水果風(fēng)味物質(zhì)的生物制備技術(shù)

孫君燕，姚凌云，宋詩(shī)清，孫敏，王化田，馮濤

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

我國(guó)水果種類(lèi)豐富，果實(shí)香氣怡人，濃郁的水果香氣深受大眾的喜愛(ài)。香氣成分是水果品質(zhì)的重要特征之一，水果是否受消費(fèi)者喜愛(ài)，風(fēng)味是重要的影響因素。但是，風(fēng)味是個(gè)極其復(fù)雜的概念，它包括水果在入口前后對(duì)人的視覺(jué)、嗅覺(jué)、味覺(jué)、觸覺(jué)等一系列器官刺激所形成的一種綜合印象[1]。水果風(fēng)味物質(zhì)主要分為酯類(lèi)、醛類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、萜類(lèi)、羰基化合物和一些含硫化合物，這些化合物的含量會(huì)隨著水果的種類(lèi)和品質(zhì)發(fā)生變化。

目前水果風(fēng)味物質(zhì)研究已成為一門(mén)新興學(xué)科。早期水果風(fēng)味物質(zhì)的研究報(bào)道多見(jiàn)于草莓、葡萄等，通常采用蒸餾法從天然植物中制備而來(lái)，但是該方法受材料、提取條件、設(shè)備等的影響，尚不能滿足大眾對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的需求。隨著社會(huì)的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)、基因工程、微生物轉(zhuǎn)化等生物技術(shù)制備水果風(fēng)味物質(zhì)逐漸成熟。鑒于此，本文對(duì)水果風(fēng)味物質(zhì)的生物制備技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在為今后水果風(fēng)味物質(zhì)的研究、開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

早在20 世紀(jì)50 年代，利用生物技術(shù)合成風(fēng)味物質(zhì)的趨勢(shì)已經(jīng)開(kāi)始活躍，到21 世紀(jì)開(kāi)始盛行。細(xì)胞培養(yǎng)制備風(fēng)味物質(zhì)方法是隨著生物技術(shù)的發(fā)展而誕生的一種新型技術(shù)，此方法可以不受環(huán)境條件的影響而進(jìn)行大量制備，并進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)[2]。與化學(xué)合成相比，細(xì)胞培養(yǎng)法更加安全，避免了金屬離子和有機(jī)溶劑對(duì)食品和環(huán)境的污染[3]，但目前對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞代謝途徑的過(guò)程認(rèn)知較為有限。根據(jù)生產(chǎn)手段，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可分為兩類(lèi)：微生物法和酶法；它們還可分為兩大類(lèi)，即利用代謝細(xì)胞在微生物發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行合成，以及通過(guò)微生物或酶對(duì)適當(dāng)前體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化[4]。

微生物發(fā)酵生產(chǎn)水果風(fēng)味物質(zhì)主要是借助微生物在有氧或無(wú)氧的條件下，制備微生物菌體，或者通過(guò)直接代謝或次級(jí)代謝產(chǎn)生水果風(fēng)味物質(zhì)。微生物發(fā)酵不僅可以改善香氣成分，使水果中的不良?xì)馕断?，還可以改變水果的品質(zhì)、增加營(yíng)養(yǎng)成分，已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。微生物發(fā)酵是一個(gè)很有前景的生產(chǎn)天然風(fēng)味物質(zhì)的方法，目前各個(gè)行業(yè)都在試圖通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)天然風(fēng)味物質(zhì)，主要是大量生產(chǎn)消費(fèi)者偏愛(ài)的風(fēng)味物質(zhì)。如天然香蘭素產(chǎn)品，市場(chǎng)需求量很大，工業(yè)生產(chǎn)每年需30 t 以上[5]，是世界上應(yīng)用廣泛的調(diào)味劑。目前以阿魏酸為直接前體，采用沙鏈霉菌生產(chǎn)香蘭素的工藝已經(jīng)非常成熟。萜類(lèi)化合物是形成水果風(fēng)味的重要物質(zhì)之一，最常見(jiàn)的與風(fēng)味相關(guān)的萜類(lèi)化合物是單萜[6]。萜烯類(lèi)化合物主要賦予香精油特殊的香味，是柑橘果實(shí)香氣的主要成分，有一定的生理活性，如祛痰、止咳、驅(qū)蟲(chóng)、鎮(zhèn)痛作用。產(chǎn)生萜烯化合物的菌常見(jiàn)于腐爛的松樹(shù)上，如長(zhǎng)喙殼屬（Ceratocystic）是目前廣泛研究的一類(lèi)產(chǎn)香真菌[7]。內(nèi)酯類(lèi)化合物如果味、奶油味、甜味等會(huì)刺激人的味覺(jué)，其中果味指的是果香型化合物，是成熟水果散發(fā)的香氣，且伴有甜味。這類(lèi)化合物主要通過(guò)化學(xué)合成的方法，若采用微生物發(fā)酵法，可以生產(chǎn)出具有旋光特性的內(nèi)酯，例如利用土壤真菌綠色木霉在簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，可產(chǎn)生具有椰子味的物質(zhì)[8]。吡嗪類(lèi)化合物具有烘培或堅(jiān)果的特殊風(fēng)味，這類(lèi)化合物是通過(guò)美拉德反應(yīng)得到的，對(duì)于一些食品加工沒(méi)辦法進(jìn)行美拉德反應(yīng)的，無(wú)法獲得這類(lèi)特殊風(fēng)味，可以利用谷氨酸棒桿菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生四甲基吡嗪和萜類(lèi)化合物[9]，添加到食品中，可獲得烘培或者堅(jiān)果的特殊風(fēng)味。還有一些菌可產(chǎn)生酯類(lèi)化合物，如乙酸丁酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、酪酸戊酯，這類(lèi)化合物是水果的主要風(fēng)味物質(zhì)。

2 基因工程

利用基因工程能夠控制目的基因的表達(dá)，獲取目的性狀，從而得到更多種類(lèi)的風(fēng)味物質(zhì)[10]?；蚬こ讨苽滹L(fēng)味物質(zhì)是當(dāng)今食品工業(yè)上的一大趨勢(shì)，通過(guò)基因工程，能讓人們吃到種類(lèi)豐富、風(fēng)味特殊的物質(zhì)?；蚬こ讨饕獞?yīng)用于草莓、葡萄和瓜果中，但改良果實(shí)風(fēng)味成功的例子比較少，可能原因是對(duì)風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律的研究較薄弱?？茖W(xué)家還利用反義基因技術(shù)并逐漸擴(kuò)展到西瓜、香蕉、草莓、柑橘等，不僅可以延長(zhǎng)果蔬的貯藏期，還可以提高果醬產(chǎn)率。反義基因技術(shù)原理是基于互補(bǔ)RNA 能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，采用人工合成或生物合成的特異性DNA/RNA片段（或其修飾產(chǎn)物）封閉或抑制目的基因的表達(dá)[11]。例如苑平等[12]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將氧化酶基因的反義鏈導(dǎo)入‘翠玉’獼猴桃，延長(zhǎng)了果實(shí)軟化和風(fēng)味存留的時(shí)間。

基因工程技術(shù)可以定向改變性狀，這種方法便捷、易于控制，目前在微生物發(fā)酵中應(yīng)用較廣。在果酒的釀制中，可以利用基因工程技術(shù)，增加高級(jí)醇和酯的含量，使果酒變得更加濃郁、營(yíng)養(yǎng)也更豐富。例如Chen YF 等[13]發(fā)現(xiàn)己酸乙酯是一種具有蘋(píng)果風(fēng)味的酯類(lèi)物質(zhì)，將釀酒酵母醇己?；D(zhuǎn)移酶（ethanol hexanoyl transferase I）基因EHT1 進(jìn)行了過(guò)表達(dá)，獲得了高產(chǎn)己酸乙酯的工程菌。劉伶普[14]將編碼醇?；D(zhuǎn)移酶的基因的過(guò)表達(dá)，提高了己酸乙酯和辛酸乙酯等中鏈脂肪酸酯的產(chǎn)量。劉燦珍[15]通過(guò)基因工程，控制高級(jí)醇及乙酸酯的合成，醇類(lèi)主要是異戊醇，酯類(lèi)主要是辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯，改變了葡萄果酒的整體風(fēng)味。張良[16]利用基因工程將煙曲霉中的檸檬酸裂解酶基因?qū)脶劸平湍讣?xì)胞，使藍(lán)莓汁中的檸檬酸裂解為丙酮酸，降糖快、發(fā)酵周期短，而且提高了藍(lán)莓酒的風(fēng)味?？傊?，基因工程技術(shù)不僅能夠克服化學(xué)合成法和酶解法成本高的缺點(diǎn)，還能根據(jù)需要，獲得目標(biāo)產(chǎn)物，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

3 微生物轉(zhuǎn)化

人們從水果原材料中很難提取出風(fēng)味物質(zhì)，這一過(guò)程受到多種因素的影響，如所需風(fēng)味物質(zhì)濃度低、材料的季節(jié)性變化和天氣的變化無(wú)常，這些都會(huì)顯著影響風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)量和質(zhì)量。由于生物技術(shù)的進(jìn)步，提取風(fēng)味物質(zhì)正日益成為工業(yè)化生產(chǎn)的目標(biāo)。風(fēng)味物質(zhì)生產(chǎn)過(guò)程中的微生物轉(zhuǎn)化是指一種微生物或多種微生物將一種物質(zhì)轉(zhuǎn)化為另一種物質(zhì)[17]，該過(guò)程需要微生物產(chǎn)生的酶參與反應(yīng)。如果在培養(yǎng)基中提供特定的基質(zhì)，微生物轉(zhuǎn)化經(jīng)過(guò)氧化、還原、水解、脫水、新C-C 鍵的形成，最終生產(chǎn)所需的風(fēng)味物質(zhì)。含有大量所需前體的天然來(lái)源的化合物可直接用作基質(zhì)[18]，例如倍半萜是精油中提取的萜烯，是研究微生物轉(zhuǎn)化最受歡迎的底物，也是橙油中較為廉價(jià)的成分[19]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。微生物轉(zhuǎn)化方法若可以廣泛應(yīng)用在工業(yè)上，將擴(kuò)大原有物質(zhì)本身的價(jià)值。

3.1 內(nèi)酯類(lèi)

內(nèi)酯主要是指由γ-羥基酸和δ-羥基酸組成的環(huán)狀酯[20-21]，有助于增加黃油味、奶油味和水果味。內(nèi)酯主要是通過(guò)化學(xué)方法產(chǎn)生的，但與化學(xué)合成相比，微生物轉(zhuǎn)化在活性成分的生產(chǎn)以及催化效果方面更加優(yōu)秀。例如γ-癸內(nèi)酯（γ-decalacton，GDL）存在于水果和發(fā)酵產(chǎn)品中，張婧[22]克隆格氏乳球菌的油酸水合酶，協(xié)同解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）轉(zhuǎn)化油酸合成γ-癸內(nèi)酯，以γ-羥基不飽和脂肪酸為底物，采用分枝孢子菌（Cladosporium suaveolens）進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯；王萍萍[23]則利用凍土毛霉（Mucor hiemalis） 和卷枝毛霉（Mucor circinelloides）將癸酸乙酯經(jīng)氧化、酸化、提取和蒸餾等步驟獲得癸內(nèi)酯。趙玉萍[24]采用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)，減少了底物和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒性，篩選出獲得高產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的耶魯維亞解脂酵母（Yarrowialipolytica），提高了γ-癸內(nèi)酯的產(chǎn)量，對(duì)桃子香、椰子香及奶油香等香氣物質(zhì)的形成具有重要意義[25]。

3.2 酯類(lèi)

酯是常用的調(diào)味劑，具有果香味，廣泛應(yīng)用于水果制品中，使產(chǎn)品具有水果味。乙酸乙酯與丁酸乙酯廣泛存在于蘋(píng)果、梨等水果中，是構(gòu)成花果香氣的主體成分[26]。乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸異戊酯和2-苯基乙酸乙酯被認(rèn)為是葡萄酒和其他葡萄汁酒精飲料中的重要風(fēng)味化合物[27-28]，它們可能是酵母菌、霉菌、細(xì)菌產(chǎn)生的。在酒類(lèi)飲品中，脂肪酸乙酯是釀酒酵母產(chǎn)生的次級(jí)代謝物，其中C6-C12 的脂肪酸酯對(duì)飲品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大。醇和酸的直接酯化主要由細(xì)菌和真菌進(jìn)行，例如紅曲霉能夠促進(jìn)己酸、丁酸及混合酸與乙醇的酯化作用，生成的酯類(lèi)物質(zhì)均為己酸乙酯[29]。許春艷等[30]進(jìn)行單因素和正交法優(yōu)化，確定最佳產(chǎn)酶條件，篩選出合成己酸乙酯性能較高的紫色紅曲霉，為后續(xù)菌種酯化能力的研究奠定基礎(chǔ)。

3.3 萜類(lèi)

萜類(lèi)化合物通常是造成精油特有氣味的最重要成分，廣泛存在于植物中。單萜類(lèi)化合物廣泛分布于自然界，具有高揮發(fā)性，是生物技術(shù)生產(chǎn)風(fēng)味化合物的理想原料[31]。萜類(lèi)化合物中，與水果風(fēng)味相關(guān)的最常見(jiàn)的是單萜，如檸檬烯和α-蒎烯[32]。檸檬烯是檸檬的特征香氣，被用作揮發(fā)性化合物轉(zhuǎn)化的底物；Rottava 等[33]分離篩選出黑曲霉能夠?qū)幟氏┺D(zhuǎn)化成α-松油醇；Ferrara 等[34]發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母可將檸檬烯轉(zhuǎn)化為紫蘇酸，以及一些細(xì)菌如假單胞菌也可進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。萜類(lèi)化合物大多數(shù)具有苦味，但有些也具有甜味，例如甜菊苷[35]。用微生物生產(chǎn)單萜類(lèi)物質(zhì)，對(duì)果蔬風(fēng)味合成具有重要的意義。

3.4 羰基

羰基存在于酮和醛中，它們呈現(xiàn)出獨(dú)特的氣味特征，有助于產(chǎn)生揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)的風(fēng)味屬性。酮主要對(duì)奶酪風(fēng)味有貢獻(xiàn)，例如呋喃酮是草莓果實(shí)中最重要的香氣成分。醛類(lèi)中最常見(jiàn)的是苯甲醛，天然苯甲醛通常從杏仁核中釋放出來(lái)，苯甲醛是僅次于香蘭素的第二大揮發(fā)性物質(zhì)，可以通過(guò)苯甲醇作為碳源生產(chǎn)苯甲醛。Sindhoora 等[36]發(fā)現(xiàn)甜瓜揮發(fā)物中的重要組分有酯類(lèi)（27.29%）、醛類(lèi)（18.57%）、雜環(huán)化合物（16.63%）。在木瓜中，醛類(lèi)物質(zhì)占10%左右，例如十六醛、十八醛、庚烯醛等，酮類(lèi)有巨豆三烯酮、β-紫羅蘭酮等。在菠蘿和草莓中，2(5H)-呋喃酮具有生物活性，能夠抗病毒和抗菌等[37]。4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮是具有水果香味和焦糖味的一種物質(zhì)，在食品工業(yè)和化妝品中應(yīng)用廣泛。酮類(lèi)物質(zhì)通常是利用微生物代謝合成，而能代謝合成該種呋喃酮的微生物主要有魯氏結(jié)合酵母[38]、乳酸菌[39]、畢赤酵母[40]等。

3.5 酸

具有香氣的酸主要有乙酸、丁酸、己酸、癸酸、異丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、辛酸、苯乙酸、丙酸和戊酸。宋云花等[41]從云南乳制品分離出乳酸菌作為輔助發(fā)酵劑，添加到Cheddar 干酪的制備中，控制溫度、pH，且不影響干酪的組成成分，將水果風(fēng)味增加了3 倍左右。許多有價(jià)值的香料和香料組成物可以由微生物從作為前體添加的脂肪酸中產(chǎn)生，包括提供綠色氣味的化合物、特定的內(nèi)酯等。微生物發(fā)酵中，利用丁酸梭菌在厭氧的條件下可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丁酸[42]。丁酸是具有干酪香味的物質(zhì)，還可與乙醇發(fā)生酯化，生成丁酸乙酯，是具有果香味的香氣成分，但該方法制備香氣成分的成本高于化學(xué)合成法。

4 結(jié)論

水果深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)，但風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生受水果原料、外界環(huán)境、栽培條件以及生物合成途徑相關(guān)酶活性的影響。隨著消費(fèi)者對(duì)營(yíng)養(yǎng)和美味食品需求的增加，導(dǎo)致人們對(duì)可能被視為天然美味材料的需求增加，可以通過(guò)生物技術(shù)解決這一系列問(wèn)題。本文主要是從細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、基因工程、微生物轉(zhuǎn)化這三種生物制備技術(shù)獲取水果風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行探討。采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以彌補(bǔ)在化學(xué)合成上存在的諸多安全風(fēng)險(xiǎn)的問(wèn)題，但細(xì)胞培養(yǎng)由于在植物代謝過(guò)程知識(shí)上的局限，現(xiàn)在還存在產(chǎn)量低、培養(yǎng)環(huán)境不易控制等問(wèn)題?；蚬こ淘诟纳扑L(fēng)味方面重要的優(yōu)勢(shì)是可以在特定的器官、細(xì)胞層，甚至單個(gè)細(xì)胞，通過(guò)基因轉(zhuǎn)移的方式改變植物的特性，但基因工程在世界上的安全性還有待考察。微生物轉(zhuǎn)化可以將低價(jià)值的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成高價(jià)值的，但這一技術(shù)還不成熟。隨著社會(huì)的發(fā)展及知識(shí)體系的完善，現(xiàn)代分離技術(shù)如超臨界流體萃取技術(shù)、分子蒸餾技術(shù)的應(yīng)用，以及分析儀器準(zhǔn)確度的提高，生物技術(shù)將會(huì)在食品工業(yè)上有更廣闊的應(yīng)用前景。