炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在非酒精性脂肪肝病中的作用及機制

張文杰，孫迪陽，王 培（海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海 200433）

非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）是非酒精因素導(dǎo)致肝實質(zhì)細(xì)胞的脂肪變性和脂肪異常堆積為主要特征的一種肝臟疾病，其發(fā)病率在慢性肝病中處于首位。目前，其機制尚未研究充分，且缺乏針對其發(fā)病機制的治療藥物。細(xì)胞焦亡是一種由消皮素（gasdermin）蛋白家族介導(dǎo)的新型程序性死亡，以壞死樣細(xì)胞膜孔形成、細(xì)胞腫脹和破裂為特征，導(dǎo)致大量細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物泄漏，伴有細(xì)胞核凝結(jié)，但不伴有DNA階梯化的DNA碎裂。近年研究發(fā)現(xiàn)，與炎癥小體相關(guān)的細(xì)胞焦亡在NAFLD的病程進(jìn)展中可能起到重要作用。因此，這一新型的細(xì)胞死亡方式很可能是NAFLD的潛在治療靶點。本文擬就炎癥小體介導(dǎo)細(xì)胞焦亡在NAFLD病程進(jìn)展中的作用及機制作一綜述。

1 非酒精性脂肪肝

NAFLD是非濫用酒精引起的代謝性疾病，包含單純性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎（NASH）和肝硬化等一系列病變，是當(dāng)今世界發(fā)病率最高的慢性肝病(患者約占全球成年人口的25%)，其中。NASH以嚴(yán)重炎癥和肝纖維化為特點，是肝硬化、肝細(xì)胞癌的主要病因。目前，“雙重打擊學(xué)說”認(rèn)為NAFLD病程發(fā)展機制分為兩步：第一重打擊的是脂質(zhì)代謝障礙和胰島素抵抗，是造成后續(xù)發(fā)生脂肪肝炎的前提因素；第二重打擊包含炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能失調(diào)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等多種因素，可促使NAFLD進(jìn)展為NASH，其中，炎癥在NAFLD所有致病因素中最受關(guān)注，因為炎癥是聯(lián)系上游因素（肝脂肪變形和胰島素抵抗）和下游因素（產(chǎn)生細(xì)胞損傷，甚至導(dǎo)致肝硬化）的中心事件。經(jīng)過適當(dāng)?shù)闹委煟琋AFLD的病程進(jìn)展可以延遲甚至被逆轉(zhuǎn)，治療主要包括兩種方式：一是生活方式的干預(yù)治療，包括減輕體重、改善飲食和身體鍛煉；二是藥物治療，但藥物治療僅局限在輔助減輕體重與改善飲食方面，目前尚無公認(rèn)有效的藥物治療可針對其發(fā)病機制改善NASH，也還沒有專門針對NASH治療的藥物獲批[1]。

2 NASH病理生理學(xué)機制

目前，脂毒性是關(guān)于NASH發(fā)病機制中最有說服力的學(xué)說[2-4]。脂毒性損傷是由過量的游離脂肪酸(FFAs)進(jìn)入肝細(xì)胞產(chǎn)生的。FFAs特別是飽和脂肪酸(SFAs)主要來自飲食、脂肪組織脂解作用和葡萄糖的脂肪重新合成作用[2]。生理條件下，SFAs可以轉(zhuǎn)移到線粒體中用于β氧化，也可以合成極低密度脂蛋白(VLDL)形成脂滴或者進(jìn)入血液，而過多的SFAs可以產(chǎn)生包含磷脂酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿、神經(jīng)酰胺和二酰甘油等多種脂毒性的中間產(chǎn)物[2]。這些中間產(chǎn)物可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中未折疊或折疊錯誤的蛋白質(zhì)積累、線粒體功能障礙、活性氧（ROS）形成和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激，引起細(xì)胞凋亡。SFAs與TOLL樣受體4（TLR4）結(jié)合可以產(chǎn)生一系列的級聯(lián)反應(yīng)，包括激活促炎癥核因子kB (NF-β)通路、激活凋亡前信號調(diào)節(jié)激酶1/c-jun N末端激酶(ASK1/JNK)通路和造成線粒體功能障礙擴(kuò)增[3]。胰島素抵抗在脂肪組織脂解作用和外周葡萄糖處理中起著重要作用，這會導(dǎo)致過量的FFA轉(zhuǎn)運，促使氧化應(yīng)激和脂肪毒性的發(fā)生[2,4]。

越來越多的研究表明飲食習(xí)慣與NASH病程進(jìn)展高度相關(guān)，多不飽和脂肪酸(PUFAs)、果糖和高膳食膽固醇在NAFLD/NASH發(fā)展過程起重要作用。ω-3、ω-6多不飽和脂肪酸都屬于PUFAs，前者減少炎癥反應(yīng)而后者則加重炎癥反應(yīng)。動物實驗中，與ω-6/ω-3低比率喂食的動物相比，ω-6/ω-3高比率喂食的動物可產(chǎn)生更為嚴(yán)重的脂肪肝[5]。果糖飲食可以增加脂肪質(zhì)量、脂肪的重新合成和炎癥，并且誘導(dǎo)胰島素抵抗，提示果糖的過度攝入與NAFLD的致病及肝纖維化有關(guān)[6]。肝臟的X受體可以被高膳食膽固醇激活，致使脂質(zhì)生成與脂質(zhì)氧化的失衡，產(chǎn)生過量的FFA，增加肝臟的脂毒性損傷。有研究表明，在高脂、高膽固醇飲食誘導(dǎo)小鼠NASH模型中發(fā)現(xiàn)利用藥物分解膽固醇晶體可改善NASH的纖維化[7]。

腸道微生物、腸源性內(nèi)毒素、腸道高通透性在NAFLD/NASH病程發(fā)展中也起到重要作用。腸道微生物可以產(chǎn)生大量的脂多糖（LPS）、細(xì)菌DNA和肽聚糖等細(xì)菌產(chǎn)物。以上產(chǎn)物均可通過局部靜脈循環(huán)轉(zhuǎn)移至肝臟。血清中的LPS水平升高和腸道的通透性增加與NAFLD有關(guān)，NASH患者的血清中LPS水平上升，由于腸道通透性增加而被吸收的微生物危險信號被模式識別受體（包括TLR）識別[8]。

3 炎癥小體與細(xì)胞焦亡

炎癥小體是在胞質(zhì)模式識別受體識別危險相關(guān)分子模式(DAMPs)和病原相關(guān)分子模式(PAMPs)時，在多種免疫和非免疫細(xì)胞中形成，與固有免疫反應(yīng)產(chǎn)生相關(guān)的三聚合蛋白復(fù)合物。到目前為止，已知在炎癥小體裝配中具有確定作用的模式識別受體家族成員有3種成分：神經(jīng)凋亡蛋白（NAIPs）和結(jié)節(jié)樣受體（NLR）家族成員中的NLRP1、NLRP3、NLRC4；AIM2樣受體(ALR) 家族成員中AIM2和TRIM家族成員中的pyrin。炎癥小體家族里首個被記載作用的炎癥小體是NLRP1，有報道[9]指出NLRP1由NACHT、PYD (pyrin結(jié)構(gòu)域)和LRR結(jié)構(gòu)域組成，在ASC參與下，NLRP1的活性可以被明顯增強。NLRP2炎癥小體在2012年被發(fā)現(xiàn)。有報道稱發(fā)現(xiàn)人星形膠狀細(xì)胞表達(dá)一種由NLRP2、ASC和caspase-1的炎癥小體，被ATP激活后，裂解 caspase-1為活性片段，促使IL-1β分泌[10]。NLRP3可以感受廣泛的刺激，包括各種分子、細(xì)菌和病毒，因此成為包括代謝障礙和感染等相關(guān)疾病新的靶點。NLRP6在維持腸道菌群平衡和調(diào)節(jié)IL-18水平方面起關(guān)鍵作用。NLRP6缺陷的小鼠更容易引起腸道炎癥和化學(xué)誘導(dǎo)出大腸炎，提示其在腸道的功能是促進(jìn)表皮修復(fù)和增殖。新的報告闡述NLRP6以自噬的方式來調(diào)整杯狀細(xì)胞黏液分泌，減少NLRP6的表達(dá)損害黏膜層，導(dǎo)致感染發(fā)生[11]。NLRP10是唯一沒有LLR結(jié)構(gòu)域的NLR,是其他炎癥小體的負(fù)調(diào)節(jié)體，不能通過組裝炎癥小體調(diào)節(jié)caspase-1的作用。NLRP10缺陷小鼠在一系列的刺激下表現(xiàn)出肝臟T細(xì)胞源性免疫反應(yīng)進(jìn)一步的缺陷。NLRP12與ASC結(jié)合，并且激活I(lǐng)L-1β，也參與到周期性發(fā)熱和抵抗鼠疫耶爾森菌的機制中。NLRC4最重要的功能是活化caspase-1對抗G-菌感染，比如通過巨噬細(xì)胞感染沙門菌后，通過其三型分泌系統(tǒng)（T3SS）傳遞細(xì)菌的鞭毛蛋白和桿狀蛋白到NLRC4，從而使其活化啟動反應(yīng)。有報道指出在NAFLD背景下的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移病程中，NLRC4通過改變腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）的浸潤和分化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[12]。AIM2存在于細(xì)胞質(zhì)中，可以感應(yīng)dsDNA,可被病毒、細(xì)菌甚至是宿主自身DNA刺激從而激活。

盡管參與炎癥小體激活的成分種類多樣，但在炎癥小體被激活后，都裂解capase使其激活，裂解胞質(zhì)蛋白gasdermin家族，產(chǎn)生N片段，作用于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，致使細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞溶解性死亡，這個過程稱為細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡是一種由gasdermin蛋白家族介導(dǎo)的程序性死亡，在形態(tài)學(xué)上兼有細(xì)胞凋亡與壞死的特征。細(xì)胞焦亡時，壞死樣細(xì)胞膜孔形成、細(xì)胞腫脹和破裂，導(dǎo)致大量細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物泄漏，同時伴有凋亡樣細(xì)胞核凝結(jié)和不伴有DNA階梯化的DNA碎裂，然而與細(xì)胞凋亡相比，線粒體保持完整且不伴有細(xì)胞色素C的泄露。在經(jīng)典的細(xì)胞焦亡信息通路中，包含NLR家族（NLRP3、NLRP1、NLRC4、NLRP9和NLRP6), PYHIN蛋白家族(比如AIM2和 Pyrin蛋白）等特定的炎癥小體可識別PAMPs或DAMPs，并激活caspase-1，致使細(xì)胞焦亡發(fā)生。在非經(jīng)典細(xì)胞焦亡細(xì)胞通路中，caspase-11和caspase-4/5主要通過CARD結(jié)構(gòu)域識別胞質(zhì)中的LPS激活，引發(fā)細(xì)胞焦亡。

當(dāng)前的研究發(fā)現(xiàn)，人類體內(nèi)有6種gasdermin（GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和PJVK），小鼠體內(nèi)有10種gasdermin（GSDMA1～3、GSDMC1～4、GSDMD、GSDME和PJVK）。除了PJVK外，GSDMs均由N片段與C片段2個保守結(jié)構(gòu)域組成，其中N片段為活性片段，而C片段則起到自身抑制作用與N片段結(jié)合[13]。GSDMA、GSDMA3、GSDMB、GSDMC、GSDMD和GSDME的 N片段在蛋白水解作用下釋放至細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的脂質(zhì)成分，形成低聚物死亡誘導(dǎo)穿孔[13]。

4 炎癥小體與細(xì)胞焦亡在NAFLD/NASH中的關(guān)鍵作用

越來越多的證據(jù)表明，肝臟可以通過局部循環(huán)接觸到產(chǎn)生于消化道的多種微生物分子或受各種嗜肝病毒感染而導(dǎo)致炎癥小體活化，產(chǎn)生細(xì)胞焦亡，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)以抵御病原體。最近研究表明，NLRP3及其組分在NASH患者和小鼠模型中表達(dá)顯著升高[14-15]。有研究報道飽和脂肪酸棕櫚酸酯（而非不飽和油酸）可介導(dǎo)NLRP3-ASC炎癥小體的活化，致使caspase-1、IL-1β和IL-18等細(xì)胞焦亡組分的產(chǎn)生，作為NASH的致病機制，自噬和氧化應(yīng)激也與這一過程息息相關(guān)[16]。利用敲除和插入NLRP3基因的小鼠，已經(jīng)證明NLRP3炎癥小體的激活在NASH病程進(jìn)展中是細(xì)胞焦亡和肝纖維化的必備條件[14,17]。膽固醇晶體可以激活炎癥小體導(dǎo)致NASH，但利用MCC-950阻斷NLRP3可在部分逆轉(zhuǎn)小鼠（尤其是糖尿病肥胖小鼠）的肝臟中減輕炎癥及肝纖維化[18]。利用正常飲食或高脂飲食（HFD）喂食6周誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型，通過安慰劑或白藜蘆醇處理4周，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇不僅改善血糖，還通過作用于沉默調(diào)節(jié)蛋白1（Sirt1）和沉默調(diào)節(jié)蛋白6（Sirt6）減輕NLRP3相關(guān)的肝臟炎癥，從而改善NAFLD[19]。最新研究發(fā)現(xiàn)，由GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡參與NASH病理機制，相比野生型小鼠，GSDMD-/-小鼠的NASH表型得到顯著改善[20]。此外，IL-1β的mRNA和蛋白水平在蛋氨酸膽堿缺乏飲食(MCD)、HFD和缺乏膽堿的氨基酸飲食（CDAA）喂食誘導(dǎo)NASH的模型中均被發(fā)現(xiàn)上調(diào)[16,21-23]。當(dāng)敲除IL-1α、IL-1β或IL-1R基因時，NASH誘導(dǎo)的肝損傷癥狀有所減輕[24-25]，進(jìn)一步提示NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在NAFLD進(jìn)展為NASH病程中有重要作用。

另一個NLRP3炎癥小體潛在的負(fù)調(diào)節(jié)是自噬。自噬功能缺陷可以導(dǎo)致功能失調(diào)的線粒體堆積，從而促進(jìn)ROS產(chǎn)生，激活NLRP3炎癥小體。研究發(fā)現(xiàn)依澤替米貝通過誘導(dǎo)自噬抑制NLRP3炎癥活性，改善MCD喂食誘導(dǎo)NASH小鼠的肝臟脂質(zhì)堆積和炎癥[26]，提示自噬通過抑制NLRP3炎癥小體改善NASH。與上述研究結(jié)論相反，也有實驗結(jié)果表明敲除NLRP3基因后可導(dǎo)致細(xì)菌菌群失調(diào)，從而加重NASH[27]。NLRP3在NASH進(jìn)程中作用的不同可用NLRP3在不同器官的活性不同來解釋。在NASH致病過程中，肝臟中NLRP3炎癥小體表達(dá)水平升高，是NASH的致病機制之一；但腸道中NLRP3炎癥小體表達(dá)水平降低，則減弱了腸道屏障抵御細(xì)菌易位的功能，造成脂多糖（LPS）進(jìn)入肝臟增多，加重NASH[28]。這些發(fā)現(xiàn)提示，肝臟NLRP3特異性阻斷可以改善肝臟炎癥與肝脂肪變性并且避免導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)。

最近研究發(fā)現(xiàn)[29]，在利用MCD喂食誘發(fā)的NASH小鼠模型中，與補充蛋氨酸的對照組小鼠相比，除了NLRP3外，AIM2、TLR4和TLR9的mRNA水平在NASH模型小鼠中也出現(xiàn)上調(diào)。且在該模型中，AIM2表達(dá)與激活可通過添加TLR9配體進(jìn)一步增強，提示AIM2作為DNA感受器促進(jìn)了NASH病程進(jìn)展中炎癥的發(fā)生。

5 炎癥小體與細(xì)胞焦亡參與NAFLD/NASH發(fā)病的可能分子機制

5.1 炎癥小體/細(xì)胞焦亡調(diào)節(jié)肝臟脂代謝

最新證據(jù)表明，以NLRP家族為主的炎癥小體復(fù)合物是抑制肝臟脂質(zhì)沉積的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。NLRP1基因敲除小鼠可自發(fā)NASH，該癥狀在喂食HFD后加重，而NLRP1-mutant (NLRP1a激活變異體)小鼠肝臟中沒有脂質(zhì)空泡[24]。NLRP1炎性小體敲除后可導(dǎo)致小鼠肥胖及代謝綜合征，IL-18表達(dá)和肝細(xì)胞脂解作用也隨之下降。NLRP1的抗肥胖能力似乎依賴于IL-18，因為敲除IL-18基因后逆轉(zhuǎn)了其保護(hù)作用[30]。此外，給予外源性IL-18可逆轉(zhuǎn)小鼠脂肪性肝炎，更進(jìn)一步明確NLRP1-IL-18信號控制代謝綜合征的重要性[30]。給NLRP3和NLRP6基因敲除小鼠予HFD或者M(jìn)CD食物后，可加重肝臟脂肪變性與微生物失調(diào)[27]。有意思的是，將NLRP3或NLRP6基因敲除導(dǎo)致微生物失調(diào)的小鼠的糞便轉(zhuǎn)移至共同飼養(yǎng)的野生型小鼠，則可誘發(fā)NAFLD，并且微生物失調(diào)程度與肝臟疾病嚴(yán)重程度高度關(guān)聯(lián)[27]。目前，對于該現(xiàn)象的可能解釋是“腸-肝軸”作用，即經(jīng)過HFD與MCD喂食后，導(dǎo)致腸道微生物功能改變，細(xì)菌產(chǎn)物更容易易位至肝臟，從而加重肝臟脂肪變性與炎癥反應(yīng)[31]。目前，NLRP6被認(rèn)為是維護(hù)腸道內(nèi)菌群平衡的調(diào)節(jié)分子, 在微生物代謝物的刺激下通過裂解caspase-1致IL-18成熟、分泌[32]。作為細(xì)胞焦亡的主要產(chǎn)物之一，IL-18不僅能誘導(dǎo)抗微生物肽的合成，控制腸道微生物群的組成，同時也上調(diào)IL-22信號，促進(jìn)傷口愈合。

5.2 炎癥小體/細(xì)胞焦亡調(diào)節(jié)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激由過多的活性氧引起，是肝損傷的標(biāo)志之一。氧化應(yīng)激時，固有免疫系統(tǒng)可以識別被釋放到胞質(zhì)中的細(xì)胞核DNA和線粒體DNA(mtDNA)。近年有報道稱，caspase-1通過上調(diào)Beclin 1蛋白與線粒體自噬減少ROS與產(chǎn)生異常mtDNA，對抗損傷性休克復(fù)蘇產(chǎn)生的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[33]。后續(xù)的研究表明，caspase-1的激活由AIM2介導(dǎo)，因為敲除AIM2后小鼠capase-1活化減少并且肝細(xì)胞死亡加重。AIM2炎癥小體是一種識別功能失調(diào)DNA的胞內(nèi)受體，與免疫原性DNA傳感器HMGB1相互作用以促進(jìn)肝保護(hù)[34]。這些研究提示，AIM2是固有免疫感受器與有益自噬之間的樞紐，可以減少氧化應(yīng)激過程中肝細(xì)胞的損傷。

5.3 炎癥小體/細(xì)胞焦亡調(diào)節(jié)肝纖維化

作為細(xì)胞外基質(zhì)主要的存儲細(xì)胞，細(xì)胞核DNA和mtDNA的多種功能可被NLRP3改變，包括抑制趨化性、上調(diào)膠原蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）合成[35]。敲除NLRP3基因可激活肝臟星狀細(xì)胞（HSCs），并增加其膠原蛋白的堆積，而且不能為外源性IL-1Ra治療所逆轉(zhuǎn)，提示存在NLRP3以外的其他炎癥小體通路而不是IL-1β促進(jìn)肝纖維化。NLRP3在肝纖維產(chǎn)生過程中起著關(guān)鍵作用，特別表現(xiàn)為IL-1β分化Th17，使其分泌IL-17。而IL-17是放大炎癥反應(yīng)和NLRP3持續(xù)激活肝纖維化的關(guān)鍵促炎癥因子[36]。綜上所述，研究者可能需要投入更多精力去研究炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡通路和新的焦亡通路在NAFLD/NASH中的作用，以尋找治療NAFLD/NASH乃至肝纖維化的新藥物治療靶點。

6 結(jié)論

NAFLD/NASH作為全球性衛(wèi)生問題，越來越受到重視，但從NAFLD發(fā)展到NASH及肝纖維化的致病機制還需更全面深入的研究。作為新發(fā)現(xiàn)的功能性蛋白復(fù)合體，炎癥小體及其介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡與NAFLD/NASH的發(fā)病機制密切相關(guān)。在生理條件下，肝臟通過炎癥小體感受到來自腸道和自身的PAMPs和DAMPs，裂解caspase產(chǎn)生活性片段，引起炎癥反應(yīng)與介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，從而對抗病原體感染、氧化應(yīng)激、代謝綜合征和腫瘤的發(fā)生，對于維持機體健康有重要意義。但是在病理條件下，炎癥體過量的激活可促使NAFLD加重，向NASH進(jìn)展。

基于以上結(jié)論，本課題組認(rèn)為細(xì)胞焦亡作為新發(fā)現(xiàn)的參與NAFLD/NASH發(fā)病的細(xì)胞死亡，是一個極具前景的藥物開發(fā)靶點。開發(fā)針對細(xì)胞焦亡和炎癥小體的化合物或生物藥物，將是NAFLD/NASH藥物研發(fā)的重要途徑。