不同乙醇置換處理對(duì)小麥小孢子和花粉育性檢測(cè)的影響

劉海英，甄俊琦，茹振鋼，張亞娟，馮必得，景秀秀，王 瑩

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；2.河南科技學(xué)院小麥中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

小麥?zhǔn)侵袊?guó)重要的糧食作物之一，小麥生產(chǎn)對(duì)保障國(guó)家糧食安全具有重要意義[1]。雜種優(yōu)勢(shì)利用是提高小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的有效途徑[2]。BS系列、CS系列、ES系列的育成，使我國(guó)在二系法雜交小麥研究和應(yīng)用領(lǐng)域居于世界領(lǐng)先水平[3-6]。小麥溫敏雄性不育系BNS366由河南科技學(xué)院育成，抽穗前日平均溫度低于8.9 ℃時(shí)徹底不育[7]，在小麥雜交制種中的應(yīng)用逐漸擴(kuò)大，以其近等基因系鄭麥366為對(duì)照構(gòu)建試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，揭示其花粉敗育機(jī)理具有重要的理論意義。開(kāi)展小孢子發(fā)育過(guò)程的細(xì)胞學(xué)觀察和花粉育性檢測(cè)，是進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究的基礎(chǔ)。

前人對(duì)小麥小孢子發(fā)育和育性檢測(cè)開(kāi)展了廣泛研究，常用I2-KI法觀察小孢子內(nèi)的淀粉積累情況[7-10]，用DAPI染色法觀察細(xì)胞核情況[10-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AA固定一段時(shí)間后，采用I2-KI法可以清晰顯示小孢子內(nèi)淀粉積累情況，采用DAPI法染色時(shí)小麥三核期小孢子細(xì)胞質(zhì)呈白色渾濁狀，細(xì)胞核模糊，且FAA對(duì)操作人員會(huì)造成化學(xué)燒傷，敏感人群易引起頭面部皮膚過(guò)敏或潰爛等傷害，不利于大量開(kāi)展細(xì)胞學(xué)研究(內(nèi)部資料未發(fā)表)。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AA固定液固定小麥穗24 h后，采用90%-80%-70%-70%梯度置換固定液(每次置換時(shí)間均為30 min)，最后轉(zhuǎn)入70%乙醇中保持備用，再經(jīng)I2-KI法和DAPI法染色均可以取得良好的細(xì)胞學(xué)觀察效果[13]，但需要消耗大量乙醇，且操作時(shí)間長(zhǎng)。前人有關(guān)小孢子細(xì)胞學(xué)觀察的研究中，采用FAA固定后，進(jìn)行乙醇置換的處理各有不同，其對(duì)細(xì)胞圖像的清晰度影響是否存在差異尚未見(jiàn)報(bào)道。

為此，本試驗(yàn)以鄭麥366和BNS366為試驗(yàn)材料，用 FAA固定液固定小麥穗后，進(jìn)行3種乙醇置換處理，對(duì)比I2-KI法和DAPI法染色效果，并將其與花粉育性統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行比較，以明確小麥小孢子發(fā)育細(xì)胞學(xué)觀察和花粉育性檢測(cè)的適宜乙醇置換處理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)材料種植于河南師范大學(xué)小麥試驗(yàn)田，屬黃淮麥區(qū)(東經(jīng)113°54′，北緯35°19′，海拔 76.3 m)，暖溫帶大陸性氣候。

1.2 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

以溫敏小麥雄性不育系BNS366及其近等基因系鄭麥366為供試材料，均由河南科技學(xué)院小麥中心提供。所有材料于2018年10月10日正常秋播，按一般大田管理方式栽培，次年選代表型植株主莖穗進(jìn)行研究。

試驗(yàn)以FAA(50%乙醇∶冰醋酸∶福爾馬林= 18∶1∶1)為固定液。參照劉海英等[14]的農(nóng)藝特征判斷標(biāo)準(zhǔn)，配合醋酸洋紅染色鏡檢結(jié)果，確定取樣時(shí)期，于小孢子發(fā)育的單核期、二核期、三核期和開(kāi)花期，上午9:00-10:00，各選取10穗代表型植株主莖穗，剪去頂部與基部各6個(gè)小穗，置于FAA固定液中，0.034×105Pa抽真空30 min后在4 ℃條件下固定24 h，然后采取不同乙醇置換處理進(jìn)行后續(xù)處理，具體如下：

90%-80%-70%：移除FAA，按順序經(jīng)過(guò)90%和80%乙醇梯度置換各30 min，最后轉(zhuǎn)入70%乙醇中，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

70%-70%：移除FAA，用70%乙醇置換30 min后，轉(zhuǎn)入70%乙醇中在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

不置換：繼續(xù)保存于FAA固定液中，不進(jìn)行乙醇置換。

1.3 細(xì)胞學(xué)觀察

分別取經(jīng)不同乙醇置換處理后的材料，按照劉海英等[13]的方法進(jìn)行I2-KI法和DAPI法染色和制片，在Leica DMIL倒置熒光顯微鏡下(目鏡10×，物鏡20×)觀察小孢子發(fā)育過(guò)程觀察并統(tǒng)計(jì)花粉育性[13-14]。

1.4 自交結(jié)實(shí)率調(diào)查統(tǒng)計(jì)

于抽穗后開(kāi)花前隨機(jī)選取10個(gè)麥穗分別套袋，成熟期按國(guó)內(nèi)法[8]調(diào)查和統(tǒng)計(jì)自交結(jié)實(shí)率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乙醇置換處理對(duì)小麥小孢子發(fā)育進(jìn)程中不同染色法染色效果的影響

2.1.1 對(duì)I2-KI法染色效果的影響

由圖1可知，采用FAA固定后經(jīng)90%-80%-70%處理，I2-KI法染色后，在單核期，鄭麥366(圖1A)和BNS366小孢子(圖1E)均可以觀察到一個(gè)被染至黑褐色的細(xì)胞核，與鄭麥366相比，BNS366的細(xì)胞核辨識(shí)度相對(duì)較高。在二核期之后，絕大部分鄭麥366小孢子形狀規(guī)則，始終維持圓形，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)淀粉積累，并隨著發(fā)育進(jìn)程繼續(xù)，積累量逐漸增加，至開(kāi)花期充滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞，其細(xì)胞核在二核期由于淀粉遮擋模糊難辨，至三核期之后被遮擋程度加重以致完全無(wú)法顯示；BNS366的小孢子在二核期之后開(kāi)始出現(xiàn)皺縮變形，僅有少數(shù)淀粉積累，大部分細(xì)胞難以正常進(jìn)入二核期，細(xì)胞核逐漸減小甚至消失。由圖2可知，與90%-80%-70%處理相比，采用70%-70%處理，I2-KI法染色后，在二核期，細(xì)胞核辨識(shí)度略有提高，但同樣由于染色區(qū)域的遮擋難以滿(mǎn)足細(xì)胞學(xué)觀察的要求；二核期之后鄭麥366淀粉積累區(qū)域顯色略深，BNS366細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核區(qū)域仍呈I2-KI溶液本身的黃褐色，其顏色也略深，但均不影響開(kāi)花期花粉育性的判斷。由圖3可知，與90%-80%-70%和70%-70%處理相比，不置換處理的細(xì)胞核辨識(shí)度和70%-70%較為接近，且二核期后鄭麥366淀粉積累區(qū)域顯色和BNS366細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核區(qū)域黃褐色均較深。

以上結(jié)果說(shuō)明，從單核期向二核期轉(zhuǎn)變的階段為BNS366小孢子的敗育時(shí)期。三種乙醇置換處理下，I2-KI法染色均可以清晰顯示小孢子內(nèi)淀粉積累情況，可輔助判斷花粉育性，按小孢子內(nèi)淀粉積累區(qū)域顏色由深到淺排序?yàn)椋翰恢脫Q>70%-70%>90%-80%-70%。但因染色區(qū)域存在淀粉遮擋，均無(wú)法觀察小孢子二核期之后的細(xì)胞核發(fā)育情況。

A～D:鄭麥366; E～F:BNS366; A、E:單核期; B、F:二核期; C、G:三核期; D、H:開(kāi)花期. 下同。

圖2 70%-70%處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的I2-KI染色結(jié)果Fig.2 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 treated with 70%-70% ethanol replacement and stained with I2-KI

圖3 不置換處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的I2-KI染色結(jié)果Fig.3 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 with non-replacement and stained with I2-KI

2.1.2 對(duì)DAPI法染色效果的影響

由圖4、圖5和圖6可知，采用FAA固定后采用不同乙醇置換，DAPI法染色與I2-KI法染色觀察到的鄭麥366和BNS366小孢子發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞外形的變化和內(nèi)容物的積累情況相似，不同之處在于細(xì)胞內(nèi)容物積累情況僅能通過(guò)略顯白色區(qū)域判斷。采用3種處理，在鄭麥366小孢子發(fā)育的不同時(shí)期，均可見(jiàn)到發(fā)白發(fā)亮的細(xì)胞核，且隨著發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，細(xì)胞核的染色程度加重，與細(xì)胞質(zhì)略顯白色背景之間形成強(qiáng)烈反差，單核期能清晰觀察到一個(gè)清晰的細(xì)胞核，二核期能清晰觀察到兩個(gè)清晰地細(xì)胞核，三核期能清晰觀察到三個(gè)清晰的細(xì)胞核，開(kāi)花期能夠清晰看到一個(gè)圓形營(yíng)養(yǎng)核和兩個(gè)梭型精核，細(xì)胞核辨識(shí)度明顯高于I2-KI法。BNS366小孢子細(xì)胞核染色程度比鄭麥366淺，大部分小孢子內(nèi)僅有一個(gè)細(xì)胞核，少數(shù)細(xì)胞可見(jiàn)兩個(gè)細(xì)胞核，有的觀察不到細(xì)胞核，至開(kāi)花期細(xì)胞核消失不見(jiàn)，個(gè)別小孢子內(nèi)可見(jiàn)一個(gè)皺縮變小的細(xì)胞核。

由圖4可知，采用FAA固定后90%-80%-70%處理下，DAPI法染色后，在單核期，鄭麥366(圖4A)和BNS366小孢子(圖4E)均能觀察到一個(gè)發(fā)白發(fā)亮的細(xì)胞核，以鄭麥366的細(xì)胞核清晰度相對(duì)較高且比較明亮，而B(niǎo)NS366細(xì)胞核則相對(duì)較暗。在二核期，鄭麥366(圖4B)細(xì)胞核明亮程度增加，能清晰地觀察到兩個(gè)發(fā)白發(fā)亮的細(xì)胞核，BNS366(圖4F)小孢子的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核區(qū)域較暗，細(xì)胞質(zhì)微紅，少數(shù)小孢子隱約可見(jiàn)一個(gè)細(xì)胞核。大部分細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入二核期，二核期細(xì)胞核出現(xiàn)逐漸變小的現(xiàn)象，至二核期之后消失。在三核期，鄭麥366(圖4C)可觀察到三個(gè)發(fā)白發(fā)亮的細(xì)胞核，BNS366(圖4G)僅有極個(gè)別小孢子可以看到亮度較弱的一個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)微紅。至開(kāi)花期，鄭麥366(圖4D)能夠清晰看到一個(gè)圓形營(yíng)養(yǎng)核和兩個(gè)梭型精核，BNS366(圖4H)則出現(xiàn)明顯的皺縮變形，多數(shù)細(xì)胞看不見(jiàn)細(xì)胞核。由圖5可知，與90%-80%-70%處理相比，70%-70%處理下小孢子細(xì)胞圖像稍暗，能清晰觀察到細(xì)胞核的形態(tài)特征，在鄭麥366三核期和BNS366的二核期也存在細(xì)胞質(zhì)微紅現(xiàn)象，且程度略有加重。由圖6可知，與90%-80%-70%和70%-70%處理相比，不置換處理的細(xì)胞圖像清晰程度較差，鄭麥366和BNS366單核期和開(kāi)花期小孢子細(xì)胞圖像清晰，鄭麥366三核期小孢子細(xì)胞核暗淡不易觀察，細(xì)胞質(zhì)發(fā)白渾濁，或發(fā)紅發(fā)亮，甚至部分細(xì)胞核被染成紅色，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核反差小，BNS366二核期和三核期小孢子細(xì)胞質(zhì)著紅色且比70%-70%處理下程度加劇。

以上結(jié)果說(shuō)明，DAPI法染色可以清晰顯示BNS366小孢子細(xì)胞核不能正常分裂進(jìn)入二核期，核發(fā)育停滯甚至消失的典型細(xì)胞學(xué)變化，與I2-KI法染色結(jié)果中BNS366在單核期至二核期出現(xiàn)敗育的現(xiàn)象相吻合。3種處理按細(xì)胞圖像清晰度排序?yàn)椋?0%-80%-70%>70%-70%>不 置換。

圖4 90%-80%-70%處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的DAPI染色結(jié)果Fig.4 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 treated with 90%-80%-70% ethanol replacement and stained with DAPI

2.2 花粉育性與自交結(jié)實(shí)率比較

在鄭麥366開(kāi)花期取樣，F(xiàn)AA固定后分別采用3種乙醇置換處理，2種染色方法對(duì)花粉染色后統(tǒng)計(jì)花粉育性，并與成熟期自交結(jié)實(shí)率進(jìn)行比較。結(jié)果表明，三種處理下，I2-KI法和DAPI法的花粉可育率分別為77.91%和85.66%(90%-80%-70%)、87.38%和86.41%(70%-70%)、 87.19%和86.8%(不置換)，均與調(diào)查的自交結(jié)實(shí)率(80.33%)一致。這表明FAA固定后三種處理對(duì)小麥花粉育性統(tǒng)計(jì)結(jié)果無(wú)實(shí)質(zhì)性影響。

圖5 FAA固定后70%-70%處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的DAPI染色結(jié)果Fig.5 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 treated with 70%-70% ethanol replacement and stained with DAPI

圖6 不置換處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的DAPI染色結(jié)果Fig.6 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 with non-replacement stained with DAPI

3 討 論

FAA固定后采用3種乙醇處理，經(jīng)2種染色法對(duì)小麥小孢子染色，I2-KI法染色鄭麥366開(kāi)花期細(xì)胞核被淀粉遮蓋出現(xiàn)黑褐色，DAPI染色下可以將鄭麥366花粉粒細(xì)胞核染至發(fā)亮，而B(niǎo)NS366的花粉粒未能被染色，均可以觀察到BNS366敗育時(shí)期在單核期到二核期，與賀曉敏等[7]的研究結(jié)果相一致。鄭麥366表現(xiàn)出正?？捎←湹男℃咦影l(fā)育細(xì)胞學(xué)特征。表明以此為試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)開(kāi)展相關(guān)的細(xì)胞學(xué)觀察準(zhǔn)確可靠，可以進(jìn)一步開(kāi)展采用FAA固定液在三種不同置換條件下細(xì)胞學(xué)觀察效果的比較研究。

FAA是一種快速、廉價(jià)的固定液，常用于小麥小孢子等植物材料的細(xì)胞學(xué)觀察[15]，劉海英等[13-14]研究表明，F(xiàn)AA適用于小麥小孢子I2-KI法和DAPI法染色后淀粉積累情況和細(xì)胞核發(fā)育狀態(tài)的細(xì)胞學(xué)觀察。小麥穗等植物樣品在FAA固定24 h后，繼續(xù)固定容易出現(xiàn)細(xì)胞硬化過(guò)度而導(dǎo)致細(xì)胞染色效果不佳的現(xiàn)象，常采用乙醇置換并最終保存在70%乙醇中。劉子涵等[16]試驗(yàn)中，采用FAA固定后，用70%乙醇漂洗3次后保存在70%乙醇中。在趙 卜等[10]的試驗(yàn)中，F(xiàn)AA固定24 h后抽真空經(jīng)95%乙醇和80%乙醇沖洗，轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存。在張鵬飛等[17]和盛 英等[18]的試驗(yàn)中，用FAA固定后保存在70%乙醇中。劉海英等[13]在FAA固定鄭麥366和BNS366小麥穗后，采取90%-80%-70%-70%乙醇置換各30 min，70%乙醇中保存的乙醇置換處理，經(jīng)I2-KI法和DAPI法染色在小孢子淀粉積累和細(xì)胞核狀況觀察中均取得了良好的顯示效果。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，樣品采用FAA固定后經(jīng)不同乙醇置換處理，I2-KI法染色后小麥小孢子細(xì)胞學(xué)觀察效果出現(xiàn)規(guī)律性變化，90%-80%-70%處理下，其乙醇濃度呈梯度下降，置換次數(shù)為3次，在所有處理中次數(shù)最多，淀粉染色效果最淺；70%-70%處理下，乙醇濃度無(wú)梯度變化，置換次數(shù)為兩次，淀粉染色效果比90%-80%-70%增強(qiáng)；不置換處理下，不涉及乙醇置換，淀粉染色程度最深，表明，隨乙醇濃度梯度下降和置換次數(shù)增加，淀粉著色減弱，三種處理均不影響對(duì)小孢子細(xì)胞學(xué)特征和花粉育性的判斷。樣品采用FAA固定后經(jīng)不同乙醇置換處理，DAPI法染色后小麥小孢子細(xì)胞學(xué)觀察效果也出現(xiàn)規(guī)律性變化，90%-80%-70%處理下，紫外光下細(xì)胞核熒光較強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核區(qū)域亮度較高，細(xì)胞核辨識(shí)度高；70%-70%處理下，紫外光下小孢子細(xì)胞核熒光強(qiáng)度適中，在鄭麥366三核期和BNS366的二核期也存在細(xì)胞質(zhì)微紅現(xiàn)象且程度略有加重,但不影響細(xì)胞學(xué)觀察；不置換處理下，紫外光下細(xì)胞核熒光較弱，鄭麥366三核期小孢子細(xì)胞核暗淡不易觀察，細(xì)胞質(zhì)發(fā)白渾濁，或發(fā)紅發(fā)亮，甚至部分細(xì)胞核被染成紅色，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核反差小，BNS366二核期和三核期小孢子細(xì)胞質(zhì)著紅色且比70%-70%處理下程度加劇，細(xì)胞核辨識(shí)度低，無(wú)法滿(mǎn)足細(xì)胞學(xué)觀察的需要。這表明，隨乙醇濃度梯度下降和置換次數(shù)增加，細(xì)胞核著色增加，細(xì)胞質(zhì)著色程度減弱，細(xì)胞學(xué)觀察效果逐漸改善。FAA固定后經(jīng)3種乙醇置換處理，2種染色方法染色后，對(duì)花粉育性統(tǒng)計(jì)結(jié)果均無(wú)實(shí)質(zhì)性影響。

綜上所述，與90%-80%-70%相比，70%-70%處理下，I2-KI法和DAPI法染色后，細(xì)胞學(xué)觀察效果略差，其淀粉積累情況、細(xì)胞核清晰程度、細(xì)胞質(zhì)著色狀況仍能滿(mǎn)足細(xì)胞學(xué)觀察的要求，但省試劑、省時(shí)間、省人力；與不置換相比，70%-70%處理細(xì)胞學(xué)觀察效果較好，且操作人員制片時(shí)，僅接觸到樣品和保存液中的70%乙醇，與FAA固定液相比，過(guò)敏、刺激、化學(xué)性燙傷和中毒等風(fēng)險(xiǎn)均大大降低，對(duì)操作人員健康的保障效果更好。因此，在本試驗(yàn)條件下，70%-70%乙醇置換處理較為可取。