拮抗尖鐮孢菌的生物防治試劑的分離與鑒定

鄭寶勝 葛敬如 蘇昕（通訊作者）

（沈陽(yáng)藥科大學(xué) 遼寧 沈陽(yáng) 110016）

植物枯萎病是由寄生的尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的真菌性傳染性疾病，尖孢鐮刀菌通過(guò)產(chǎn)生出有毒物質(zhì)鐮刀菌素?cái)U(kuò)散導(dǎo)致病株葉片枯黃而死[1]。由于農(nóng)業(yè)防治的局限性和傳統(tǒng)的化學(xué)防治容易殘留農(nóng)藥，對(duì)人體有危害和污染環(huán)境，基于微生物及其代謝產(chǎn)物的生物防治方法已經(jīng)成為全球植物病害防治的主要發(fā)展方向[2]。因此，研究微生物及其活性物質(zhì)能夠有效地幫助開(kāi)發(fā)新型農(nóng)藥，同時(shí)也是闡明其作用機(jī)理的重要環(huán)節(jié)。作為菌株的生物防治機(jī)制之一，水解酶越來(lái)越多地被用作評(píng)估生物防治細(xì)菌生物防治潛力的指標(biāo)[3-4]。芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，但當(dāng)芽孢桿菌被用作控制植物病原菌的微生物制劑時(shí)，抗菌作用的發(fā)揮主要是由于其產(chǎn)生脂肽類抗生素[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)測(cè)定芽孢桿菌的水解酶活性和解磷能力評(píng)價(jià)其生防價(jià)值，并對(duì)芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌跟蹤測(cè)定，從而初步研究其抑菌機(jī)制。

1.材料

1.1 主要材料

尖刀鐮孢菌（Fusarium oxysparm)——沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)；

芽孢桿菌（Bacillus siamensis）X13——沈陽(yáng)藥科大學(xué)。

1.2 主要培養(yǎng)基

沙氏培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NB 培養(yǎng)基）；

土豆-蔗糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基；

胞外酶活性測(cè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

瓊脂粉——天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

蒸餾水——沈陽(yáng)藥科大學(xué)；

生理鹽水——0.85%生理鹽水；

染色劑——盧戈氏碘液；0.1%剛果紅染液。

1.3 主要設(shè)備

臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；

立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；

HZQ-QX 全溫振蕩器；

RE52-99 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

2.方法

2.1 蛋白酶，淀粉酶和纖維素酶活性的測(cè)定

將X13 分別接種在蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)后觀察是否有透明圈產(chǎn)生，測(cè)量透明圈和菌落直徑；按以下公式分別計(jì)算出三種酶活性：

酶活性=透明圈直徑/菌落直徑

2.2 解磷能力測(cè)定

將X13 菌株加入NB 培養(yǎng)基中于37℃搖培24 小時(shí)，用作種子溶液。將菌液分別接種于NBRIP 無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基和有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 天，觀察有無(wú)解磷透明圈。根據(jù)是否有解磷圈來(lái)確定其對(duì)無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的解磷作用。

2.3 X13 菌發(fā)酵液的制備

將菌株X13 在37℃接種到種子培養(yǎng)基(同發(fā)酵培養(yǎng)基成分)中，作為種子液以180r/min 培養(yǎng)24 小時(shí)。將種子液以5%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后置于37℃的搖床中，以180r/min 培養(yǎng)48 小時(shí)。

2.3.1 脂肽粗提物的制備 （1）調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH 到8.0，使脂肽盡量多地溶解在發(fā)酵液中，并在室溫下以3500r/min 離心45min；（2）取上清液，調(diào)節(jié)pH 到 2.0，并在4℃下靜置12 小時(shí)，在室溫下以3500r/min 離心45min，上清液經(jīng)拮抗實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，沒(méi)有抑菌活性，抑真菌活性物質(zhì)主要留存在沉淀中，因此棄去上清液；（3）用pH 為2.0 的鹽酸洗滌沉淀兩次，再以甲醇少量多次萃取(萃取3 次)；（4）萃取液于30℃減壓蒸干溶劑，得到的淡黃色粉末即為脂肽粗提物，溶解在甲醇中，使其終濃度為5 g/L 左右，避光保存于ep 管中。

2.3.2 脂肽粗提物的抑菌活性跟蹤測(cè)定 （1）制備單孢子懸液：取尖鐮孢菌斜面，加入5ml 無(wú)菌生理鹽水，刮下菌苔，倒入含有玻璃珠的100ml 滅菌三角瓶中，振蕩20 min，將孢子分散并活化，用過(guò)濾裝置進(jìn)行過(guò)濾，得到單孢子懸液，備用。（2）制備混菌平板：將滅菌后的PDA 培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)平板15mL 左右。吸取尖鐮孢菌孢子懸液150uL，加入到裝有50 mL 已滅好菌且溫度冷卻到55℃以下PDA 培養(yǎng)基的錐形瓶中，搖勻倒入已淺淺凝固一層PDA 培養(yǎng)基的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，靜置冷卻成混菌平板，備用。（3）濾紙片法測(cè)定脂肽粗提物的抗菌活性：將待測(cè)脂肽粗提物溶于甲醇中，使其濃度為5mg/ml，將直徑為6mm 的無(wú)菌濾紙片加入培養(yǎng)基中，并將10μL 待測(cè)脂肽粗提物逐滴添加到濾紙片上，以等量純甲醇作為對(duì)照。將平板置于28°C 溫育5 天，觀察且記錄下抑菌狀況。

3.結(jié)果

酶活性= 透明圈直徑/ 菌落直徑，蛋白酶活性：30.2mm/7.6mm=3.97；淀粉酶活性：12.5mm/9.1mm=1.37；纖維素酶活性：29.5mm/7.1mm=4.15。三種水解酶均有活性，纖維素酶活性最高，蛋白酶其次，淀粉酶最低。無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基：X13 菌落邊緣出現(xiàn)輕微透明圈，因此有輕微的解無(wú)機(jī)磷作用。有機(jī)磷培養(yǎng)基：X13 菌落周圍無(wú)透明圈產(chǎn)生。濾紙片法測(cè)定脂肽粗提物的抑菌圈直徑約32.0mm，而甲醇對(duì)照組則無(wú)抑菌活性。活性跟蹤測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脂肽粗提物對(duì)于尖鐮孢菌具有良好的抑菌活性。

4.結(jié)論與討論

（1）菌株X13 可產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶，具有較強(qiáng)的生物防治潛力和生物防治價(jià)值；（2）菌株X13 具有解無(wú)機(jī)磷能力，未表現(xiàn)出解有機(jī)磷能力；（3）菌株X13 的脂肽粗提物具有明顯的抑菌活性，可拮抗尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定芽孢桿菌具有水解酶活性和降解無(wú)機(jī)磷能力，及其次級(jí)代謝產(chǎn)物脂肽粗提物具有較強(qiáng)的抑菌活性，但脂肽粗提物中主要抑菌物質(zhì)還有待進(jìn)一步分離、純化及鑒定。