一種重組蛋白的表達(dá)、純化及應(yīng)用綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)踐

李曉玲，李 晨

（山西大學(xué) 國(guó)家級(jí)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，山西 太原 030006）

生化分析與技術(shù)是一門專業(yè)基礎(chǔ)課，其目的是通過(guò)教與學(xué)使學(xué)生熟悉和掌握生物大分子的分離、純化、制備、檢測(cè)等技術(shù)的基本原理、方法和操作，是一門實(shí)驗(yàn)性很強(qiáng)的課程。通過(guò)教學(xué)-科研相結(jié)合的方式，由科研實(shí)驗(yàn)室提供部分具有探究性質(zhì)的課題內(nèi)容作為綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目有利于培養(yǎng)學(xué)生的科研能力，并進(jìn)一步激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新潛能[1-3]。蛋白質(zhì)是重要的生物大分子，在組織或細(xì)胞中以復(fù)雜的混合物形式存在，蛋白質(zhì)的分離純化是生物化學(xué)技術(shù)中的重點(diǎn)內(nèi)容，在科研和生產(chǎn)中都有重要作用。分離純化特定蛋白質(zhì)的一般程序可分為前處理、粗分級(jí)和細(xì)分級(jí)。細(xì)分級(jí)一般指多種層析方法，包括凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析及親和層析等[4]。其中親和層析特異性強(qiáng)，具有高效、迅速的優(yōu)點(diǎn)，有時(shí)僅一步即可達(dá)到純化目的。其他層析方法的特異性比較低，通常需要綜合多步操作[5]。為了讓學(xué)生熟悉蛋白質(zhì)分離純化及鑒定流程，充分理解并掌握親和層析方法，在生化分析與技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中設(shè)計(jì)了 “一種重組胰蛋白酶抑制劑的表達(dá)、純化及應(yīng)用” 綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，內(nèi)容包括重組胰蛋白酶抑制劑（recombinant trypsin inhibitor，rTI）的制備及純化、親和吸附劑的制備、蛋白活性測(cè)定等方法，用到了離心技術(shù)、親和層析、凝膠過(guò)濾、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）等多項(xiàng)技術(shù)。通過(guò)該綜合實(shí)驗(yàn)對(duì)生物科學(xué)及生物技術(shù)專業(yè)學(xué)生進(jìn)行科研訓(xùn)練，旨在提高學(xué)生科研能力，取得了良好的教學(xué)效果。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

（1）掌握親和層析和凝膠過(guò)濾的原理、應(yīng)用及操作方法。

（2）掌握SDS-PAGE 原理和應(yīng)用、垂直平板電泳的使用方法。

（3）了解蛋白質(zhì)固定化技術(shù)的概念、種類及應(yīng)用。

2 實(shí)驗(yàn)原理

2.1 親和層析

某些生物分子間存在特異性的相互作用，能進(jìn)行專一而又可逆的結(jié)合，如酶與底物或抑制劑、抗體與抗原、激素與受體、凝集素與糖等[4]。親和層析就是利用生物大分子對(duì)其配體分子的專一性識(shí)別能力建立起來(lái)的一種純化方法，具有高效、迅速的優(yōu)點(diǎn)，有時(shí)僅需一步即可達(dá)到純化目的。將一對(duì)能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基（也稱為配體），與具有大孔徑的親水性固相載體相偶聯(lián)，可制成專一的親和吸附劑。rTI 是胰蛋白酶的一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，具有良好的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性，可用于制備親和吸附劑用以專一純化胰蛋白酶。本綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩次親和層析操作，一是根據(jù)重組蛋白上的His×6 標(biāo)簽，用Ni2+-NTA Agarose 親和柱純化重組胰蛋白酶抑制劑rTI，二是將rTI 固定化做成親和吸附劑特異純化胰蛋白酶。

2.2 凝膠過(guò)濾

凝膠過(guò)濾是利用具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)顆粒的分子篩作用，根據(jù)被分離樣品中各組分相對(duì)分子質(zhì)量大小的差異進(jìn)行洗脫分離的一項(xiàng)技術(shù)。不同大小的分子由于在凝膠珠中所經(jīng)歷的路徑不同得以分離，依據(jù)分子大小被先后洗脫出來(lái)。凝膠過(guò)濾可用于分離純化蛋白質(zhì)、脫鹽及測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。在本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)Ni2+-NAT 親和層析制備的蛋白樣品中含有高濃度的NaCl 和咪唑，因此使用凝膠過(guò)濾進(jìn)行脫鹽及置換緩沖液。

2.3 SDS-PAGE

在進(jìn)行PAGE 時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率取決于它所帶的凈電荷、分子大小和形狀。十二烷基硫酸鈉SDS 是一種強(qiáng)陰離子型變性劑，引入SDS 后改變了蛋白質(zhì)分子的天然構(gòu)象，使大多數(shù)蛋白質(zhì)分子呈同樣的棒狀。同時(shí)，SDS 使多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。因此SDS- PAGE 中蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于其相對(duì)分子質(zhì)量，可用于鑒定蛋白質(zhì)純度及測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。

2.4 固定化技術(shù)

最常見(jiàn)的為固定化酶技術(shù)，指用物理或化學(xué)方法使酶成為不溶于水的但仍具有酶活性的衍生物，不易從載體上流失，易于回收[4]。酶或蛋白質(zhì)固定化的方法分為物理法（如吸附法和包埋法）和化學(xué)法（如交聯(lián)法和偶聯(lián)法）。相比物理法，化學(xué)法固定的酶/蛋白質(zhì)與載體結(jié)合力更強(qiáng)，穩(wěn)定性更高。其中，溴化氰活化瓊脂糖用于配體固相化簡(jiǎn)便廉價(jià)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、凝集素等的固定化。在本實(shí)驗(yàn)中使用溴化氰活化瓊脂糖偶聯(lián)rTI，做成親和吸附劑，用以特異純化胰蛋白酶。

3 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌E.coli BL21（DE3）（含重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30-TI，由科研實(shí)驗(yàn)室提供）。

實(shí)驗(yàn)試劑：卡那霉素、NaCl、胰蛋白胨、酵母提取物、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、IPTG、Tris、鹽酸、丙烯酰胺、TEMED、AP、考馬斯亮藍(lán)R25、低分子量蛋白Marker、溴化氰活化瓊脂糖等。

實(shí)驗(yàn)儀器：BioRad 蛋白純化系統(tǒng)、恒溫?fù)u床、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、離心機(jī)、酸度計(jì)、超聲波細(xì)胞破碎儀、恒溫水浴鍋、凝膠成像儀、真空冷凍干燥機(jī)、蛋白電泳槽、電泳儀等。

層析柱：Ni2+-NTA Agarose 層析柱、Saphadex G25層析柱。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 重組胰蛋白酶抑制劑的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

4.1.1 rTI 的誘導(dǎo)表達(dá)

將含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）菌種活化并擴(kuò)大培養(yǎng)，按照1%接菌量接種于1 L 的LB 培養(yǎng)液中（含0.1 mg/mL Kan），37 ℃，180 r/min 恒溫震蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液在600 nm 處吸光度值達(dá)到0.6 時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至終濃度0.5 mmol/L 以誘導(dǎo)重組目的蛋白表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。5 000 r/min 離心10 min 收集菌體，用提取緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）洗滌菌體兩次，將菌體充分懸浮于100 mL 提取緩沖液中，冰浴中超聲破碎至菌液透亮。超聲破碎條件為180 W，超聲6 s，間歇9 s。超聲破碎后4 ℃，12 000 r/min 離心30 min，收集上清，即為粗品蛋白。

4.1.2 rTI 的純化

用Ni2+-NTA Agarose 層析柱在BioRad 蛋白純化系統(tǒng)上分離目的重組蛋白。用平衡緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 7.5）充分平衡Ni2+-NTA 層析柱。粗品蛋白經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后上樣于 Ni2+-NTA 層析柱， 流速設(shè)定為1 mL/min。充分洗脫未結(jié)合蛋白后，用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，300 mmol/L咪唑，pH 7.5）進(jìn)行洗脫。收集洗脫峰蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 分析，用Superdex G-25 脫鹽柱將重組蛋白的緩沖液置換為NaHCO3溶液（20 mmol/L，pH 8.0），進(jìn)一步用真空冷凍干燥機(jī)凍干得到rTI 干粉。

4.1.3 rTI 的活性分析

在 2.5 mL 的測(cè)活體系中（pH 7.5，0.1 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L 的 CaCl2），加入0.25 mL 胰蛋白酶（40 μg/mL）和50 μL 的rTI，37 ℃保溫5 min，加入17 μL 底物 BApNA（0.15 mol/L），保溫反應(yīng)10 min 后，加 0.5 mL 33%醋酸溶液終止反應(yīng)。在410 nm 下測(cè)定吸光值，按照下式計(jì)算抑制率。對(duì)照組以相同體積的Tris-HCl 緩沖液代替抑制劑溶液[6]。

抑制率=(A1-A2)/A1×100%.

其中，A1和A2分別為對(duì)照組和樣品組在410 nm 處的吸光度值。

改變抑制劑體積，分別測(cè)定10、20、30、40、50 μL rTI 的抑制率，以濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制抑制活性曲線，并計(jì)算rTI 的半抑制濃度IC50 值。

4.1.4 SDS-PAGE 電泳檢測(cè)

以低分子量蛋白質(zhì)Marker（14.4～97.4 kDa）為對(duì)照，采用 4%和 15%濃縮膠。將純化后的 rTI 和6×SDS-PAGE 樣品緩沖液以5∶1 的比例進(jìn)行混合，在沸水中煮沸3 min，點(diǎn)樣后進(jìn)行電泳[7]。電泳時(shí)濃縮膠和分離膠電壓分別設(shè)置為80 和100 V。電泳結(jié)束后，將濃縮膠去除，分離膠放在玻璃皿中，在脫色搖床上用考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h，換成脫色液脫色至分離膠背景清晰，然后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄。

4.2 重組胰蛋白酶抑制劑的應(yīng)用

4.2.1 rTI-Agarose 的制備

用碳酸鈉緩沖液（250 mmol/L，pH 9.0）溶解rTI，并調(diào)整蛋白濃度為5 mg/mL。用去離子水清洗溴化氰活化瓊脂糖凝膠表面的溶劑后，繼續(xù)用碳酸鈉緩沖液浸泡并洗滌。將凝膠與rTI 溶液混合，在搖床上振蕩，25 ℃偶聯(lián)6 h。然后加入Tris-HCl 緩沖液（250 mmol/L，pH 8.3），繼續(xù)反應(yīng)6 h 封閉剩余的活性基團(tuán)。將偶聯(lián)了rTI 的凝膠填料裝于柱中，分別用1 mol/L NaCl 溶液和蒸餾水清洗10 個(gè)柱床體積，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.2.2 rTI-Agarose 用于純化胰蛋白酶

取100 μL 30 mg/mL 胰蛋白酶與250 μL 5 mg/mL牛血清白蛋白溶液低溫混合后迅速上樣于 rTIAgarose 親和層析柱， 平衡緩沖液為 Tris-HCl 20 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，pH 7.2，流速控制為1 mL/min。上樣并充分洗去未結(jié)合蛋白后，用pH 3.5的HAc-NaAc 緩沖液（100 mmol/L）洗脫層析柱。分別收集穿透峰與pH 3.5 緩沖液洗脫峰，測(cè)定各蛋白峰胰蛋白酶活性，并進(jìn)行SDS-PAGE 鑒定。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

5.1 rTI 的分離純化

用Ni2+-NTA 親和層析柱純化目的蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)對(duì)各蛋白峰抑制活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)蛋白峰1 和2無(wú)抑制活性，而蛋白峰3（含300 mmol/L 咪唑的洗脫液）抑制胰蛋白酶活性很強(qiáng)，為目的重組蛋白rTI。

圖1 親和層析分離rTI

親和層析純化得到的蛋白中含有很高濃度的鹽（主要為咪唑和氯化鈉），為了避免影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，采用了Superdex G25 層析柱對(duì)蛋白進(jìn)行脫鹽（圖2）。在圖2 中，曲線1 表示280 nm 處的光吸收值，反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度變化。曲線2 表示離子強(qiáng)度，反應(yīng)鹽濃度變化。鹽離子為小分子，蛋白質(zhì)為大分子，因此蛋白質(zhì)比鹽先洗脫出來(lái)，圖中蛋白曲線1 先出現(xiàn)吸收峰。另外，兩條曲線未有重疊，完全分開(kāi)，說(shuō)明rTI 與鹽得到了有效分離。

圖2 凝膠層析對(duì)重組蛋白脫鹽

5.2 SDS-PAGE 鑒定rTI

以低分子量蛋白質(zhì)Marker（14.4～97.4 kDa）為參照，將Superdex G-25 脫鹽后的重組蛋白rTI 進(jìn)行SDS-PAGE 鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3。rTI（泳道2）在電泳圖譜上顯示單一條帶，表明所得蛋白純度較高，達(dá)到電泳純。同時(shí)也表明親和層析是種很高效的純化方法，僅需一次層析便得到了高純度的目的蛋白。

圖3 rTI 的SDS-PAGE 電泳圖譜

5.3 rTI 對(duì)胰蛋白酶的抑制作用

由圖4 可知，固定胰蛋白酶濃度后，隨著rTI 濃度增加對(duì)胰蛋白酶的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)rTI 濃度為4.08 mmol/L 時(shí)對(duì)胰蛋白的抑制率達(dá)到50%。rTI對(duì)胰蛋白酶的半抑制濃度比較低，表明其對(duì)胰蛋白酶具有較強(qiáng)的抑制作用。rTI 對(duì)胰蛋白酶的半抑制濃度與從豆科植物補(bǔ)骨脂種子中純化出的一種胰蛋白酶抑制劑（P.corylifoliatrypsin inhibitor，PCTI）類似[8]。后者相對(duì)分子質(zhì)量約為18 kDa，對(duì)胰蛋白酶的半抑制率為3.36 mmol/L。

圖4 rTI 抑制胰蛋白酶活性分析

5.4 rTI-瓊脂糖凝膠對(duì)胰蛋白酶的純化作用

將胰蛋白酶與牛血清白蛋白混合樣品上樣于rTI-瓊脂糖凝膠親和層析柱，在pH 7.2 的平衡緩沖液條件下上樣，用pH 3.5 的緩沖液洗脫，層析圖譜見(jiàn)圖5。上樣與洗脫時(shí)均出現(xiàn)了蛋白峰，表明有一種蛋白在pH 7.2 緩沖液的條件下未與親和柱結(jié)合，另一種蛋白在此條件下與親和柱結(jié)合，但在pH 3.5 緩沖液條件下與柱解離，被洗脫出來(lái)。對(duì)2 個(gè)蛋白峰進(jìn)行胰蛋白酶活性鑒定，發(fā)現(xiàn)穿透峰沒(méi)有胰蛋白酶活性，而洗脫峰有活性，表明穿透峰為牛血清白蛋白，沒(méi)有胰蛋白酶，則胰蛋白酶全部結(jié)合到親和柱上。SDS-PAGE 結(jié)果（圖6）顯示洗脫樣品胰蛋白酶為單一條帶，穿透峰中只有牛血清白蛋白，進(jìn)一步說(shuō)明rTI-Sepharose 柱可以特異結(jié)合胰蛋白酶。

圖5 胰蛋白酶與牛血清白蛋白在rTI-瓊脂糖凝膠柱上的層析圖

圖6 親和層析蛋白峰的SDS-PAGE 圖譜（泳道1 和2 分別為峰1 和峰2 蛋白樣品）

6 綜合性實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐體會(huì)

6.1 教學(xué)組織

生化分析與技術(shù)開(kāi)設(shè)在生物化學(xué)課程之后，是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課的拓展和提升。雖然在生物化學(xué)課中已學(xué)習(xí)了層析、電泳、離心等技術(shù)的基本理論和操作技能，但本綜合實(shí)驗(yàn)具有一定的探究性，需要給學(xué)生留出時(shí)間查閱文獻(xiàn)并提出實(shí)驗(yàn)方案，與老師探討確定方案后自主實(shí)驗(yàn)，因此本實(shí)驗(yàn)課安排在學(xué)期的中期進(jìn)行。為保證教學(xué)效果，學(xué)生分小組進(jìn)行，每組人數(shù)控制在4人，集中在8 周內(nèi)完成。在8 周教學(xué)時(shí)間內(nèi)，實(shí)驗(yàn)室對(duì)外開(kāi)放，學(xué)生可以自主合理安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)的最終成果要求分別以科研論文和PPT 形式展示，在實(shí)驗(yàn)完成后一周進(jìn)行集中研討課。

6.2 教學(xué)效果

6.2.1 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)與綜合性實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提高學(xué)生對(duì)知識(shí)的應(yīng)用能力

驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)可規(guī)范和培養(yǎng)學(xué)生的基本實(shí)驗(yàn)技能，在印證理論知識(shí)上的作用不可替代[9]。然而，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)存在內(nèi)容簡(jiǎn)單、結(jié)果顯而易見(jiàn)、內(nèi)容與生產(chǎn)實(shí)際結(jié)合不夠緊密等問(wèn)題[10]。綜合性實(shí)驗(yàn)則是在驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上的提升，旨在提高學(xué)生綜合應(yīng)用知識(shí)的能力、創(chuàng)新能力及研究能力[11]。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象是一種重組蛋白，將其作為配體制備了親和吸附劑，用親和層析的方法制備一種蛋白酶。該酶廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、畜牧和現(xiàn)代生物技術(shù)等領(lǐng)域，是目前應(yīng)用最廣的蛋白酶之一[12]。本實(shí)驗(yàn)融合了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)和綜合性實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，將二者的優(yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)了有效互補(bǔ)，注重培養(yǎng)學(xué)生對(duì)知識(shí)的應(yīng)用能力，同時(shí)也有利于激發(fā)學(xué)生的科研興趣。

6.2.2 采用多種教學(xué)方式，提高學(xué)生綜合能力

（1）培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考能力。老師在介紹實(shí)驗(yàn)背景并提出實(shí)驗(yàn)任務(wù)后，需要學(xué)生在查閱調(diào)研文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案，經(jīng)與老師探討后獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)。在此過(guò)程中，有助于培養(yǎng)學(xué)生的自學(xué)能力及獨(dú)立思考問(wèn)題的能力。

（2）注重問(wèn)題引導(dǎo)，培養(yǎng)學(xué)生提出問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，老師可進(jìn)一步引導(dǎo)式提問(wèn)，如在使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組融合蛋白時(shí)，不同的誘導(dǎo)條件對(duì)蛋白的表達(dá)影響很大，如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件？本實(shí)驗(yàn)用親和層析方法純化胰蛋白酶，工業(yè)上傳統(tǒng)純化工藝是什么？?jī)煞N方法各有何利弊？酶（蛋白質(zhì)）固定化方法有哪些？各有什么特點(diǎn)？通過(guò)提出問(wèn)題，以點(diǎn)帶面，有助于學(xué)生觸類旁通，對(duì)相關(guān)內(nèi)容形成自己的知識(shí)體系。

（3）通過(guò)多種成果展示，培養(yǎng)學(xué)生綜合素質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果要求學(xué)生以科研論文形式呈現(xiàn)。通過(guò)撰寫科研論文鍛煉學(xué)生閱讀文獻(xiàn)、規(guī)范寫作及分析問(wèn)題的能力，使學(xué)生對(duì)所學(xué)知識(shí)有更全面深刻的認(rèn)識(shí)和理解。在最后的集中探討課上，學(xué)生以PPT 形式交流實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)PPT 展示鍛煉學(xué)生交流及表達(dá)能力，使學(xué)生能夠科學(xué)條理地描述問(wèn)題，準(zhǔn)確表達(dá)自己的觀點(diǎn)，初步培養(yǎng)學(xué)生的應(yīng)變及思辨能力[13]。有能力的同學(xué)可講解英語(yǔ)文獻(xiàn)，有助于提高學(xué)生的專業(yè)英語(yǔ)水平。

7 結(jié)語(yǔ)

“一種重組蛋白的表達(dá)、純化及應(yīng)用” 這個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目將教學(xué)與科研緊密結(jié)合，學(xué)生對(duì)選題很感興趣，激發(fā)了學(xué)生的求知欲。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，學(xué)生對(duì)重組蛋白、層析、電泳、固定化等概念有了較全面的學(xué)習(xí)和鞏固。在教學(xué)實(shí)踐中深入了解科研內(nèi)容，將傳統(tǒng)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)與綜合性實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行互補(bǔ)，充分利用研究項(xiàng)目等資源提高本科教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)學(xué)生對(duì)知識(shí)的綜合運(yùn)用能力。在整個(gè)教學(xué)過(guò)程中老師僅僅起幫助及把控的輔助角色，學(xué)生需要自行查閱文獻(xiàn)，制定計(jì)劃方案，分析討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果，完成科研論文撰寫，對(duì)實(shí)驗(yàn)做到了知其然并知其所以然，充分鍛煉了學(xué)生的自主學(xué)習(xí)能力，提高了學(xué)生的綜合科研素質(zhì)[14]。