大鼠灌胃消癌解毒方水煎液后2種入血的單糖苷類成分含量測定及其藥代動力學(xué)研究△

錢桂英，閆秋瑩，程海波，沈衛(wèi)星，譚佳妮，李柳，孫東東*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 常熟附屬醫(yī)院，江蘇 蘇州 215500；2.國家中醫(yī)藥管理局 名醫(yī)驗方評價與轉(zhuǎn)化重點研究室/江蘇省抗腫瘤驗方研究與產(chǎn)業(yè)化工程實驗室/江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心/南京中醫(yī)藥大學(xué) 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇 南京 210023

腫瘤是由多種因素引起的復(fù)雜難治性疾病，近年來其發(fā)生率有上升趨勢[1]。當(dāng)前通過早期檢測和主動預(yù)防可以降低腫瘤的發(fā)生、干預(yù)腫瘤的發(fā)展[2]。長期以來，中藥被廣泛應(yīng)用于腫瘤防治，在提高患者生存質(zhì)量、延緩腫瘤發(fā)展進程、延長患者生存時間等方面發(fā)揮重要作用[3]。消癌解毒方是基于癌毒病機理論，針對不同腫瘤配伍形成的系列有效驗方[4]，本實驗所用方主要針對乳腺癌防治，其由天葵子、八月札、柴胡、漏蘆、白毛夏枯草和天冬組成，全方共奏抗癌解毒、疏肝解郁、化痰散結(jié)之功效?，F(xiàn)代研究表明，方中所用藥味在抑制腫瘤細胞增殖、調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎和抗菌等方面有廣泛的藥理活性[5-12]。去乙酰哈巴苷與紫草氰苷分別是白毛夏枯草和天葵子的主要活性成分，具有顯著的抗腫瘤作用[13-14]。有文獻報道采用高效液相色譜(HPLC)法進行大鼠血漿中乙酰哈巴苷的藥代動力學(xué)研究[15]，本團隊也建立了UPLC-MS/MS法測定大鼠灌胃天葵子水提物后血漿中紫草氰苷和格列風(fēng)內(nèi)酯的濃度[16]。由于天葵子與白毛夏枯草為該方的君臣主藥，在全方中起主要作用并具有較高劑量，所以其安全性應(yīng)引起重視；同時整方的藥效依賴于入血成分維持一定的濃度，主要藥味的活性累加作用尤為明顯。UPLC-MS/MS技術(shù)應(yīng)用于含量測定更加靈敏高效，鑒于此，本研究采用UPLC-MS/MS技術(shù)，建立同時測定大鼠灌胃消癌解毒方水煎液后血漿中乙酰哈巴苷和紫草氰苷含量的方法，并進行2種化合物的藥代動力學(xué)研究。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物公司，實驗動物許可證SCXK(滬)2007-0005。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度(25±2) ℃，12 h/12 h明暗光照循環(huán)。

1.2 試藥

柴胡BupleurumchinenseDC.、天冬Asparaguscochinchinensis(Lour.) Merr.、白毛夏枯草AjugadecumbensThunb.、八月札Akebiaquinata(Thunb.) Decne、漏蘆Rhaponticumuniflorum(L.)DC.和天葵子Semiaquilegiaadozoides(DC.)Makino藥材均購自安徽亳州國源中藥材公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為正品；乙酰哈巴苷(批號：P07D6F7164)、紫草氰苷(批號：PM0517SA13)及內(nèi)標(biāo)黃芩苷(批號：P09M7F10367)均購自上海源葉生物科技公司，純度均大于98%；質(zhì)譜級乙腈和甲醇購自美國默克公司；超純水使用南京EPDA公司超純水儀自制。

1.3 儀器

島津UHPLC系統(tǒng)，搭載LC-30AD泵、在線脫氣、自動進樣器、柱溫箱(日本島津公司)；三重四極桿5500 MS/MS系統(tǒng)(美國AB公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent Extend C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)。0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)作為流動相。梯度洗脫程序(0～1 min，5%～20%B；1～4 min，20%～60%B；4～6 min，60%～70%B；6～6.5 min，70%～5%B；6.5～7.5 min，5%B)，進樣體積3 μL，柱溫4 ℃，流速0.3 mL·min-1。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，待測物在正離子模式下進行檢測，乙酰哈巴苷m/z429.2/369.2，紫草氰苷m/z330.3/168.2，黃芩苷m/z447.2/271.1。檢測條件為氣簾氣(CU)：241.15 kPa；離子源溫度：500 ℃；霧化氣(GS1)壓力：378.95 kPa；霧化氣(GS2)壓力：378.95 kPa。

2.3 消癌解毒方藥材提取

消癌解毒方組成為柴胡6 g、天冬10 g、白毛夏枯草15 g、八月札10 g、漏蘆15 g和天葵子 15 g。將所有藥材混合后，分別加入10、8倍水，提取2次，每次2 h。將所得濾液抽真空濃縮至2 g·mL-1(以生藥量計)。

2.4 給藥與血漿樣品采集

12只大鼠隨機分為2組，根據(jù)臨床人用劑量進行換算后，給藥組灌胃消癌解毒方提取物27 g·kg-1，對照組給予3 mL生理鹽水。在末次給藥前及給藥后0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、8.00、12.00、24.00 h眼眶采血約0.3 mL于1.5 mL肝素化離心管中，5000 r·min-1(離心半徑7 cm)離心10 min，-80 ℃儲存。

2.5 血漿樣品預(yù)處理

90 μL血漿樣品加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液和300 μL甲醇溶液，渦旋5 min，13 000 r·min-1(離心半徑7 cm)，4 ℃離心10 min，上清低溫離心干燥，殘留物使用100 μL甲醇復(fù)溶，渦旋1 min，13 000 r·min-1(離心半徑7 cm)離心10 min。取上清3 μL進行檢測。取100 μL血漿樣品加入300 μL甲醇后，做上述相同處理，作為空白血漿樣品。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液與質(zhì)控(QC)樣品制備 精密稱取乙酰哈巴苷、紫草氰苷及內(nèi)標(biāo)黃芩苷，加入甲醇溶解，使其母液質(zhì)量濃度分別為：乙酰哈巴苷115 μg·mL-1、紫草氰苷73 μg·mL-1、黃芩苷276 μg·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液通過使用甲醇稀釋母液至適當(dāng)質(zhì)量濃度制備。內(nèi)標(biāo)儲備液質(zhì)量濃度為2 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液使用10 μL工作液加入90 μL空白血漿制備。乙酰哈巴苷系列溶液質(zhì)量濃度分別為1.11、2.21、3.16、4.42、44.23、176.92、221.15 ng·mL-1，紫草氰苷系列溶液質(zhì)量濃度分別為0.70、1.40、2.01、2.81、28.08、112.32、140.40 ng·mL-1。乙酰哈巴苷QC樣品質(zhì)量濃度為2.21、4.42、176.92 ng·mL-1，紫草氰苷QC樣品質(zhì)量濃度為1.40、2.81、112.32 ng·mL-1。上述樣品保存于4 ℃，備用。

2.6.2專屬性 制備分別含有乙酰哈巴苷、紫草氰苷和黃芩苷20 ng·mL-1工作液，使用10 μL工作液加入90 μL空白血漿，制備空白血漿+混合對照品樣品，取空白血漿樣品、空白血漿+混合對照品樣品及灌胃后0.5 h血漿樣品進行檢測。結(jié)果見圖1，血漿中成分對各待測物無干擾，方法屬性良好。

2.6.3線性關(guān)系與檢測限 以各待測物濃為X，各待測物和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為Y，進行線性回歸，得到各待測物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。各待測物最低檢測濃度(LLOQ)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線上質(zhì)量濃度最低點。測得的平均質(zhì)量濃度在其標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度的±20%，且RSD≤20%。結(jié)果如表1所示，各待測物在其線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表1 血漿中各待測物標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

2.6.4精密度與準(zhǔn)確度 QC樣品低、中、高3個質(zhì)量濃度分別重復(fù)檢測6次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各待測物質(zhì)量濃度，內(nèi)標(biāo)樣品的日內(nèi)精密度和日間精密度RSD分別為5.64%和0.97%。QC樣品的日內(nèi)、日間精密度RSD均在±15%。乙酰哈巴苷3個質(zhì)量濃度日內(nèi)精密度RSD分別為2.74%、1.54%、2.93%，日間精密度RSD分別為4.10%、1.50%、2.90%；紫草氰苷3個質(zhì)量濃度日內(nèi)精密度RSD分別為1.32%、0.58%、3.28%，日間精密度RSD分別為12.45%、1.32%、0.17%；準(zhǔn)確度通過QC樣品檢測質(zhì)量濃度與實際質(zhì)量濃度比值計算，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)確度RE為-3.63%，乙酰哈巴苷3個質(zhì)量濃度日內(nèi)準(zhǔn)確度RE分別為-2.82%、3.03%、-2.56%，日間準(zhǔn)確度RE分別為7.86%、1.06%、-5.10%；紫草氰苷3個質(zhì)量濃度日內(nèi)準(zhǔn)確度RE分別為13.61%、-14.37%、-4.81%，日間準(zhǔn)確度RE分別為-1.31%、-12.45、2.74%。結(jié)果表明，該方法對各待測物具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

注：Ⅰ.空白血漿；Ⅱ.空白血漿+混合對照品；Ⅲ.灌胃后0.5 h血漿+黃芩苷；A.乙酰哈巴苷；B.紫草氰苷；C.黃芩苷。圖1 血漿中乙酰哈巴苷、紫草氰苷和黃芩苷的液相色譜圖

2.6.5提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 各待測物的提取回收率通過比較QC樣品中峰面積和標(biāo)準(zhǔn)溶液中峰面積得到。分別取乙酰哈巴苷和紫草氰苷3個質(zhì)量濃度的QC樣品進行檢測，得到峰面積A1，每個質(zhì)量濃度平行檢測6個樣本；將空白血漿處理后得到上清，分別加入乙酰哈巴苷和紫草氰苷配制成與QC樣品相應(yīng)質(zhì)量濃度的樣品，分別檢測得到峰面積A2，每個質(zhì)量濃度平行檢測6個樣品，通過公式A1/A2×100%計算得到提取回收率，內(nèi)標(biāo)提取回收率使用相同方法計算?；|(zhì)效應(yīng)通過比較前處理血漿樣品中各待測物中的樣品峰面積與甲醇溶液中各待測物的樣品峰面積評價。分別配制乙酰哈巴苷和紫草氰苷3個與QC樣品相同質(zhì)量濃度的對照品工作液，不經(jīng)過處理直接進行檢測，得到峰面積A3，通過公式A2/A3×100%計算得到基質(zhì)效應(yīng)，內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)使用相同方法計算。結(jié)果表明，內(nèi)標(biāo)提取回收率為81.84%，基質(zhì)效應(yīng)為81.27%，各待測物提取回收率為89.56%～109.03%，基質(zhì)效應(yīng)為86.03%～104.46%。各待測物提取回收率良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對待測物無明顯基質(zhì)效應(yīng)。

2.6.6穩(wěn)定性 分別將3個質(zhì)量濃度的血漿QC樣品放置在室溫24 h后檢測各待測物的濃度，得到各待測樣品短期穩(wěn)定性結(jié)果；將3個質(zhì)量濃度血漿QC樣品進行3次凍融循環(huán)后檢測各待測物的濃度，得到各待測物凍融循環(huán)的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，在2種不同的情況下，各待測物檢測結(jié)果RSD均在15%以內(nèi)，表明其穩(wěn)定性良好。

2.7 藥代動力學(xué)研究

對2.4項下得到的各血漿樣品進行含量測定，使用DAS 2.0軟件對其進行非房室模型擬合。各活性成分血藥濃度-時間曲線見圖2，藥代動力學(xué)參數(shù)峰濃度(Cmax)、藥時曲線下面積(AUC)、達峰時間(Tmax)、半衰期(t1/2)和平均駐留時間(MRT)見表2。由圖2可知，乙酰哈巴苷在體內(nèi)被快速吸收，灌胃后0.5 h達到最高血藥濃度，紫草氰苷在灌胃后3 h達到最大血藥濃度，紫草氰苷出現(xiàn)吸收雙峰，且第2個吸收峰高于第1個。

圖2 乙酰哈巴苷、紫草氰苷血藥濃度曲線

表2 各待測物藥代動力學(xué)參數(shù)

3 討論

有文章報道使用HPLC對乙酰哈巴苷進行藥代動力學(xué)研究[15]，該方法檢測靈敏度較低。本課題組曾通過UPLC-MS/MS檢測大鼠血漿中紫草氰苷和格列風(fēng)內(nèi)酯的含量[16]，得到良好的檢測結(jié)果，因此將此方法應(yīng)用于本研究。為得到良好的檢測結(jié)果，本研究對不同的流動相系統(tǒng)進行考察，如甲醇水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液等，結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫具有更好的響應(yīng)，各待測物也能夠更好地分離，血漿中的內(nèi)源性成分也不會對待測物產(chǎn)生顯著的影響。

藥代動力學(xué)研究表明，乙酰哈巴苷的MRT和t1/2均長于紫草氰苷，表明乙酰哈巴苷在大鼠體內(nèi)消除更加緩慢，更有利于保持藥物療效。乙酰哈巴苷和紫草氰苷Tmax明顯不同，使2種成分在不同的時間達到Cmax，避免同時達到Cmax而產(chǎn)生毒副作用。與文獻報道尾靜脈注射乙酰哈巴苷相比較[15]，乙酰哈巴苷Tmax、t1/2和MRT0～t值均明顯延后，分析其原因為灌胃給藥后藥物需要經(jīng)過吸收后才能入血、分布及代謝，灌胃后其消除曲線與尾靜脈給藥消除曲線一致。與單獨灌胃天葵子后檢測到的紫草氰苷藥代動力學(xué)參數(shù)比較[16]，本研究中紫草氰苷的Tmax和t1/2均延后，可能與其在復(fù)方配伍后多種成分相互影響有關(guān)。乙酰哈巴苷和紫草氰苷在大鼠灌胃消癌解毒方和單味藥材提取物后的藥代動力學(xué)比較研究，有利于進一步闡明藥物之間的相互作用，值得進一步研究。

本研究建立了同時測定消癌解毒方中2種潛在抗腫瘤成分的UPLC-MS/MS，并將其應(yīng)用于2種成分的藥代動力學(xué)研究，為消癌解毒方應(yīng)用的安全性及藥效作用研究提供參考。