt/Akt and mTOR protein in testis of rats表4 6組大鼠睪丸組織PI3K、p-Akt/Akt、mTOR蛋白表達水平（n=10，±s）

Tab.4 Expression levels of PI3K,p-Akt/Akt and mTOR protein in testis of rats表4 6組大鼠睪丸組織PI3K、p-Akt/Akt、mTOR蛋白表達水平（n=10，±s）

組別Control組Model組LY組YTF低劑量組YTF高劑量組YTF+LY組F PI3K/β-actin 1.48±0.16 0.52±0.16a 0.23±0.13ab 0.79±0.14abc 1.06±0.12abcd 0.49±0.16acde 95.914＊p-Akt/Akt 1.42±0.13 0.49±0.13a 0.22±0.14ab 0.82±0.16abc 1.11±0.13abcd 0.46±0.15acde 102.966＊mTOR/β-actin 1.45±0.16 0.62±0.17a 0.44±0.15ab 0.83±0.15abc 1.18±0.14abcd 0.65±0.13acde 64.366＊

綜上所述，YTF 可能通過激活PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達，改善無精/少精癥大鼠生精功能，促進精子的形成；但PI3K/Akt/mTOR 通路調(diào)控精原細胞增殖、分化影響生精功能的靶向分子多而復(fù)雜，YTF 為復(fù)方藥成分復(fù)雜，其發(fā)揮療效作用的具體成分尚未明確，仍有待進一步研究驗證。