不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體在COPD中的研究進(jìn)展

楊 玥，卞 濤

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院 呼吸與危重癥科， 江蘇 無(wú)錫 214000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種與增齡相關(guān)的慢性氣道炎性疾病，以持續(xù)存在的呼吸道癥狀和氣流受限為特征，與長(zhǎng)期的香煙煙霧或其他有害氣體吸入有關(guān)[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)刺激可以誘發(fā)多種類型細(xì)胞如支氣管上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向外界分泌細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)。根據(jù)直徑大小，EVs分為外泌體、微粒、凋亡小體及癌小體，其中外泌體是占據(jù)比重最大的細(xì)胞外囊泡[2]，上述類型細(xì)胞通過釋放外泌體與鄰近各種細(xì)胞,如支氣管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致黏液高分泌，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，肺泡上皮細(xì)胞凋亡等，最終發(fā)生氣道重構(gòu)與肺氣腫，是COPD發(fā)病機(jī)制研究的新熱點(diǎn)。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的發(fā)現(xiàn)

外泌體是一種直徑40～100 nm的盤狀囊泡，在1983年， 首次于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，1987年命

名為“exosome”[3]。2007年首次發(fā)現(xiàn)外泌體可以攜帶mRNA及miRNA,并且可以進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行翻譯表達(dá)相關(guān)蛋白[4]。之后，外泌體可以作為遺傳物質(zhì)載體這一觀點(diǎn)被廣泛接受。

1.2 外泌體的成分

外泌體的脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)包裹大量?jī)?nèi)容物，主要包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、miRNA、lncRNA和DNA。

蛋白質(zhì)是外泌體中最早研究的物質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)不同類型細(xì)胞所分泌的外泌體不僅有同樣的蛋白質(zhì)成分，而且包含分泌細(xì)胞所特有的蛋白。前者包括外泌體膜與受體細(xì)胞融合相關(guān)的Rabs蛋白，具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白，參與外泌體運(yùn)輸?shù)?跨膜蛋白家族(CD63、CD81 和CD9)、熱休克蛋白家族、各種代謝酶類、核糖體蛋白(RPS3)、信號(hào)傳導(dǎo)因子、黏附因子、細(xì)胞骨架蛋白以及泛素,等等，后者如結(jié)腸上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體含有A33蛋白， 抗原提呈細(xì)胞來(lái)源外泌體特有MHC-Ⅱ、CD86，T淋巴細(xì)胞來(lái)源外泌體特有的顆粒酶與穿孔素，腫瘤細(xì)胞來(lái)源外泌體特有的腫瘤相關(guān)抗原以及中性粒細(xì)胞來(lái)源外泌體表面帶有中性粒細(xì)胞特異性酯酶，等等[5]。

脂質(zhì)的相關(guān)研究相對(duì)較少，其組成因來(lái)源細(xì)胞不同而有所區(qū)別，外泌體富含鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸和膽固醇，此外還包含神經(jīng)節(jié)苷脂，飽和脂肪酸和神經(jīng)酰胺，對(duì)維持外泌體內(nèi)核酸在細(xì)胞外液中的穩(wěn)定起到重要作用[6]。

外泌體中核酸物質(zhì)包括DNA,各種編碼及非編碼RNA，自2007年以來(lái)一直是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。外泌體中的RNA可以運(yùn)輸至相鄰細(xì)胞或隨著體液遠(yuǎn)程運(yùn)輸，進(jìn)入到受體細(xì)胞內(nèi)仍然保持其生物活性，可以通過轉(zhuǎn)錄、翻譯或直接作用于蛋白質(zhì)水平影響受體細(xì)胞蛋白表達(dá)，是外泌體的重要生物學(xué)特征[7]。

2 在COPD中各種類型細(xì)胞來(lái)源外泌體的作用

2.1 支氣管上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體

支氣管上皮細(xì)胞是與空氣中有毒害物質(zhì)接觸的最主要細(xì)胞之一，在香煙煙霧刺激下能分泌多種細(xì)胞因子及趨化因子，作用于周圍的平滑肌細(xì)胞和間充質(zhì)成纖維細(xì)胞，并且有募集炎性細(xì)胞的作用，在COPD的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[8]。支氣管上皮細(xì)胞是肺內(nèi)外泌體的主要生產(chǎn)者。香煙煙霧刺激通過耗竭支氣管上皮細(xì)胞表面巰基，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧，導(dǎo)致更多的病理性外泌體的釋放[9]，通過旁分泌方式作用于周圍支氣管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，這是導(dǎo)致COPD小氣道重構(gòu)及肺氣腫的重要機(jī)制之一。

氣道上皮之間可以通過外泌體進(jìn)行信息交流。原代支氣管上皮細(xì)胞HTBE分泌的主要是基本的先天保護(hù)性蛋白，包括黏蛋白5B，而培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞系Calu-3分泌的主要是病理相關(guān)蛋白，包括黏蛋白5AC。交換兩種細(xì)胞上清內(nèi)的外泌體之后，HTBE的外泌體中miRNA普遍升高，細(xì)胞的黏蛋白分泌顯著增加，反之，Calu-3的分泌則沒有明顯改變[10]。

除了氣道上皮之間能夠通過外泌體進(jìn)行溝通交流，氣道上皮與巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞之間也可以通過外泌體進(jìn)行信息傳遞，參與COPD多種病理過程。

氣道上皮細(xì)胞通過釋放外泌體參與COPD氣道重構(gòu)。CSE刺激下人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)分泌出的外泌體中檢測(cè)出更高水平的miR-21，外泌體進(jìn)入人髓系白血病單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞后，進(jìn)一步提高THP-1細(xì)胞內(nèi)的miR-21的水平，使THP-1細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化的同時(shí)伸出偽足，分泌更多的巨噬細(xì)胞特征性細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)等，反向促進(jìn)BEAS-2B發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[2](圖1A)。但是在CSE刺激早期支氣管上皮細(xì)胞保護(hù)性地減少外泌體內(nèi)miR-21的分泌，這是一種早期的代償機(jī)制。同樣的，人支氣管上皮細(xì)胞HBE在CSE刺激之后，外泌體中miR-21含量增加，與HBE共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞內(nèi)吞外泌體后，細(xì)胞內(nèi)的miR-21水平隨之增加，靶向降低pVHL水平，進(jìn)而使缺氧誘導(dǎo)因子1α水平升高，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，Ⅰ型膠原增加，引起氣道重塑[11](圖1B)。CSE刺激下BEAS-2B細(xì)胞外泌體中miR-210含量增加通過引起共培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)降低，自噬減少，人成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化。提示支氣管上皮細(xì)胞通過外泌體與周圍細(xì)胞交聯(lián)，是長(zhǎng)期香煙煙霧刺激致COPD氣道重塑的重要原因[12](圖1B)。

氣道上皮細(xì)胞釋放外泌體參與COPD肺氣腫的形成。BEAS-2B在CSE刺激下產(chǎn)生的外泌體中含有半胱氨酸富集蛋白61(cysteine-rich protein 61, CYR61/CCN1)的陽(yáng)性胞體從29%升高至45%，在纖維蛋白酶的作用下外泌體中的全長(zhǎng)型CCN1裂解形成剪切型CCN1，隨之引起基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP1)水平提升,而MMP1是與肺氣腫發(fā)生高度相關(guān)的經(jīng)典蛋白酶，其引起肺泡細(xì)胞凋亡增加，肺泡間隔破壞[13]。支氣管上皮細(xì)胞在香煙煙霧刺激下分泌出含有更多CCN1的外泌體，可能通過MMP1導(dǎo)致肺氣腫的產(chǎn)生(圖1C)。

A.exosomal miR-21 derived from bronchial epithelial cells promotes the differentiation of THP-1 into M2 macrophages; B.exosomal miR-21 and miR-210 in exosomes from bronchial epithelial cells promote the differentiation of fibroblasts into myofibroblasts; C.CCN1 in exosomes derived from bronchial epithelial cells induces alveolar apoptosis via MMP1; D. the reduce of SOCS1 and SOCS3 in exosomes derived from macrophages makes the protective and anti-inflammatory effects disappear; E. elastase bounded on the surface of exosomes derived from neutrophils promotes the occurrence of emphysema

2.2 炎性細(xì)胞來(lái)源的外泌體

巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是構(gòu)成COPD慢性炎性反應(yīng)的重要細(xì)胞，在COPD小鼠模型和COPD患者的肺泡灌洗液、肺組織中均發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增多[14]。

2.2.1 巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體：巨噬細(xì)胞是肺泡常駐免疫細(xì)胞。正常情況下，肺泡內(nèi)僅含少量的巨噬細(xì)胞，香煙煙霧等有毒有害顆粒和氣體可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和活化，活化的巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素8(interleukin 8,IL-8)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白三烯B4等炎性因子，破壞周圍的肺實(shí)質(zhì)。因此，巨噬細(xì)胞活化是COPD氣腫發(fā)生發(fā)展的重要原因[15]。

肺泡上皮和鄰近的肺泡巨噬細(xì)胞在生理和病理狀態(tài)下均有密切交流。肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages, AM)的形成與肺泡上皮細(xì)胞分泌的表面活性蛋白A、TNF-α、IL-10和前列腺素E2有關(guān)[16]。生理狀態(tài)下， 肺泡巨噬細(xì)胞可以向鄰近的肺泡上皮細(xì)胞釋放含有細(xì)胞因子信號(hào)抑制分子1(suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)的外泌體和富含細(xì)胞因子信號(hào)抑制分子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的微囊泡。炎性因子激活JAK/STAT通路，STATs磷酸化后形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo)蛋白表達(dá)，而細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子SOCS蛋白家族可通過使JAKs的細(xì)胞因子受體磷酸化，阻斷細(xì)胞因子對(duì)JAK的激活，切斷JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路[17]。AM來(lái)源的微粒進(jìn)入肺泡上皮細(xì)胞后，SOCS1和SOCS3可以抑制胞內(nèi)由炎性因子刺激導(dǎo)致的JAK/STAT通路的激活，阻止炎性反應(yīng)的放大,從而維持肺泡周圍微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[18]。香煙煙霧刺激下，AM數(shù)量顯著增加，相反的，通過AM分泌外泌體和微囊中包含的SOCS1和SOCS3蛋白水平減少，使肺泡巨噬細(xì)胞的保護(hù)抗感染作用消失(圖1D)。這一現(xiàn)象為探討香煙煙霧等有毒有害顆粒和氣體導(dǎo)致肺氣腫的機(jī)制提供了新思路。

2.2.2 中性粒細(xì)胞來(lái)源的外泌體:中性粒細(xì)胞是COPD主要炎性細(xì)胞之一，吸入有毒有害顆粒和氣體后，肺內(nèi)中性粒細(xì)胞募集活化，向周圍釋放彈力蛋白酶、多種細(xì)胞因子及氧自由基，同時(shí)中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)形成增加[19-20]。中性粒細(xì)胞釋放蛋白酶過量或肺內(nèi)抗蛋白酶活性降低，蛋白酶/抗蛋白酶失衡會(huì)使肺泡外的彈性蛋白和Ⅰ型膠原被結(jié)合降解，導(dǎo)致肺氣腫發(fā)生[21-22]。

與不吸煙正常人相比，在COPD患者肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞來(lái)源外泌體表面結(jié)合有大量中性粒細(xì)胞彈力蛋白酶。進(jìn)一步將COPD患者的肺泡灌洗液通過氣管滴注處理小鼠后，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)明顯的肺氣腫。在細(xì)胞水平上，活化的中性粒細(xì)胞會(huì)分泌更多的外泌體，中性粒細(xì)胞彈力蛋白酶以膜結(jié)合蛋白的形式黏附在外泌體表面，不僅有經(jīng)典途徑分泌的中性粒細(xì)胞彈力蛋白酶一樣的活性，而且可以準(zhǔn)確定位于Ⅰ型膠原[23]。中性粒細(xì)胞來(lái)源外泌體調(diào)節(jié)可以作為治療COPD肺氣腫的新靶點(diǎn)(圖1E)。

2.2.3 干細(xì)胞來(lái)源的外泌體:外泌體具有免疫排斥少，內(nèi)含物穩(wěn)定，半衰期長(zhǎng)和靶向傳遞的優(yōu)勢(shì)，其中，人間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞衍生的外泌體是無(wú)細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)的有前途的治療劑，在腫瘤疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病和心血管系統(tǒng)疾病等中均有應(yīng)用[24]。干細(xì)胞來(lái)源外泌體在COPD治療方面也已經(jīng)有了初步的研究。間充質(zhì)干細(xì)胞釋放出的外泌體可以緩解CSE誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙，同時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合其外泌體腹腔注射可以減輕香煙煙霧刺激引起的小鼠氣道炎性反應(yīng)[25]；人胎盤提取的間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體與免疫調(diào)節(jié)因子混合，在小鼠和臨床實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)其具有促進(jìn)抗炎因子釋放、減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、改善肺功能等作用[26]；脂肪干細(xì)胞衍生的人工外泌體同樣具有生物活性，可在較低劑量促進(jìn)Ⅱ型肺泡上皮增殖，經(jīng)氣管內(nèi)滴注后，其可通過增加小鼠肺部成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)蛋白水平而有效地緩解彈力蛋白酶構(gòu)建的小鼠肺氣腫，為未來(lái)在治療COPD肺氣腫提供了新的思路[27]。

3 問題與展望

綜上所述，外泌體是近年來(lái)受到廣泛關(guān)注的細(xì)胞間通訊工具和靶向治療藥物載體，可能是肺內(nèi)各類細(xì)胞交流的關(guān)鍵因素。有毒有害顆粒及氣體刺激下，肺內(nèi)多種細(xì)胞通過外泌體相互溝通，參與COPD病理特征形成，同時(shí)，干細(xì)胞來(lái)源外泌體可應(yīng)用于COPD的治療。雖然對(duì)外泌體與COPD的關(guān)系的研究越來(lái)越多，但是外泌體在COPD臨床應(yīng)用方面的價(jià)值仍待進(jìn)一步探索。

外泌體一定程度上可以反應(yīng)細(xì)胞狀態(tài)，是細(xì)胞向周圍甚至遠(yuǎn)隔細(xì)胞傳遞信息的橋梁。理論上，根據(jù)這些信息的組合及分析可以判斷疾病的發(fā)生、嚴(yán)重程度和預(yù)后等。但是由于在體液中尤其是肺泡灌洗液中，提取外泌體往往較為困難，因此，外泌體在COPD中的應(yīng)用還較少。近年來(lái)外泌體分離和檢測(cè)技術(shù)日漸成熟，高通量檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)的逐漸完善，其他疾病中外泌體在診斷、治療和預(yù)后方面的應(yīng)用不斷增多，為外泌體在COPD方面應(yīng)用打下基礎(chǔ)，在不久的將來(lái)，外泌體用以作為監(jiān)測(cè)COPD疾病進(jìn)程和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)估的標(biāo)志物也將成為可能。