新型絡(luò)合試劑-紫外分光光度法測(cè)定石膏中鈣含量△

李曉明，魏旭雅，賴長(zhǎng)江生

中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700

石膏為一種常用的礦物類中藥[1]，主要成分為含水硫酸鈣(CaSO4·2H2O)，并混有其他形式的鈣元素[2]及眾多其他金屬元素[3]，具有清熱瀉火、除煩止渴的功效；用于外感熱病、高熱煩渴、肺熱喘咳、胃火亢盛、頭痛、牙痛等治療。

目前，按照石膏含量測(cè)定原理分類，可分為2種方法：一種是基于鈣元素含量折算石膏含量[4-5]，另一種是基于硫元素含量折算石膏含量[6]。其中，已被廣泛采納的方法是《中華人民共和國藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國藥典》)推薦的基于鈣元素含量測(cè)定的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)配位(絡(luò)合)滴定法[7-8]，該方法操作簡(jiǎn)便、精密度高。但是，該方法樣品消耗量較大，測(cè)定時(shí)pH需嚴(yán)格控制在12～13，否則影響指示劑鈣黃綠素終點(diǎn)顯色的靈敏度[9]；此外，該方法時(shí)常出現(xiàn)不溶物質(zhì)，滴定終點(diǎn)顏色難以判定，造成滴定終點(diǎn)提前[10]。所以，該方法人為判定誤差較大，耐受性相對(duì)較差。此外，國內(nèi)外學(xué)者還建立了許多新方法用于石膏中鈣含量的測(cè)定[11-12]，但都較難滿足一線藥物含量測(cè)定的需求。

為了對(duì)石膏的含量測(cè)定提供一種方法補(bǔ)充，用于解決滴定終點(diǎn)難以判定的難題，本課題組進(jìn)行了基于乙二醛雙縮 (2-羥基苯胺) (GBHA)[13]的比色法測(cè)定石膏中鈣含量的研究。GBHA及其衍生試劑已用于水質(zhì)、食品、臨床等領(lǐng)域鈣離子濃度的測(cè)定[14-15]。在本研究中，新建方法用于測(cè)定12個(gè)省份18批石膏樣品的含量，結(jié)果證實(shí)該方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可作為石膏質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的替代方法。

1 材料

1.1 儀器

水為自制的純水(50G型帕斯蒂卡超純水機(jī)，北京子涵世紀(jì)科技有限公司)；T6型新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；BP-211D型十萬分之一電子天平、BS-210S型萬分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；ES30A溫控電熱/磁力攪拌器(北京伯泰科儀器有限公司)。

1.2 試藥

絡(luò)合試劑-紫外可見分光光度法所用試劑 GBHA溶液：稱取GBHA(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20080916，純度≥97.0%，分析純)50.0 mg，置100 mL乙醇中，超聲溶解，搖勻后，貯藏于冷藏箱中，限用10 d。鈣溶液：精密量取鈣標(biāo)準(zhǔn)液(國家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院，批號(hào)：10033032，質(zhì)量濃度為1000 μg·mL-1，介質(zhì)為5%鹽酸，國家標(biāo)準(zhǔn)溶液)0.5 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋，制成5 μg·mL-1的鈣溶液。稀鹽酸溶液1：取濃鹽酸(北京化工廠，批號(hào)：20090726，體積分?jǐn)?shù)為36.0%～38.0%，分析純AR)58.5 mL，加水稀釋至250 mL。0.6 mol·L-1氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉(生工生物工程上海有限公司，批號(hào)：0173，純度>98.5%)6 g，溶于250 mL純水中。無水乙醇(北京化工廠，批號(hào)：20090910，分析純)。

EDTA-2Na配位(絡(luò)合)滴定法所用試劑鈣黃綠素指示劑：取鈣黃綠素(批號(hào)：20090806)0.1 g，加氯化鉀10 g，研磨均勻。甲基紅指示劑溶液：取甲基紅(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20091209)0.05 g，加3.7 mL的0.05 mol·L-1氫氧化鈉溶液使其溶解，加水稀釋至100 mL。氫氧化鉀溶液：取氫氧化鉀(北京試劑廠，批號(hào)：20060329，分析純)32.5 g，加水使其溶解至250 mL。稀鹽酸溶液2：取上述濃鹽酸58.5 mL，加蒸餾水稀釋至250 mL。EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)試劑，濃度為0.05 mol·L-1(國家化學(xué)試劑質(zhì)檢中心，批號(hào)：201001)。

對(duì)照品CaSO4·2H2O(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20090612，分析純，純度≥99.0%)。

樣品：石膏樣品1～18，包括生石膏塊、生石膏片、生石膏粉和煅石膏塊4種規(guī)格，產(chǎn)地包括四川、山東、湖南、河北、廣西、甘肅、河南、北京、內(nèi)蒙古、安徽、湖北和陜西，具體樣品信息見表1。

表1 石膏樣品收集產(chǎn)地與規(guī)格

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

絡(luò)合試劑-紫外可見分光光度法：取鈣溶液(5.0 μg·mL-1)2.00 mL，加GBHA溶液0.6 mL，無水乙醇4.4 mL，用0.6 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH=12.0(約0.40 mL)，用水定容至10 mL，搖勻，用1 cm比色皿，放置10 min左右，以試劑溶液為空白，測(cè)定吸光度。其中石膏樣品溶液的制備方法為取石膏樣品約2 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加稀鹽酸1.0 mL加熱溶解，0.6 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)至中性(約4.0 mL)，加水至刻度，搖勻。取2.00 mL該試液，按照試驗(yàn)方法測(cè)吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鈣含量。鈣的百分含量乘以系數(shù)4.296，即為石膏含量(以CaSO4·2H2O計(jì))。

EDTA-2Na配位(絡(luò)合)滴定法[1]：取供試品的細(xì)粉(100目)約0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，加稀鹽酸10 mL，加熱使溶解，加水100 mL與甲基紅指示液1滴，滴加氫氧化鉀試液至溶液顯淺黃色，再繼續(xù)多加5 mL，加鈣黃綠素指示劑少量，用EDTA-2Na滴定液(0.05 mol·L-1)滴定，至溶液的黃綠色熒光消失，并顯橙色。每毫升乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05 mol·L-1)相當(dāng)于8.608 mg的CaSO4·2H2O，或相當(dāng)于6.807 mg的CaSO4，進(jìn)而折算成石膏含量。此方法作為參照方法。

2.2 結(jié)果

2.2.1樣品描述 樣品1～7號(hào)呈纖維性塊狀，8～15為纖維性片狀，16～18為粉狀。除4、8、10號(hào)樣品呈現(xiàn)紅色外，其他樣品均為白色(樣品9、12、13、15～17)、白灰色(樣品2、6、7)或淡黃色(樣品1、5、11、14、18)，或半透明(樣品3)。故除樣品4、8、10外，其余樣品均符合《中國藥典》的性狀描述，見圖1。

2.2.2絡(luò)合試劑-紫外可見分光光度法 吸收波長(zhǎng)的選擇：按照2.1方法，以試劑溶液作空白，在300～700 nm波長(zhǎng)，對(duì)GBHA 溶液和鈣絡(luò)合物進(jìn)行掃描，最大吸收在526 nm處(見圖2)，所以選擇526 nm作為工作波長(zhǎng)。

圖2 GBHA鈣絡(luò)合物紫外-可見光掃描曲線

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按照試驗(yàn)方法，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定樣品溶液的吸光度值，發(fā)現(xiàn)樣品在10～20 min內(nèi)達(dá)到最大吸收值，顯色穩(wěn)定，RSD為0.14%，說明本實(shí)驗(yàn)中的樣品穩(wěn)定量良好，適合于室溫檢測(cè)，可滿足在室溫下定量的要求。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：在6個(gè)10 mL量瓶中，分別加入5.00 μg·mL-1Ca2+標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.60、1.20、1.80、2.00、2.40、3.00 mL，按照試驗(yàn)方法測(cè)吸光度，以Ca2+溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程：Y=0.043 3X+1.785×10-3，r=0.999 2。新建立的絡(luò)合試劑-紫外可見分光光度法的測(cè)定的質(zhì)量濃度為0～15.0 μg·mL-1。

精密度試驗(yàn)：按照試驗(yàn)方法，測(cè)定樣品溶液的吸光度值6次，RSD為0.13%，表明該方法經(jīng)多次取樣測(cè)定精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：平行取6份石膏樣品，每份約2 mg，精密稱定，按照試驗(yàn)方法測(cè)吸光度，計(jì)算RSD。數(shù)據(jù)顯示，重復(fù)性試驗(yàn)的RSD為2.66%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

加樣回收率試驗(yàn)：取生石膏約1 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，另加入鈣溶液 1.00 mL，加稀鹽酸1.0 mL加熱溶解，0.6 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)至中性(約4.0 mL)，加水至刻度，搖勻。在6個(gè)10 mL 量瓶中，分別加入已知含量的樣品溶液2.00 mL，按照試驗(yàn)方法[16]，測(cè)定吸光度值，求得加樣回收率，平均加樣回收率為101%，RSD為0.1% (見表2)。

注：樣品1 ～ 6為石膏塊；7 ～ 15為石膏片；16 ～ 18為石膏粉，其中6號(hào)樣品為煅石膏塊。圖1 石膏樣品

表2 石膏加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.3樣品溶液的測(cè)定 取生石膏約2 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加稀鹽酸1.0 mL加熱溶解，0.6 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)至中性(約4.0 mL)，加水至刻度值，搖勻。取2.00 mL該試液，按照試驗(yàn)方法測(cè)吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鈣含量，結(jié)果見表3。

表3 比色法石膏含量測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，從安徽、廣西龍瑞、廣西玉林、河南、陜西山陽縣、陜西商洛、內(nèi)蒙古多倫所購的石膏樣品，含量偏低，不符合《中國藥典》規(guī)定。所有其他樣品(包括煅制樣品)均符合《中國藥典》石膏項(xiàng)下含量不得少于95%。此外，樣品2、6、16中的其他物質(zhì)可能影響了新型絡(luò)合試劑-紫外可見分光光度法測(cè)定CaSO4·2H2O含量，導(dǎo)致測(cè)定值超過100%。

3 討論

EDTA配位(絡(luò)合)滴定法的原理是CaSO4·2H2O先被稀鹽酸分解成易解離的CaCl2和Ca(HSO4)2，在pH>12時(shí)溶液中Ca2+與鈣黃綠素指示劑形成絡(luò)合物而顯黃綠色熒光，終點(diǎn)到達(dá)時(shí)微過量的EDTA置換出指示劑絡(luò)合物中的Ca2+，黃綠色熒光消失[11]。且加熱80 ℃以上方可完全解離。石膏中其他金屬含量占比可達(dá)到0.045 3% ～ 0.234 3%[17]，但不影響EDTA配位(絡(luò)合)滴定法測(cè)定CaSO4·2H2O的含量。

程英明等[17]報(bào)道絡(luò)合劑GBHA 溶液量在0.55～0.65 mL吸光度值最大，且最大吸收峰為516 nm，本實(shí)驗(yàn)選0.60 mL，即GBHA與Ca的物質(zhì)的量比為5∶1，生成的絡(luò)合物穩(wěn)定，經(jīng)掃描，最大吸收在526 nm處，故選526 nm為工作波長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)嚴(yán)格控制乙醇的加入量，否則會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏小。由線性回歸方程Y=0.043 3X+1.785×10-3(r=0.999 2)，可知檢測(cè)質(zhì)量濃度為0～15.0 μg·mL-1與吸光度線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為101% (RSD 為0.10%，n=6)。新型絡(luò)合-紫外可見分光光度法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

致謝：山西長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)06級(jí)畢業(yè)生張明秀參與測(cè)試。