淺談豬精液保存在人工授精中的發(fā)展與展望

王利娟，常 棖

（北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

人工授精是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛、最有效的生豬繁殖技術(shù)。豬人工授精技術(shù)在我國養(yǎng)豬業(yè)已經(jīng)取得了很高的效率，對豬品種改良和選育做出了巨大貢獻。盡管豬冷凍精液技術(shù)取得了重大進展，但液體保存仍然是廣大豬場豬精子保存的主要方法。而在激烈的市場競爭中，人們希望通過提高精液保存的質(zhì)量來進一步提高育種效率。文章簡要回顧了過去和現(xiàn)在世界范圍內(nèi)豬液態(tài)精液和冷凍精液保存、應(yīng)用的情況，并對非洲豬瘟下改進豬精液保存技術(shù)助力生豬生產(chǎn)提出了建議。

1 發(fā)展情況

在全球的動物生產(chǎn)繁殖領(lǐng)域中，人工授精技術(shù)應(yīng)用十分廣泛，取得了極為可觀的成績。該技術(shù)的應(yīng)用，使得優(yōu)質(zhì)種公畜的配種率和利用率均得到了大幅提高，加速了優(yōu)質(zhì)家畜的改良進程，并且還克服了公母畜因為身體素質(zhì)、偏好、生殖器官異常等造成的配種困難，提高了生產(chǎn)繁育的安全性，減少了疾病的傳播；而且可以減少飼養(yǎng)種公畜所需要的場地、飼料、和勞動力等飼養(yǎng)成本。人工授精技術(shù)最先應(yīng)用到牛的生產(chǎn)繁殖中，而真正應(yīng)用到豬的生產(chǎn)中比牛要晚得多。在20世紀初期，來自俄羅斯的科研人員就嘗試進行對豬的人工輸精，這是有報道以來世界上第一次將該技術(shù)運用到豬身上。豬人工授精技術(shù)在1932年首次試驗成功，后來該技術(shù)在許多國家中運用；隨著技術(shù)的進步，日本和英國等幾個國家率先實現(xiàn)了將豬人工授精達到了實用水平。我國的豬人工授精技術(shù)推廣應(yīng)用在20世紀50年代開始試行，隨著我國生豬養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，該技術(shù)在20世紀70年代末開始得到了突飛猛進的發(fā)展，而后在全國得到了普及推廣，進一步提高了我國生豬生產(chǎn)的存欄量與良種質(zhì)量。而在國際方面，自從20世紀80年代人工授精獲得技術(shù)革新后，人工授精技術(shù)在極短的時間內(nèi)迅速普及到歐美多個發(fā)達國家中。目前，在歐美等發(fā)達國家及中國等主要的豬肉生產(chǎn)國中，人工授精技術(shù)在生豬繁殖的普及率在90% 以上。而豬精液保存水平的提高，是提高人工授精技術(shù)的首要環(huán)節(jié)，可以極大地提高公豬精液使用的時間性和地域性。

在20世紀30年代的前蘇聯(lián)，科學(xué)家率先進行了使用豬新鮮精液進行人工輸精的試驗并成功地產(chǎn)下仔豬，這是液態(tài)精液在豬人工授精成功使用的最早的報道。因為液態(tài)儲存法保存的精子呈現(xiàn)活力活性高、授精成功率較高且操作快捷方便等優(yōu)點，因此，液態(tài)保存的精液得到了了人們廣泛的傳播與應(yīng)用，隨后人們對于豬液態(tài)精液的保存技術(shù)研究更加精準(zhǔn)，推動了該技術(shù)飛速發(fā)展。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)表明，目前全世界每年都有將近1 000萬頭母豬利用人工授精來繁育仔豬，而其中絕大多數(shù)使用的是液態(tài)保存的精液，它們的受胎率均在75%~90%之間。隨著現(xiàn)代交通運輸業(yè)的不斷發(fā)展，液態(tài)保存精液的高效便利與相對較低的成本等優(yōu)點已經(jīng)凸顯出來，而這些優(yōu)點是冷凍精液無法比擬的。豬液態(tài)精液應(yīng)用于人工授精已經(jīng)成為生豬生產(chǎn)的主要方式，在提高種公豬的利用效率，推動豬人工授精技術(shù)的發(fā)展中具有重大意義。

在20世紀50年代及以后，冷凍精液的使用在養(yǎng)牛業(yè)中取得了巨大成功，極大地激起了養(yǎng)豬業(yè)應(yīng)用該技術(shù)的需求。因為豬精子在耐凍性上與其他家畜相比有著明顯的個體差異，到20世紀70年代中期冷凍豬精液并沒有直接被用于實際生產(chǎn)之中，而是在后來不斷地技術(shù)創(chuàng)造革新發(fā)展后才被成功引進生產(chǎn)中。由于精液冷凍方法繁瑣，冷凍精液活力、受胎率和產(chǎn)仔數(shù)等性能指標(biāo)不理想，導(dǎo)致冷凍精液在商業(yè)應(yīng)用中進展緩慢。近幾十年來，美國及歐洲一些國家的豬精液冷凍技術(shù)迅速發(fā)展，其豬精液冷凍后的質(zhì)量與牛相比已經(jīng)非常接近了。但因豬冷凍精液的技術(shù)目前主要還是參照于牛冷凍精液的技術(shù)流程，且尚未有明確的針對豬精子的特性的冷凍程序及方法，目前的豬冷凍精液仍然存在凍融后活力下降，部分精子冷凍損傷，精子輸送效率降低，在生殖道存活時間短等問題，加上冷凍程序繁瑣，成本昂貴的因素，在豬場凍精的普及率上遠遠不如液態(tài)精液。對此國內(nèi)外研究者開展了大量關(guān)于提高豬冷凍精液質(zhì)量的研究，并取得了積極進展，比如通過向冷凍稀釋液中添加某些物質(zhì)用來提高豬精子冷凍-解凍后的質(zhì)量。

2 應(yīng)用

2.1 人工輸精的進步

過去10年中，隨著集約化生豬養(yǎng)殖場的不斷發(fā)展，世界上主要的豬肉生產(chǎn)國中，豬人工授精的應(yīng)用比例達到了90% 以上。在豬人工授精使用的傳統(tǒng)方法是子宮頸輸精法（CAI），即在豬子宮頸第2~3褶皺部位輸入稀釋好的精液，劑量一般是每次至少30億個精子。而最新的豬子宮深部輸精法(PCAI)，則是在將常規(guī)輸精管插入子宮頸皺褶后，再插入比常規(guī)輸精管長0.15～0.2 m的輸精內(nèi)管，由于其長度較長，形狀較細，材質(zhì)較軟，因此它可以通過子宮頸皺褶進入子宮體，達到更加精準(zhǔn)高效的輸精效果。根據(jù)研究表明PCAI可直接將精液輸送到子宮體，避免了精液滯留在子宮頸皺褶處，可以減少精液的使用量，大大減少了精液的浪費，其精液劑量只需要保證每份精液中精子總數(shù)在10億個精子以上，即可達到與CAI相同的效果。近年來有實驗室報道已將PCAI精子使用數(shù)降至5億個也可達到相似效果?？梢姂?yīng)用PCAI技術(shù)，養(yǎng)豬生產(chǎn)者可以使優(yōu)質(zhì)公豬的精液對更多的母豬進行人工授精，極大地降低了優(yōu)質(zhì)精子采購成本，提高了精子的利用率。但該技術(shù)目前也存在一些缺點，就是在后備母豬上操作難度大，輸精管價格昂貴增加成本，而且如果操作不當(dāng)會給母豬帶來損傷，所以PCAI技術(shù)的應(yīng)用仍然具有挑戰(zhàn)性。而在公豬精液價格相對較低的國家和地區(qū)，PCAI似乎不太有吸引力。

2.2 性別分類控制技術(shù)

動物的性別分類控制技術(shù)是通過人為干預(yù)動物的正常生殖過程，使成年雌性動物產(chǎn)出人們期望性別后代的一門生物技術(shù)。性別控制技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中有著重大的意義。通過控制后代的性別比例，可充分發(fā)揮受性別限制和影響的生產(chǎn)性狀(如泌乳、生長速度、肉質(zhì)等)的最大經(jīng)濟效益。目前性別分類技術(shù)在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中的發(fā)展較為成熟，但是其在養(yǎng)豬業(yè)中的應(yīng)用還不夠全面。其實早在1991年，Johnson就報告了首例的豬精液性別分類方法，隨后該技術(shù)進行了改進，篩選儀器、軟件和精子分揀速度都有了進一步的發(fā)展，使其更適用于低劑量豬人工授精，但因為豬特殊的解剖結(jié)構(gòu)，仍然需要大量精子用于子宮頸內(nèi)人工授精，增加了養(yǎng)殖成本，從而限制了豬性別分類精子在生豬生產(chǎn)中的應(yīng)用。2006年由中國科學(xué)家主持研究的，世界首例通過分離x、y精子的性別控制技術(shù)進行人工授精而獲得的小水牛誕生。這種x、y精子分離技術(shù)被稱為貝爾茨維爾精子性別鑒定技術(shù)，而后性別控制技術(shù)結(jié)合人工授精開始廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中。2009年中國首例性別控制豬在廣西誕生，其中運用的性別控制技術(shù)與牛類似，即利用x精子和y精子之間DNA含量的差異，先將精液染色，然后利用x精子與y精子在流式細胞儀中的熒光強度不同，將兩者分離，最后用于人工授精技術(shù)，向受體母豬中輸入分離得到的x精子或y精子。但是在實驗過程中，豬比牛更為困難，具體其原因有：1）有研究表明，豬的x和y精子之間DNA含量的差異小，只有3.6%，不容易分辨；2）豬精子在進行分離處理過程中極易受損，在分離過程中，精子會被稀釋、染色、擠壓、激光照射等處理，稍微有一點處理不當(dāng)實驗就會失?。?）豬的人工授精需求量大，需要長時間進行分離。目前，精子按性別分類，其產(chǎn)生效率只有每小時20億～25億個精子，生產(chǎn)效率不高，而且在分離過程中會損失相當(dāng)數(shù)量的精子，從而產(chǎn)生相對較高的生產(chǎn)成本，加之由于豬人工授精技術(shù)的限制，當(dāng)養(yǎng)殖場在現(xiàn)有條件下使用性別分類精子時，生育能力和產(chǎn)仔數(shù)都會受到影響，因此性別控制技術(shù)批量應(yīng)用于生豬生產(chǎn)仍有一段路要走。

一些機構(gòu)已經(jīng)對性別冷凍精液進行了研究，這仍然是一件棘手的問題，因為從精子的保存方面來看，冷凍豬精子解凍后活力不高，而對精子的篩選又會不可避免地造成部分精子的死亡，加之較昂貴的成本成為阻遏該項技術(shù)發(fā)展的重要原因。所以不斷優(yōu)化性別篩選分類后豬精子的保存和使用技術(shù)，也是今后進一步的研究的方向。而對常規(guī)使用的豬精液冷凍保存技術(shù)的突破，可能會更好地促進保存性別分類精液的研究。

3 展望

在大多數(shù)豬肉生產(chǎn)國，保存的豬精液在人工授精中的應(yīng)用已得到充分證實。隨著對豬精液的分析、處理、智能管理和網(wǎng)絡(luò)信息等新技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展，大大提高了具有良種優(yōu)勢的豬精液利用效率。而與有效表型特征相關(guān)聯(lián)的DNA堿基選擇工具的出現(xiàn)為進一步提高人工授精的效率提供了幫助。然而全世界人工授精（AI）中僅有1% 是用冷凍解凍的豬精子進行的，雖然冷凍儲存的方法幫助了豬精子庫的建立，并且可以保存遺傳物質(zhì)幾十年。但有報告顯示，將精子在液氮中進行長期儲存會影響解凍后精子的質(zhì)量。而冷凍保存程序造成的損害，會直接降低冷凍解凍的豬精子的受精能力和人工授精后的繁殖性能。這種低溫損傷主要是由于豬精子對冷休克和過氧化損傷的高度敏感性，因為在其質(zhì)膜成分中含有很高的不飽和磷脂和低膽固醇。因此，冷凍-解凍程序會導(dǎo)致精子膜失穩(wěn)，從而影響鈣均質(zhì)酶、頂體完整性導(dǎo)致膜脂紊亂。但近年來豬冷凍保存技術(shù)有了飛速的進步，這些進步涉及冷凍保存程序之前的精子選擇、冷凍和解凍延長劑的添加劑、人工授精技術(shù)的相關(guān)性和受精-排卵間隔，相信隨著這些技術(shù)的進步能夠進一步解決豬精子冷凍帶來的損傷。在實際生產(chǎn)中，將科學(xué)研究與實際生產(chǎn)相結(jié)合是非常重要的，通過技術(shù)的進步引導(dǎo)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，將為我國恢復(fù)生豬生產(chǎn)提供良好的支撐。

對液體或冷凍狀態(tài)下將性別分類的精子引入人工授精實踐，也是為了實現(xiàn)生豬產(chǎn)業(yè)的復(fù)產(chǎn)擴繁這一目標(biāo)。對豬來說，將精子進行性別分類后的活力與受精能力均低于直接進行人工授精的精子。但有實驗表明，在一定條件下使用低至5×107的精子數(shù)目，仍然可以生產(chǎn)出所需性別的仔豬，結(jié)合目前子宮頸深部授精技術(shù)已經(jīng)取得了一些成功，需要進一步努力開發(fā)出更加適用于使用低精子數(shù)進行 PCAI的導(dǎo)管。在對照實驗中，使用特殊設(shè)計的導(dǎo)管可提高母豬的受孕率，減少對精子的浪費，提高利用率。而在這一研究領(lǐng)域的成功讓性別分類精液在養(yǎng)豬業(yè)中廣泛應(yīng)用成為了可能。在K.Willenburg的報告中，總結(jié)了目前人們對豬的性別分類精液做出的努力，盡管之前相對較低的性別分類精子數(shù)限制了其在豬人工授精的應(yīng)用，但隨著科技的進步這一情況正發(fā)生著積極地改善。科學(xué)家們認為，通過篩選出來的豬性別精子可以戰(zhàn)略性地應(yīng)用于養(yǎng)豬業(yè)，以滿足對雄性和雌性豬的不同需求。目前正在研究利用其他生物技術(shù)的最新進展，來替代目前流式細胞術(shù)的方法，這包括通過微流控制設(shè)備對精子進行分類，以金納米顆粒為載體對單個精子進行序列特異性標(biāo)記或基因編輯，以誘導(dǎo)SYR基因的敲除或干擾，并直接影響帶有Y染色體的精子的功能。

目前，非洲豬瘟的全球蔓延對生物安全提出了挑戰(zhàn)，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了極大威脅。盡管疾病預(yù)防和檢測技術(shù)在當(dāng)前的形勢下發(fā)揮了很大作用，但是抵抗關(guān)鍵病原體進入的全面保護機制，沒有辦法被充分保證。而引起母豬繁殖失敗或嚴重疾病的病毒，如豬藍耳?。≒RRS）、豬流行性腹瀉（PED）或 非洲豬瘟（ASF），很可能會通過臨床上未確診的公豬精液傳播?，F(xiàn)在CRISPR/Cas9技術(shù)可用于產(chǎn)生抗PRRS等病毒的公豬。如果實驗用的公豬符合政府的規(guī)定，并且可以滿足消費者的需求，那么對它們經(jīng)過基因工程處理，可以極大地提高養(yǎng)殖場的生產(chǎn)力。如果相關(guān)實驗人員使用紙質(zhì)微流控設(shè)備和高速DNA擴增技術(shù)，對公豬精液進行多種病原體的快速現(xiàn)場診斷，那么其將成為性價比高、便于使用和有效預(yù)防豬病的最佳工具。隨著冷凍精液技術(shù)的發(fā)展，可以將檢測沒有病原體的精液進行冷凍保存，使用這種方式可以安全而高效地應(yīng)用于生豬生產(chǎn)中。