高效液相色譜法測定帶藥骨水泥中硫酸慶大霉素C 組分的含量

李沅，馬金竹（通信作者），王翔宇

天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 （天津 300384）

骨水泥的主要成分為聚甲基丙烯酸甲酯，使用前分為粉末狀骨水泥聚合體和水劑的甲基丙烯酸甲酯，將兩者進(jìn)行調(diào)和，5～10 min 后聚合成粘性物質(zhì)。骨水泥在髖膝關(guān)節(jié)手術(shù)中起到固定的作用，為控制關(guān)節(jié)局部感染，還可使用抗生素類骨水泥。自1970年Buchholz、Engelreecht 等首次將抗生素骨水泥嘗試應(yīng)用于控制關(guān)節(jié)感染以來，人們開始認(rèn)識到這種局部給藥系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，并將其廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療骨科相關(guān)感染，尤其是對假體周圍感染的治療取得了很好的效果。

在骨水泥的實(shí)際臨床應(yīng)用中，選擇合理的抗生素是首要問題。目前，應(yīng)用較多的是慶大霉素、妥布霉素等，其具有抗菌譜廣、耐熱穩(wěn)定性好、吸收迅速等優(yōu)點(diǎn)。我們通過對骨水泥中硫酸慶大霉素含量的準(zhǔn)確測定，可以對帶藥骨水泥粉體原料、生產(chǎn)攪拌工藝及成品進(jìn)行質(zhì)量控制，為臨床應(yīng)用提供技術(shù)支持。

本試驗(yàn)參考藥典[1]，并在大量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立了測定骨水泥中硫酸慶大霉素C 組分含量的高效液相色譜法，該方法具有操作簡單、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性好的優(yōu)勢，為保證該類產(chǎn)品的質(zhì)量提供了有價值的質(zhì)量控制方案。

1 儀器與試藥

1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），紫外檢測器，G1316A 型色譜工作站；帶藥骨水泥（深圳市漢強(qiáng)醫(yī)用材料有限公司），乙腈（為色譜純，天津渤化化學(xué)試劑有限公司），氯甲酸-9-芴基甲酯（Fmoc-Cl） （為分析純，SIGMA），甘氨酸（為分析純，SIGMA），硼砂（Na2B4O7·10H2O） （為分析純，SIGMA），氫氧化鈉（為分析純，天津渤化化學(xué)試劑有限公司），硫酸慶大霉素工作標(biāo)準(zhǔn)品（MACKLIN），硫酸新霉素工作標(biāo)準(zhǔn)品（MACKLIN）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×100 mm，4 μm），流動相為乙腈:水（95:5），流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣體積為20 μl，柱溫為25 ℃，紫外檢測器的檢測波長設(shè)置為265 nm。

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液

準(zhǔn)確稱取1.50 g 骨水泥粉體，倒入250 ml 碘量瓶中并加入250.0 g 純化水，然后加入磁性轉(zhuǎn)子，蓋上瓶蓋，在磁力攪拌臺上高速攪拌30 min，取10 ml 懸浮液在4 000 rmp 的條件下離心6 min，上清液用純化水稀釋4倍，待測。

2.2.2 對照品溶液及標(biāo)準(zhǔn)工作液

精密稱取硫酸慶大霉素20.0 mg 于小燒杯中，加入適量純化水，攪拌至充分溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml 容量瓶中，定容至刻度，配置成2 mg/ml 的母液。

分別精密量取15、50、125、250、500 μl 硫酸慶大霉素母液于10 ml 容量瓶中，流動相定容至刻度，混勻，配置成濃度為3.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/ml 的對照品標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2.3 新霉素內(nèi)標(biāo)液

準(zhǔn)確稱取50 mg 硫酸新霉素于小燒杯中，加入適量純化水，攪拌至充分溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml 容量瓶中，定容至刻度，配置成濃度為5 mg/ml 的母液，使用時，將母液用純化水稀釋5倍，配置成工作液。母液和工作液均保存于-20 ℃冰箱中。

2.2.4 一般試劑

（1）0.2 mol/L 硼砂緩沖液（pH=8.0）：稱取1.24 g 硼酸（H3BO3）溶于70 ml 純化水中，使用1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至8.0，最后用純化水定容至100 ml 容量瓶中，混勻。（2）8 mmol/L Fmoc-Cl 衍生化試劑：稱取207 mg Fmoc-Cl（摩爾質(zhì)量為258.7 g/mol）于小燒杯中，加入適量乙腈攪拌溶解，轉(zhuǎn)移至100 ml 容量瓶中，乙腈定容至刻度，混勻，于4 ℃環(huán)境中避光保存。（3）0.1 mol/L 甘氨酸溶液：稱取75.07 mg 甘氨酸（摩爾質(zhì)量為75.07 g/mol）于小燒杯中，加入適量純化水?dāng)嚢枞芙猓D(zhuǎn)移至10 ml 容量瓶中，定容至刻度，混勻，于4 ℃環(huán)境中避光保存。

2.2.5 衍生化處理

準(zhǔn)確移取100 μl含硫酸慶大霉素的供試品溶液，依次向其中加入5 μl硫酸新霉素內(nèi)標(biāo)液（1 g/L）、100 μl乙腈、100 μl硼砂緩沖液（0.2 mol/L，pH=8.0）、100 μl Fmoc-Cl衍生化試劑（8 mmol/L），旋渦混勻30 s，置于暗處反應(yīng)15 min后，再加入20 μl甘氨酸（0.1 mol/L），旋渦混勻30 s，反應(yīng)結(jié)束；此外，將標(biāo)準(zhǔn)工作液同樣進(jìn)行上述衍生化處理。

2.3 方法適用性試驗(yàn)

依據(jù)給定的色譜條件，分別取空白溶液、對照品溶液和供試品溶液，依次進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1～3。硫酸慶大霉素4個組分峰的出峰時間在6～8 min，第1個峰與第2個峰分離度為2.1，第2個峰的理論塔板數(shù)為5 338。

2.4 線性關(guān)系

取“2.2.5”衍生化處理后的待測液，用0.22 μm 或0.45 μm 的濾頭過濾，按照給定的色譜條件進(jìn)行測定，記錄內(nèi)標(biāo)物及各濃度目標(biāo)物的色譜峰面積，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比（Y）對溶液濃度（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得硫酸慶大霉素4個峰的回歸方程和R2值（表1）。在3～100 μg/ml 范圍內(nèi)，目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比與目標(biāo)物濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，按照“2.2.1”和“2.2.5”項(xiàng)下方法平行配制6份待測液，依次進(jìn)樣，記錄結(jié)果并計算含量，6次結(jié)果的RSD=1.9%，表明該方法重復(fù)性好。

圖1 空白溶液

圖2 對照品溶液

表1 線性結(jié)果

2.6 儀器精密性試驗(yàn)

取一定濃度的樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD=0.68%，表明在所選定的色譜條件下，系統(tǒng)穩(wěn)定，儀器精密性好。

2.7 回收率試驗(yàn)

取6份已知含量的樣品，分成3組，每組分別加入對照品溶液（100 μg/ml）0.06、0.12、0.18 ml，進(jìn)行衍生化處理后，進(jìn)樣測定峰面積。以測得量與樣品含量和加入量比較，計算回收率，結(jié)果見表2。測得平均回收率為86.79%，RSD=3.31%（n=6）。

2.8 樣品含量測試

取同一批樣品，按照“2.2.1”和“2.2.5”項(xiàng)下平行配制3份供試品溶液，以每6個分析樣品和一組校正液成一個測試組的方式，分別進(jìn)樣，記錄峰面積并計算含量[骨水泥標(biāo)稱含量為19.97 mg/g，含量=檢測濃度×100/（骨水泥重量×標(biāo)稱含量），此計算濃度和標(biāo)準(zhǔn)校正濃度均為衍生化前]，結(jié)果見表3，測量結(jié)果均在標(biāo)稱值的±10%以內(nèi)。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3 樣品含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 內(nèi)標(biāo)物的選擇

由于硫酸新霉素與硫酸慶大霉素均屬于氨基糖苷類抗生素，結(jié)構(gòu)相似，理化性質(zhì)（極性、溶解度等）接近，在試驗(yàn)所設(shè)定的色譜條件下與樣品中待測組分可充分分離。采用內(nèi)標(biāo)法測量可在一定程度上消除進(jìn)樣量、儀器不穩(wěn)定等變化所引起的系統(tǒng)誤差。

3.2 檢測器波長的選擇

將硫酸慶大霉素對照品進(jìn)行衍生化處理后，采用紫外-可見分光光度計，在240～320 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定待測物質(zhì)的最大吸收波長為265 nm，并以此作為檢測波長。

3.3 衍生化處理及衍生條件的控制

因硫酸新霉素與硫酸慶大霉素缺乏紫外及熒光吸收，其含量無法用常規(guī)紫外或熒光檢測器直接測得，因此需進(jìn)行衍生化處理后再進(jìn)行檢測。由于硫酸慶大霉素只在衍生化處理后的較短時間內(nèi)保持穩(wěn)定，所以本方法采用Fmoc-Cl 試劑，對樣品進(jìn)行柱前衍生化后再用高效液相色譜法檢測。

衍生條件也會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。當(dāng)試劑Fmoc-Cl 濃度為8 mmol/L 時，反應(yīng)時間在10 min 以上，可得到較高的響應(yīng)值。在衍生化時，若乙腈不足，會導(dǎo)致Fmoc-Cl 的析出；若乙腈過量，硫酸慶大霉素、硫酸新霉素和硼酸緩沖液會產(chǎn)生沉淀，因此，在衍生化中保持乙腈與水的比例為1:1至關(guān)重要。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

由于硫酸慶大霉素的衍生化在短時間內(nèi)穩(wěn)定，所以本試驗(yàn)未進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。為保證測定結(jié)果可靠，本試驗(yàn)采用最多6個分析樣品和3個校正液成一個測試組。

3.5 結(jié)果分析

本試驗(yàn)待測組分有4個色譜峰，應(yīng)按峰面積加和法計算，此方法更能準(zhǔn)確測定硫酸慶大霉素的總量。

3.6 方法優(yōu)勢

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對同批3件骨水泥進(jìn)行測試，結(jié)果表明，該方法操作簡單，重復(fù)性好。由于對帶藥骨水泥的含量測定方法的國內(nèi)報道不多，故此研究為保證該產(chǎn)品的質(zhì)量提供了參考。