杉木澀籽發(fā)生機(jī)理的研究進(jìn)展

陳 宇, 吳 超, 武憶寒, 林思祖

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州350002；2.國家林業(yè)與草原局杉木工程技術(shù)研究中心， 福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息學(xué)院， 福建 福州 350002)

杉木[Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.]種子敗育通常有兩種類型。一類為癟粒，表現(xiàn)為成熟種子小而薄，種胚干癟萎縮成極小的褐點(diǎn)，重量輕，易辨認(rèn)，在凈種環(huán)節(jié)容易剔除；另一類稱為澀籽或澀粒，其大小、重量、色澤等外觀形態(tài)與健籽相差無幾，不易用簡(jiǎn)單的方法去除[1]，但剖開種皮后則可觀察到暗紅褐色的敗育種子?，F(xiàn)有杉木種子園澀籽的比率較高，平均在30%以上[2-4]。鄭新華[5]研究表明，在福建省尤溪國有林場(chǎng)三代種子園中，無性系澀籽率最高達(dá)89%。由于澀籽難分辨、高發(fā)生，不僅影響杉木種子園良種產(chǎn)量與品質(zhì)，也增加了杉木育苗成本。

自20世紀(jì)60年代起，國內(nèi)許多學(xué)者針對(duì)杉木澀籽問題展開了大量研究，主要包括解剖學(xué)分析、內(nèi)含物成分鑒定、生理生化變化以及產(chǎn)生澀籽的生態(tài)影響因子等方面。當(dāng)前，杉木澀籽的分子機(jī)理研究為進(jìn)一步闡明發(fā)生機(jī)制提供了分子依據(jù)。本文對(duì)杉木澀籽形成的影響因素、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、澀籽物質(zhì)組分、生理生化變化以及分子生物學(xué)研究等5個(gè)方面進(jìn)行綜述，提出了深入開展?jié)研纬蓹C(jī)理研究和改進(jìn)杉木高世代種子園營建策略的建議，以期為澀籽性狀改良和良種質(zhì)量提升提供參考。

1 澀籽形成的影響因素

造成杉木澀籽的原因十分復(fù)雜，管康林[2]將其歸納為遺傳性、自交不育、不良?xì)夂蛞蛩匾约吧砩町惖?個(gè)方面。從已有研究來看，澀籽形成受遺傳因素與環(huán)境因素的共同影響。

1.1 遺傳因素

杉木澀籽的形成可能與特定基因型有關(guān)。同個(gè)杉木種子園中不同家系或無性系的澀籽率有顯著的差異。廣西融水貝江河林場(chǎng)1.5代杉木種子園中27個(gè)無性系澀籽率的變異系數(shù)為23.71%，無性系間差異達(dá)到極顯著水平[4]；浙江遂昌杉木種子園中20個(gè)無性系澀籽率變動(dòng)幅度在14.7%～54.2%之間，無性系間方差達(dá)極顯著水平[6]；浙江橫畈林場(chǎng)1.5代杉木種子園中16個(gè)無性系澀籽率的變動(dòng)幅度在14.7%～31.8%之間[7]。這表明杉木澀籽率性狀與遺傳背景之間存在一定的相關(guān)性，可能受到特殊基因型的調(diào)控。另外，何?；鵞8]報(bào)道了一些家系的澀籽率不受環(huán)境變化的影響，不同年份的變動(dòng)系數(shù)不大。這表明某些基因型對(duì)澀籽的影響程度要大于環(huán)境因素，可能起到?jīng)Q定性作用。這些基因型出現(xiàn)近交、自交等高度純合時(shí)，將導(dǎo)致澀籽率的大幅上升。王潤(rùn)輝等[9]認(rèn)為，杉木雌雄花花期存在重疊，加之種子園管理上往往采用截干矮化管理而縮短了雌雄花的空間間隔，導(dǎo)致自花授粉比率較高，進(jìn)而誘發(fā)澀籽的大量出現(xiàn)。而人工輔助授粉工作可有效降低澀籽率[10],其機(jī)理可能是胚胎致死基因座位上的等位基因純化。

上述報(bào)道表明澀籽受遺傳因素的影響，但關(guān)于澀籽性狀的基因分型及數(shù)量性狀座位(quantitative trait locus, QTL)定位研究尚未見報(bào)道。在將來的研究中可選擇各種子園篩選的不同澀籽率表型無性系開展定向雜交授粉工作，以杉木基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析、群體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析等技術(shù)手段，篩選與澀籽高度相關(guān)的分子標(biāo)記位點(diǎn)，并進(jìn)一步開展基因分型工作，從而更準(zhǔn)確地揭示影響澀籽的遺傳因素。

1.2 環(huán)境因素

外部氣候條件也可影響杉木澀籽的發(fā)生[11-12]。林思祖等[13]應(yīng)用逐步回歸法分析了47個(gè)影響杉木澀籽發(fā)生的氣象因素，認(rèn)為澀籽發(fā)生與不同生長(zhǎng)時(shí)期的降雨量、相對(duì)濕度、最高氣溫、蒸發(fā)量等有較強(qiáng)的相關(guān)性，如3月的降雨量與澀籽率呈顯著正相關(guān)，而8—9月的最高氣溫則與其呈顯著負(fù)相關(guān)。產(chǎn)區(qū)地理位置不同，杉木澀籽率也有明顯差異[14]，如福建省的一般產(chǎn)區(qū)通常較中心產(chǎn)區(qū)高7.9%左右，變動(dòng)系數(shù)也更大[15]；閩東南地區(qū)還存在極為明顯的高澀籽率趨勢(shì)面[16]。澀籽的發(fā)生還可能受到局部小氣候的影響。下部枝條著生的球果澀籽發(fā)生率明顯高于中上部，可能是由于不同冠層球果受到局部光照、空氣流通程度、花粉擴(kuò)散空間等微環(huán)境因素的差異造成澀籽率的不同[6,17]。另外，陳曉陽等[18]提出杉木球果的形態(tài)與澀籽發(fā)生具有相關(guān)性，緊包半圓型、反卷型、松張寬鱗型和松張半圓型珠鱗的澀籽率較高?？梢?，種鱗開放程度越高，則越容易受到外界環(huán)境因素的影響，而出現(xiàn)澀籽現(xiàn)象。

綜上可見，杉木澀籽形成受環(huán)境因素影響。由于當(dāng)前未見有關(guān)降水、溫度、蒸發(fā)量以及土壤養(yǎng)分等因素的控制試驗(yàn)的報(bào)道，因此環(huán)境因素是直接產(chǎn)生環(huán)境信號(hào)而誘導(dǎo)相應(yīng)基因的表達(dá)，還是通過影響花粉擴(kuò)散行為而產(chǎn)生作用，目前尚不知曉。

2 澀籽的形態(tài)結(jié)構(gòu)

形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)上的差異是揭示杉木敗育形成機(jī)制的表型證據(jù)，不同杉木敗育類型具有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。呂洪飛等[19-21]通過形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)技術(shù)手段，分析了杉木雄性不育型敗育小孢子的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)其主要發(fā)生在孢原細(xì)胞到四分體時(shí)期，而輸導(dǎo)組織發(fā)育異常、小孢子囊壁中層細(xì)胞增生、絨粘層過早解體及囊外包被結(jié)構(gòu)可能是導(dǎo)致杉木小孢子發(fā)育異常的主要原因。

澀籽與健籽種胚形態(tài)結(jié)構(gòu)存在較大差異。杉木存在受精延遲現(xiàn)象，授粉完成后，小孢子會(huì)停留在珠孔附近長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月左右，期間雖然萌發(fā)出花粉管，但并不形成頸卵器，而大孢子則繼續(xù)發(fā)育直至成熟[22]。這一階段澀籽還未表現(xiàn)出敗育現(xiàn)象。5月杉木雌配子體發(fā)育期是澀籽胚胎敗育的起始階段，此時(shí)澀籽胚珠瘦小，珠孔和珠心組織萎縮，花粉管提前延伸至尚未發(fā)育完全的胚珠內(nèi)部[23]。6月中上旬，健籽在近珠孔端形成頸卵器，并開始正常受精；但澀籽的珠心組織仍未發(fā)育完全，不能為雌配子體的正常發(fā)育提供充足的營養(yǎng)，造成雌配子體發(fā)育不健全，同時(shí)胚珠嚴(yán)重萎縮，不具備完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，無法正常受精。此時(shí)可以觀察到在珠孔端有澀籽物質(zhì)出現(xiàn)，并隨著澀籽的發(fā)育而逐漸向種子下部積累[24]。因此，可以將杉木澀籽的形成總結(jié)為胚胎的敗育和澀籽物質(zhì)積累兩個(gè)過程，它們發(fā)生的時(shí)間與空間不同。

上述研究?jī)H從顯微觀測(cè)中獲得推論，并不能解釋澀籽物質(zhì)的積累與種胚敗育之間的關(guān)系。究竟是種胚敗育造成組織細(xì)胞破損而產(chǎn)生應(yīng)激信號(hào)，進(jìn)而導(dǎo)致澀籽物質(zhì)的積累，還是在胚胎發(fā)育初期，澀籽物質(zhì)積累存在“微量高效，逐級(jí)放大”的效應(yīng)從而誘發(fā)種胚敗育，無法通過顯微觀測(cè)法判別，還需要綜合更多的證據(jù)。

3 澀籽物質(zhì)的組成成分

3.1 澀籽物質(zhì)定性

杉木澀籽物質(zhì)指種腔中的暗紅褐色物質(zhì)。早期研究認(rèn)為杉木澀籽中存在單寧類物質(zhì)，占種子總重量的20%～30%[10,25]，是澀籽物質(zhì)的主要成分。沈永寶等[26]認(rèn)為，部分空癟粒在種眼基部可觀測(cè)到積累了少量單寧類物質(zhì)，也應(yīng)劃分為澀籽?？梢姡瑔螌庮愇镔|(zhì)是杉木澀籽的標(biāo)志性代謝物。林小琴等[27]認(rèn)為，澀籽物質(zhì)包括類黃酮類—多酚類化合物，涵蓋了所有單寧和單寧類衍生物，并以改良的超聲波提取法測(cè)定了澀籽與健籽中的多酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其占比分別為38.3%、18.4%。Chen et al[28]分析了澀籽物質(zhì)積累期的代謝特征，證實(shí)類黃酮類代謝物在澀籽中呈極顯著上調(diào)積累，占差異代謝物總數(shù)的55.4%?？梢姡慄S酮類—多酚類化合物是澀籽物質(zhì)的主要成分。

3.2 澀籽物質(zhì)組分

余象煜等[29]最早測(cè)定了澀籽物質(zhì)的具體組分。林小琴[30]利用高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)對(duì)成熟澀籽和健籽進(jìn)行了成分鑒定，共發(fā)現(xiàn)有83種差異代謝物。其中，沒食子酸、兒茶素、領(lǐng)苯二酚、阿魏酸等9種多酚類代謝物在澀籽中的含量遠(yuǎn)高于健籽。陳宇[31]分析了澀籽物質(zhì)積累期的代謝物含量動(dòng)態(tài)變化，篩選出144種類黃酮類代謝物，在澀籽物質(zhì)積累期的不同階段類黃酮類代謝物含量變化也有所差異。說明類黃酮類—多酚類化合物在澀籽物質(zhì)積累過程中處于動(dòng)態(tài)變化狀態(tài)。

類黃酮類—多酚類化合物具有較強(qiáng)的活性氧(ROS)結(jié)合能力，在細(xì)胞抗氧化體系中起重要作用[32-33]。類黃酮類—多酚類化合物的過量積累表明澀籽組織細(xì)胞可能受到ROS的攻擊，這與顯微證據(jù)相符合。類黃酮類—多酚類化合物可以通過多種方式對(duì)種子發(fā)育產(chǎn)生影響。過量積累的多酚類化合物可造成荔枝種胚內(nèi)吲哚乙酸(IAA)平衡失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎敗育[34-35]；類黃酮類—多酚類化合物對(duì)脂質(zhì)代謝物具有調(diào)控作用[36]，能夠影響稻草[37]和野櫻梅[38]胚乳脂質(zhì)代謝，造成胚乳中營養(yǎng)物質(zhì)積累異常，進(jìn)而影響整個(gè)種子的發(fā)育。類黃酮類—多酚類化合物還可通過調(diào)控microRNA表達(dá)，對(duì)種子發(fā)育必要調(diào)控基因的表達(dá)造成影響[39]。

總之，類黃酮類—多酚類化合物在澀籽發(fā)生過程中明顯異常積累，但其具體作用的研究尚未開展。在胚胎敗育發(fā)生之后，澀籽種胚為何不像癟粒一樣退化消失，而形成與健籽相似的外觀形態(tài)？在澀籽種胚敗育之后，是哪些組織仍然具有細(xì)胞活性，不斷進(jìn)行類黃酮類—多酚類化合物的生物合成？這些代謝物是否由母株輸送？這些問題都未得到很好的解釋。澀籽的形成是一個(gè)物質(zhì)積累的過程，必然消耗能量與養(yǎng)分。杉木為何在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中仍舊保留了澀籽這一看似沒有任何“回報(bào)”的性狀？有研究認(rèn)為，植物種實(shí)中單寧類物質(zhì)可以影響動(dòng)物取食傾向，防御鳥類[40-41]、嚙齒類[42]等取食，對(duì)種子擴(kuò)散造成影響[43-44]。澀籽是否也有防御鳥獸昆蟲，保護(hù)健籽的生物學(xué)意義？目前尚無研究報(bào)道。此外，澀籽中的氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸和植物激素類的組分含量也與健籽存在明顯的差異[31]。

4 澀籽的生理生化變化

4.1 有機(jī)大分子含量

杉木澀籽發(fā)生的過程伴隨著顯著的生理生化變化。首先，澀籽中的蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)等有機(jī)大分子含量明顯下降[45]。鄭郁善等[46]發(fā)現(xiàn)，澀籽中的可溶性糖和游離氨基酸含量明顯低于健籽；高智慧等[10]研究發(fā)現(xiàn)，澀籽中的總核酸、總蛋白和類脂等自敗育早期起就顯著低于健籽。核酸、蛋白和類脂是細(xì)胞核與細(xì)胞膜的重要組分，是維持細(xì)胞必要生理活動(dòng)的基本保證。健籽中核苷酸和氨基酸類代謝物的含量隨種子發(fā)育而逐漸增加[47]；但澀籽中核苷酸和氨基酸的含量極低，表明其可能由于胚胎敗育導(dǎo)致有機(jī)大分子的積累受到影響，細(xì)胞活性受到抑制，遺傳物質(zhì)合成減少。這說明在澀籽物質(zhì)積累過程中，組織細(xì)胞處于持續(xù)失活狀態(tài)，也反映出澀籽體積增大并不是正常的生理發(fā)育現(xiàn)象。另外，澀籽中的脂質(zhì)含量也明顯低于健籽，后胚期澀籽中的粗脂肪含量?jī)H為健籽的一半，至成熟期其比例下降至健籽的1/4左右[25]。脂質(zhì)作為細(xì)胞膜系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)元素，在細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[48-49]；同時(shí)也是植物種子能量?jī)?chǔ)備的主要形式[50-51]。脂質(zhì)代謝物顯著下降反映了澀籽膜系統(tǒng)受到破壞，或活性缺陷后胚胎組織受損造成的活細(xì)胞減少。

4.2 氧化酶活性

由原胚期至胚成熟期，澀籽中的過氧化物酶活性逐漸降低，且均低于健籽，尤其是在胚成熟期時(shí)其活性僅為健籽的13.70%左右；同時(shí)后胚期澀籽中脂肪酶活性則顯著升高[52]。伴隨著氧化酶系與脂肪酶活性的變化，澀籽中的丙二醛(MDA)含量和細(xì)胞膜透性均顯著上升，而呼吸強(qiáng)度則顯著下降[25]。由此說明澀籽的氧自由基活躍程度較高，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷，同時(shí)氧化酶系活性的降低阻滯了組織內(nèi)氧自由基清除效率，使得脂質(zhì)氧化而產(chǎn)生MDA，最終導(dǎo)致澀籽組織的壞死。

4.3 內(nèi)源激素含量

不同類型植物激素相互作用形成調(diào)控種胚成熟的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。澀籽的激素調(diào)控模式有別于健籽。陳宇[31]研究表明，澀籽中生長(zhǎng)素合成受到抑制，玉米素可能出現(xiàn)形態(tài)變化而影響活性。另外，與種胚發(fā)育相關(guān)的赤霉素在澀籽中均被分解或鈍化，而脫落酸的含量卻大大高于健籽[10]，表明澀籽種胚可能提前進(jìn)入衰老[53]，進(jìn)而影響下游代謝途徑最終導(dǎo)致敗育。

5 澀籽形成的分子調(diào)控

近年來，一些分子生物學(xué)手段逐漸應(yīng)用于杉木澀籽形成的研究。王培等[54-55]克隆了類黃酮生物合成途徑中的2個(gè)重要基因：無色花青素還原酶基因ClLAR和花青素還原酶基因ClANR。在不同澀籽率類型家系中，ClANR的表達(dá)活躍期不同。授粉后90～100 d時(shí)，高澀籽率家系ClANR的表達(dá)量顯著高于中、低澀籽率家系；在80 d時(shí)，低澀籽率家系的表達(dá)量較高。理挪等[56]克隆了杉木中調(diào)控油菜素內(nèi)酯生物合成的類固醇5α-還原酶基因(ClDET2)。6—7月ClDET2的下調(diào)表達(dá)可能與澀籽胚珠發(fā)育異常有關(guān)。

上述研究?jī)H涉及少數(shù)基因。綜合遺傳影響因素和形態(tài)學(xué)證據(jù)來看，尚有許多問題需結(jié)合分子生物學(xué)手段展開深入研究。如澀籽胚胎敗育是否受到母本特定基因的調(diào)控，使其在大孢子雌配子體發(fā)育階段就已經(jīng)產(chǎn)生敗育，或是在大小孢子體受精時(shí)受到隱性基因純合的影響而造成某些家系的澀籽發(fā)生率相對(duì)穩(wěn)定；是哪些外部環(huán)境因素觸發(fā)了相應(yīng)的分子調(diào)控開關(guān)，使得杉木在某些地區(qū)的澀籽率明顯升高，這些都有待于進(jìn)一步的研究。

6 展望

杉木澀籽形成經(jīng)歷胚胎敗育和澀籽物質(zhì)積累兩過程。授粉后在遺傳調(diào)控和環(huán)境影響下，雌配子體發(fā)育不健全而造成胚胎敗育、胚珠萎縮解體和組織結(jié)構(gòu)受損。同時(shí)，敗育還造成氨基酸等必需代謝物合成水平受到抑制，導(dǎo)致抗氧化酶系活性下降，加劇氧化造成的影響。另一方面，以類黃酮類—多酚類代謝產(chǎn)物為主要組分的澀籽物質(zhì)開始在近珠孔端出現(xiàn)，并逐步向下積累擴(kuò)散，最終填充整個(gè)種腔，形成澀籽。

當(dāng)前組學(xué)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用日益廣泛，以基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組、蛋白組等技術(shù)手段開展相關(guān)研究，是進(jìn)一步揭示澀籽形成機(jī)制的有效方法，但也面臨著一些困難。例如取材方面，由于發(fā)育初期的種胚十分微小，無法判斷其為澀籽或是健籽，因此無法針對(duì)澀籽發(fā)生的起始時(shí)期深入開展調(diào)控基因的篩選工作。另外，由于杉木生長(zhǎng)速度慢，結(jié)籽年限長(zhǎng)，加之遺傳轉(zhuǎn)化體系未完全建立，使得驗(yàn)證工作難度較大。有鑒于此，未來研究中可以考慮采用融合冷凍切片技術(shù)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和多組學(xué)聯(lián)合分析等更為先進(jìn)的技術(shù)，精準(zhǔn)把握澀籽發(fā)生的起始時(shí)期，從而準(zhǔn)確定位關(guān)鍵調(diào)控基因，構(gòu)建影響澀籽形成的基因調(diào)控時(shí)序網(wǎng)絡(luò)。另一方面，通過篩選杉木3代種子園中澀籽率表現(xiàn)顯著差異的家系群體和已有的雜交試驗(yàn)林，利用群體轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和杉木基因組重測(cè)序測(cè)定數(shù)據(jù)，開發(fā)與澀籽性狀高度相關(guān)的分子標(biāo)記，進(jìn)一步完善輔助基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的研究。在此基礎(chǔ)上可進(jìn)一步開發(fā)分子育種芯片，改善目前杉木種子園只注重生產(chǎn)性狀的篩選，而忽略良種質(zhì)量的現(xiàn)狀，為杉木種子園良種高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)及品質(zhì)提升提供新的思路與借鑒。