白藜蘆醇減輕腦創(chuàng)傷大鼠炎性反應(yīng)及神經(jīng)元凋亡

簡(jiǎn) 宇，代凌云，吳豐學(xué)

(荊州市中心醫(yī)院 急診科， 湖北 荊州 443000)

腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury，TBI)是一種致殘率及致死率極高的腦部疾病，患者常會(huì)出現(xiàn)非血腫性、遷延性昏迷或重度神經(jīng)功能損傷，同時(shí)TBI往往還伴隨繼發(fā)性損傷，如神經(jīng)炎性反應(yīng)、線(xiàn)粒體功能障礙、DNA氧化損傷、DNA自身修復(fù)功能障礙及神經(jīng)細(xì)胞凋亡等，進(jìn)一步加重腦部組織損傷[1]。TBI患者治療后仍有不同程度的后遺癥，如運(yùn)動(dòng)障礙、偏癱及認(rèn)知下降等[2]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。白藜蘆醇(resveratrol，RV)又稱(chēng)芪三酚，是多酚類(lèi)化合物，其在腦缺血再灌注損傷中有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[3]。 RV還可調(diào)控Notch信號(hào)通路作用于宮頸癌[4]和肝損傷[5]等，但其是否可通過(guò)Notch信號(hào)通路保護(hù)TBI還不清楚。本文旨在研究RV對(duì)TBI大鼠神經(jīng)的保護(hù)作用，并從Notch信號(hào)通路分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)、成年、雄性SD大鼠，6月齡，體質(zhì)量180～220 g[北京信生元生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0027]。

1.1.2 試劑與儀器:白藜蘆醇(Sigma Aidrich公司)；ELISA試劑盒(YAD公司)；Notch1、Hes1、含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)、B細(xì)胞淋巴瘤蛋白 2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)及Bcl-2 相關(guān)蛋白(Bcl-2 assaciated X protein，Bax)一抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：采用液壓打擊法[6]構(gòu)建顱腦創(chuàng)傷大鼠模型，將大鼠分為對(duì)照組、模型組、白藜蘆醇低、中和高劑量組(舌下靜脈分別注射5、10和20 mg/kg RV[7])，每組8只。

1.2.2 Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力：待大鼠適應(yīng)環(huán)境并學(xué)習(xí)游泳后，進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試；將安全島依次放入水迷宮內(nèi)，再加入混有牛奶的水(牛奶∶水=2∶1，溫度約22 ℃)，漫過(guò)安全島約2 cm；隨機(jī)從4個(gè)象限中放入大鼠，記錄大鼠搜索安全島潛伏期和游泳軌跡。

1.2.3 HE染色病理檢測(cè)：取出腦組織(切除額葉、小腦部分，保留中間組織)固定于多聚甲醛過(guò)夜，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片操作及蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)。

1.2.4 TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡：參照上述方法制備腦組織切片，滴加3% H2O2反應(yīng)10 min；加入蛋白酶，37 ℃孵育10 min，再加入標(biāo)記液，37 ℃孵育2 h；加入封閉液，室溫下反應(yīng)30 min；加入生物素化抗地高辛抗體，37 ℃反應(yīng)30 min；滴加鏈酶親和素-過(guò)氧化物酶(SABC)液，37 ℃反應(yīng)30 min；添加二氨基苯聯(lián)安(DAB)顯色，經(jīng)蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察神經(jīng)元凋亡數(shù)(細(xì)胞核中有棕黃色顆粒)，計(jì)算凋亡指數(shù)(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.2.5 ELISA檢測(cè)炎性因子的含量：大鼠腦組織加入0.9%氯化鈉溶液冰上勻漿，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)腦組織中炎性因子白介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的含量。

1.2.6 Western blot檢測(cè)腦組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)：在液氮中研磨腦組織成粉末，添加RIPA裂解液提取樣本中總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度；取50 μg左右蛋白進(jìn)行凝膠電泳，SDS-PAGE凝膠濃度為10%；待溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠底部時(shí)，切割凝膠至合適大小，進(jìn)行電轉(zhuǎn)；90 min后取出PVDF膜，孵育封閉液、一抗及二抗，進(jìn)行免疫反應(yīng)；最后采用全自動(dòng)凝膠成像儀檢測(cè)蛋白條帶，并計(jì)算Notch1、Hes1、caspase-3、Bcl-2及Bax等蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)腦創(chuàng)傷大鼠學(xué)習(xí)和記憶力的影響

與對(duì)照組相比，TBI組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡、搜索安全島潛伏期明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，RV 3個(gè)劑量組運(yùn)動(dòng)軌跡、搜索安全島潛伏期呈濃度依賴(lài)性明顯縮短(P<0.05)(圖1)。

2.2 白藜蘆醇對(duì)腦創(chuàng)傷大鼠海馬區(qū)損傷的影響

TBI模型大鼠海馬CA1區(qū)表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞排列紊亂，且出現(xiàn)明顯的皺縮，胞質(zhì)染色增強(qiáng)；與模型組相比，RV 3個(gè)劑量組CA1區(qū)明顯減輕(圖2)。

圖2 白藜蘆醇對(duì)腦創(chuàng)傷大鼠海馬區(qū)(CA1)損傷的影響Fig 2 Effects of RV on hippocampus (CA1) injury in TBI rats(×40)

2.3 白藜蘆醇對(duì)腦創(chuàng)傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，TBI組神經(jīng)元凋亡指數(shù)、腦組織中caspase-3的表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2/Bax水平顯著下調(diào)(P<0.05)；與TBI組相比，RV 3個(gè)劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)、腦組織中caspase-3的表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2/Bax水平呈劑量依賴(lài)顯著上調(diào)(P<0.05)(圖3)。

A.effects of resveratrol on neuron apoptosis index in TBI rats; B.effects of resveratrol on the expression of apoptosis proteins in brain tissues of TBI rats; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with TBI

2.4 白藜蘆醇對(duì)腦創(chuàng)傷大鼠腦組織炎性因子水平的影響

與對(duì)照組相比，TBI組腦組織中IL-6、TNF-α及IL-1β水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與TBI組相比，RV低、中、高劑量組IL-6、TNF-α及IL-1β水平呈劑量依賴(lài)性顯著下調(diào)(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with TBI圖4 白藜蘆醇對(duì)腦創(chuàng)傷大鼠腦組織炎性因子水平的影響Fig 4 Effects of RV onlevels of inflammatory factors inbrain tissue of TBI

2.5 白藜蘆醇對(duì)腦創(chuàng)傷大鼠腦組織Notch及Hes1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，TBI組腦組織中Notch1和Hes1水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與TBI組相比，RV低、中、高劑量組Notch1和Hes1水平呈劑量依賴(lài)性顯著下調(diào)(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with TBI圖5 白藜蘆醇對(duì)腦創(chuàng)傷大鼠腦組織Notch及Hes1蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effects of RV on expression of Notch and Hes1 protein inbrain tissue of TBI

3 討論

常見(jiàn)的TBI動(dòng)物模型大多為閉合性腦創(chuàng)傷[8]，本研究采用液壓打擊法處理大鼠，導(dǎo)致TBI大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的損傷，表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞排列紊亂，明顯皺縮及胞質(zhì)染色增強(qiáng)；且TBI組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡及搜索安全島潛伏期明顯延長(zhǎng)，表明成功復(fù)制TBI模型。RV廣泛存在于花生、葡萄和桑椹等植物中，具有抗腫瘤、抗感染和抗氧化等作用，可保護(hù)心血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等[9]。本研究發(fā)現(xiàn)RV可明顯減輕大鼠海馬CA1區(qū)損傷，神經(jīng)細(xì)胞量增多，明顯恢復(fù)胞核固縮；RV組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡及搜索安全島潛伏期較TBI組明顯縮短，提示RV對(duì)于TBI大鼠神經(jīng)損傷具有一定的保護(hù)作用，與文獻(xiàn)報(bào)道[10]相似。

Caspase-3、Bcl-2及Bax是細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白，caspase-3是凋亡的主要執(zhí)行者，其激活后將直接切割細(xì)胞中的生命大分子；而B(niǎo)cl-2可減少氧自由基、脂質(zhì)過(guò)氧化物及多種細(xì)胞毒性因子的形成，而具有抗凋亡作用，Bax具有促凋亡作用，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax水平可以反映凋亡情況[11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TBI可誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元的凋亡，而RV可以抑制caspase-3的表達(dá)，并上調(diào)Bcl-2/Bax水平，抑制TBI大鼠神經(jīng)元的凋亡。

神經(jīng)炎性反應(yīng)是TBI繼發(fā)性損傷的重要病理基礎(chǔ)之一，腦外傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)募集白細(xì)胞，釋放多種炎性因子，如IL-6、TNF-α及IL-1β等，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大炎癥信號(hào)，破壞血腦屏障和線(xiàn)粒體功能，進(jìn)而產(chǎn)生氧化損傷，加劇神經(jīng)的壞死和功能障礙[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，RV組大鼠腦組織中IL-6、TNF-α及IL-1β水平顯著下調(diào)，表明RV可能通過(guò)減輕TBI大鼠神經(jīng)炎性反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

Notch信號(hào)通路在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)育中具有重要作用，而且參與調(diào)控組織和器官受損后的修復(fù)[14]。Notch信號(hào)通路的激活會(huì)增加神經(jīng)細(xì)胞的易損性，引起腦功能障礙[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，RV預(yù)處理后，腦組織中Notch1和Hes1的表達(dá)呈劑量依賴(lài)性下調(diào)，提示RV可能通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路，而保護(hù)TBI大鼠腦損傷。

綜上所述，白藜蘆醇可保護(hù)大鼠神經(jīng)損傷，改善其學(xué)習(xí)和記憶功能，抑制神經(jīng)元的凋亡，并減輕大鼠炎性反應(yīng)，可能與下調(diào)Notch1和Hes1的表達(dá)有關(guān)。