寧夏‘靈武長棗’采后病原真菌的分離與鑒定*

任苗苗，閆思遠(yuǎn)，李嘉泓，杜 娟，馬 玲，顧沛雯

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

‘靈武長棗’（Ziziphus jujubecv.Lingwu）為鼠李科棗屬植物，是寧夏回族自治區(qū)最具特色的地方棗品種。2006年被國家農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為國家地理標(biāo)志產(chǎn)品[1]，2019年入選中國農(nóng)業(yè)品牌目錄產(chǎn)品[2]。近年來，隨著寧夏種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，‘靈武長棗’產(chǎn)業(yè)規(guī)模迅速發(fā)展壯大，已取得良好的經(jīng)濟(jì)效益[3]。然而，由于‘靈武長棗’以鮮食為主，皮薄、多汁，鮮銷期短，采后貯運不當(dāng)，腐敗現(xiàn)象嚴(yán)重。其中，由真菌侵染引起的果實腐爛可占采后損失的30%～40%[1]，嚴(yán)重制約了寧夏‘靈武長棗’產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

病原真菌侵染是導(dǎo)致棗采后腐爛的重要因素，但不同地區(qū)、品種的棗采后病原真菌的種類有所不同。劉春琴等[4]報道河北地區(qū)‘金絲小棗’采后腐爛的主要病原真菌有性階段是囊孢殼菌（Physalospora obtuse）、無性世代為梭殼孢菌（Fusicoccumsp.）；孫蕾等[5]從山東地區(qū)‘冬棗’腐爛組織中主要分離出根菌索菌（RhizomorphaRoth.ex Fr.）和交鏈孢霉屬（Alternariasp.）2種病原真菌；雷春軍等[6]發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致新疆阿克蘇地區(qū)‘駿棗’采后腐爛的優(yōu)勢病原真菌為交鏈格孢（A.alternata）、細(xì)極鏈格孢（A.tenuissima）和根霉菌（Rhizopus stolonifer）。但是目前國內(nèi)對寧夏地區(qū)‘靈武長棗’采后病原真菌的研究報道相對較少，2007年甘瑾等[7]采用形態(tài)學(xué)的方法鑒定‘靈武長棗’采后病原真菌為微孢毛霉（Mucor microsporus）、粉紅聚端孢（Trichoderma roseum）、交鏈格孢（A.alternata）和青霉屬（Penicilliumsp.）；2012年，任玉鋒等[8]證實皮落青霉（Penicillium crustosum）也是導(dǎo)致‘靈武長棗’采后腐爛的病原真菌。

本研究以寧夏地區(qū)‘靈武長棗’為研究對象，通過形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，對‘靈武長棗’采后病原真菌進(jìn)行了分離鑒定，明確了寧夏地區(qū)‘靈武長棗’采后病原真菌類型，以期為寧夏地區(qū)‘靈武長棗’的采后保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年9—11月，從寧夏銀川市和靈武市采摘大小均勻、無病蟲害和機(jī)械損傷的‘靈武長棗’，樣品共90份。當(dāng)天用牛皮紙包好帶回實驗室，自然條件（25 ℃）下貯藏，待出現(xiàn)典型腐爛癥狀后進(jìn)行病原真菌的分離鑒定。

1.2 主要儀器、試劑和培養(yǎng)基

正置熒光顯微鏡（Olympus BX53，日本），梯度PCR儀（Bio-Rad T100，美國），電泳儀（DYY-C6，北京），凝膠成像系統(tǒng)（Azure c200，美國），霉菌培養(yǎng)箱（MJX-100B-Z，上海），潔凈工作臺（SW-CJ-1F，蘇州）。

真菌DNA提取試劑盒（BioFlux，美國），DL2000 DNA Marker、2×EasyTaq PCR Super Mix、RNaseA和GelStain染液（TIANGEN，北京），50×TAE緩沖液、RNase-Free Water（Solarbio，北京）。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基（陸橋，北京）。

1.3 病原真菌的分離和純化

病原真菌分離采用組織分離法[9]。在‘靈武長棗’病果中病健交界處切取大約5 mm×5 mm×5 mm大小的組織塊，置于75%（v/v）的酒精中30 s，消除表面起泡，迅速將組織塊用無菌濾紙吸取表面酒精，移入5%（m/v）的次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，再用無菌水清洗3次后，用滅菌濾紙吸干組織塊表面水分，用無菌刀切除組織塊表面部分，取大約2 mm×2 mm×2 mm植入PDA培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗培養(yǎng)。當(dāng)菌落直徑生長至1 cm時，用無菌接種針挑取不同菌絲尖端分別植入新的PDA培養(yǎng)基平皿內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)上述操作2～3次，分出單一菌落即可作為純化菌種移入試管，純化菌種4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原真菌的致病性檢測

采用陽秀蓮等[10]菌懸液有傷接種方法進(jìn)行致病性檢測，略作修改。病原真菌菌懸液的配制：將分離純化的病原真菌接種至PDA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d，進(jìn)行菌種活化。加入2 mL無菌水沖洗PDA培養(yǎng)平板，收集菌絲和孢子混液，用雙層無菌紗布過濾混液，得到病原真菌菌懸液。用血球板計數(shù)，將病原真菌菌懸液稀釋至1×105cfu/mL，接種備用。有傷接種：取健康‘靈武長棗’果實，用無菌水沖洗數(shù)次后，用5%（m/v）次氯酸鈉溶液消毒3 min，無菌水沖洗3次，無菌吸水紙吸干水分。用無菌接種針輕輕刺傷果皮制造傷口（傷口集中），取制備好的菌懸液20 μL滴加到刺傷部位。將接種后的‘靈武長棗’果實放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，置于智能人工氣候箱25 ℃、相對濕度90%條件下培養(yǎng)7 d。每處理重復(fù)3次，設(shè)無菌水為對照。記錄發(fā)病情況，通過致病性確認(rèn)后的病原真菌進(jìn)行再次分離，并與最初接種的病原真菌進(jìn)行比較。

1.5 病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將具有致病性的病原真菌接種于PDA平板上，置于25 ℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～10 d，觀察記錄菌落特征（菌落形狀、顏色和質(zhì)地等），待其產(chǎn)孢后，挑取少量菌絲進(jìn)行鏡檢和拍照（分生孢子梗和分生孢子形態(tài)）。參考《真菌鑒定手冊》[11]和《中國真菌志》[12]，鑒定病原真菌種類。

1.6 病原真菌的分子生物學(xué)鑒定

1.6.1病原真菌DNA的提取

將純化后的病原真菌在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)4～10 d后，用無菌的載玻片輕輕在PDA培養(yǎng)基表面上刮取適量新鮮菌絲約0.05 g進(jìn)行DNA的提取，其方法參照Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒說明。

1.6.2病原真菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增

以純化后的病原真菌總DNA為模板，利用真菌rDNA-ITS通用引物序列ITS1/ITS4 （5′-TCCGT AGGTGAACCTGCGC-3′）/（5′-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3′）進(jìn)行擴(kuò)增和測序。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：2×PCR buffer 12.5 μL，10 μmol/L引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，51 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，34個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳中檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后送至北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.6.3病原真菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將病原真菌菌株測序所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，篩選與病原真菌ITS序列同源性高的菌株序列，利用DNAMAN 6.0.3.48軟件中鄰接法（Neighbor-Joining methods，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定病原真菌菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘靈武長棗’貯藏期病害癥狀及病原真菌的分離結(jié)果

‘靈武長棗’貯藏期間表現(xiàn)出的病害癥狀主要有5種：①病果初期果面形成邊緣明顯、略凹陷的黑色斑點，隨著侵染斑逐漸擴(kuò)大，病斑上長出墨綠色或黑褐色霉?fàn)钗?，后期形成較大的腐爛區(qū)（圖版2a-B）。②感病初期果面出現(xiàn)水漬狀的斑點，果面輕微凹陷，后期病斑下果肉迅速軟化腐爛，但無水漬溢出，且果實表皮無破損，不產(chǎn)生霉層（圖版2a-C）。③果實發(fā)病部位初期形成暗褐色斑點，果實輕微凹陷，后期病斑擴(kuò)展，長出白色霉層（圖版2a-D）。④初期果面上出現(xiàn)不規(guī)則水漬斑，中后期病斑擴(kuò)展迅速，果面密被灰褐色團(tuán)粒狀柔軟霉層，嚴(yán)重時可導(dǎo)致整個果實腐爛（圖版2a-E）。⑤初期果面上發(fā)病部位長有白色菌絲，后期蔓延呈白色棉絮狀，其上密生黑色小顆粒，病果迅速軟化散發(fā)出酒糟味（圖版2a-F）。

對自然條件下貯藏的‘靈武長棗’腐爛組織進(jìn)行分離純化，共得到75株真菌菌株。根據(jù)其培養(yǎng)形狀及菌落特征初步劃分為9種類型。如表1所示，Ⅰ類真菌分離最多（31株），所占比率為分離菌株總數(shù)的41.3%；其次是Ⅵ類（11株）和Ⅸ類（8株）真菌，分別占總分離菌株的14.7%和10.7%。

表1 從‘靈武長棗’腐爛果實中分離的真菌菌株

2.2 病原真菌的致病性檢測

將從‘靈武長棗’腐爛組織中分離的9類純化代表菌株（LW1～LW9）依照柯赫氏法則重新接種于健康‘靈武長棗’，從致病的‘靈武長棗’果實腐爛組織再次分離病原真菌，在PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后，與最初的接種菌進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，菌株LW1、LW4、LW5、LW6和LW9均會引起‘靈武長棗’果實腐爛，與自然條件下引起的腐爛癥狀相似，再次分離得到的菌株與原接種的病原真菌菌落形態(tài)一致，而菌株LW2、LW3、LW7、LW8及對照接種后并未引起‘靈武長棗’果實腐爛，表明以LW1、LW4、LW5、LW6和LW9為代表的5類真菌是造成‘靈武長棗’果實腐爛的致病真菌。其中，LW1真菌菌絲附著處會造成果肉軟化、凹陷和變褐，病果表面出現(xiàn)黑色霉?fàn)钗锂a(chǎn)生大量分生孢子，致病較快且效果明顯（圖版2b-A）；LW4真菌侵染后造成病斑處果肉凹陷腐爛，后期病斑蔓延，果肉出現(xiàn)一定程度的水漬化（圖版2b-B）；LW5真菌致病中心呈紅褐色，其上著生白色菌絲，對‘靈武長棗’表皮的侵染性較強(qiáng)，造成果實凹陷（圖版2b-C）；LW6真菌接種后‘靈武長棗’表面出現(xiàn)水漬狀斑點，隨著病菌侵染，果皮呈灰白色，后期果面上形成厚厚的灰褐色霉層（圖版2b-D）；LW9真菌侵染后傷口處出現(xiàn)白色棉絮狀菌絲，在菌落覆蓋下方及菌落周圍的果實組織腐壞嚴(yán)重，致病性較強(qiáng)（圖版2b-E）。

2.3 病原真菌形態(tài)學(xué)鑒定

PDA培養(yǎng)基上生長的純化菌株LW1菌落近似圓形，中央墨綠色，邊緣白色，菌絲致密呈棉絮狀（圖版2b-F）；分生孢子梗直立、分隔；分生孢子呈倒棍棒形或橢圓形，單孢 9.82～13.85 μm×19.77～28.80 μm，具有1～5個橫膈膜，分隔處略有縊縮（圖版2b-K）。

LW4菌落生長較慢，邊緣不規(guī)則，初期污白色，后期顏色加深變黑，菌絲呈根狀，黏稠，不易挑取，（圖版2b-G）；分生孢子橢圓形，顯微鏡下呈單細(xì)胞個體，9.25～12.05 μm×10.97～14.38 μm（圖版2b-L）。

LW5菌落邊緣不整齊，初期呈白色絲絨狀，后變?yōu)楹稚梁诤稚s15 d后開始產(chǎn)生黑色菌核（圖版2b-H）；分生孢子呈球形或長橢圓形，無色，單細(xì)胞2.65～5.96 μm×7.86～11.30 μm（圖版2b-M）。

LW6菌落生長較快，初期呈灰白色，產(chǎn)孢后呈灰褐色，菌絲體繁茂，絨毛狀（圖版2b-I）；分生孢子梗叢生，頂端著生大量分生孢子，形似葡萄穗狀；分生孢子呈球形或卵圓形，無隔，單孢7.18～9.54 μm×13.01～14.56 μm，透明或呈淡褐色（圖版2b-N）。

LW9菌落無定形，氣生菌絲，菌絲最初為白色棉絮狀，后期頂端產(chǎn)生黑色小顆粒（圖版2b-J）；菌絲發(fā)達(dá)、有分枝和假根；孢子囊球形或近球形，深褐色，孢囊孢子呈球形或近似球形，大小不等（圖版2b-O）。

依據(jù)病原菌培養(yǎng)形態(tài)特征及鏡檢觀察結(jié)果，參考《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》，初步鑒定結(jié)果為：菌株LW1為鏈格孢屬（Alternaria），LW4為短梗霉屬（Aureobasidium），LW5為派倫霉屬（Peyronellaea），LW6為葡萄孢屬（Botrytis），LW9為根霉屬（Rhizopus）。

2.4 病原真菌的分子生物學(xué)鑒定

采用真菌rDNA-ITS序列通用引物（ITS1和ITS4）對菌株LW1、LW4、LW5、LW6和LW9進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。以5株病原真菌的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢驗，獲得578、579、549、625、554 bp的基因片段（圖1），將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與NCBI中相似性高的菌株rDNA-ITS基因序列進(jìn)行同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 2）。按rDNA-ITS基因序列相似性大于97%的菌株歸于同一個種的規(guī)則，菌株LW1（登錄號：MN073201）與鏈格孢屬的A.alternata（登錄號：MF167641）親緣關(guān)系最近，同源率為99%，鑒定為交鏈格孢（A.alternata）；菌株LW4（登錄號：MN075511）與短梗霉屬的Aureobasidium pullulans（登錄號：MK772062）親緣關(guān)系最近，同源率達(dá)100%，鑒定為出芽短梗霉（A.pullulans）；菌株LW5（登錄號：MN075513）與派倫霉屬的Peyronellaea glomerata（登錄號：KT192373）親緣關(guān)系最近，同源率為99%，鑒定為球派倫霉（P.glomerata）；菌株LW6（登錄號：MN077159）與葡萄孢屬的Botrytis cinerea（登錄號：MF467899）和Botrytis fabae（登錄號：KC213772）親緣關(guān)系最近，同源率為98%，結(jié)合菌株LW6形態(tài)學(xué)特征鑒定為灰葡萄孢（B.cinerea）；菌株LW9（登錄號：MN075516）與根霉菌屬的Rhizopus oryzae（登錄號：MH865593、MH854585和MH854584）親緣關(guān)系最近，同源率為99%，鑒定為米根霉（R.oryzae）。

圖1 病原真菌rDNA-ITS基因序列的PCR擴(kuò)增

圖2 病原真菌LW1、LW4、LW5、LW6和 LW9 rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

‘靈武長棗’屬于呼吸躍變型果實[13]，采后易失水皺縮、軟化、褐變和腐爛，低溫（15 ℃）環(huán)境下貨架期僅10～15 d[14]，保鮮期短成為‘靈武長棗’產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟需解決的重要難題。本研究從‘靈武長棗’腐爛組織中共分離出9類真菌菌株，通過致病性測定，確定有5類真菌可以引起‘靈武長棗’腐爛，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)分析，分別鑒定為交鏈格孢（A.alternata）、出芽短梗霉（A.pullulans）、灰葡萄孢（B.cinerea）、米根霉（R.oryzae）和球派倫霉（P.glomerata）。

高芬等[15]認(rèn)為山西‘贊皇大棗’黑腐病是由細(xì)極鏈格孢（A.tenuissima）引起的，何麗等[16]認(rèn)為新疆紅棗黑腐病是由交鏈格孢（A.alternata）引起的，甘瑾等[7]發(fā)現(xiàn)交鏈格孢（A.alternata）也可以導(dǎo)致‘靈武長棗’采后腐爛。本研究根據(jù)貯藏期‘靈武長棗’腐爛組織病原菌分離頻率（41.3%）及致病性檢驗，發(fā)現(xiàn)交鏈格孢（A.alternata）是引起‘靈武長棗’黑腐病的主要病原真菌，可導(dǎo)致棗果面凹陷，果皮黑腐，密生黑褐色霉層，果肉軟化、變褐等癥狀，造成果品腐爛變質(zhì)。棗貯藏期黑腐病病原不一致，可能是由于棗果產(chǎn)地、品種、貯藏條件及病樣采集時病害發(fā)展進(jìn)程不同，造成黑腐病病原種類存在一定的差異?；移咸焰撸˙.cinerea）和米根霉（R.oryzae）是常見的果蔬致腐微生物，寄主范圍廣泛，在有傷和無傷條件下均可侵入果實組織，導(dǎo)致葡萄[17]、紅棗[18]和番茄[19]等多種果蔬采后腐爛。李青云[20]研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢（B.cinerea）是引起北疆‘冬棗’采后腐爛的主要病原真菌；白劍宇等[18]對新疆紅棗軟腐病病原菌進(jìn)行鑒定，明確了致病真菌為米根霉（R.oryzae）。本研究得到了類似的結(jié)論，灰葡萄孢（B.cinerea）和米根霉（R.oryzae）也是導(dǎo)致‘靈武長棗’果實采后腐爛的重要致病真菌。

此外，本研究還首次發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉（A.pullulans）和球派倫霉（P.glomerata）是‘靈武長棗’采后病原真菌，通過有傷接種，‘靈武長棗’被2種病原真菌感染后，果面出現(xiàn)凹陷病斑或產(chǎn)生白色霉層，最終導(dǎo)致全果腐爛，可見這2種病原真菌具有較強(qiáng)的致病性。Nallathambi等[21]發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉（A.pullulans）是引起‘臺灣青棗’腐爛的主要病原菌，侵染后可導(dǎo)致棗果面出現(xiàn)凹陷病斑并產(chǎn)生黑色霉層等癥狀；薩吉達(dá)木·艾則孜等[22]研究證明，新疆紅棗出現(xiàn)畸果癥狀和果面出現(xiàn)褐色斑點現(xiàn)象是由球派倫霉（P.glomerata）侵染引起的。出芽短梗霉（A.pullulans）和球派倫霉（P.glomerata）對不同棗的侵染癥狀存在較大的差異，這可能也與棗果產(chǎn)地、品種和貯藏條件等相關(guān)，但有關(guān)2種病原真菌的侵染致腐過程及致腐機(jī)理等方面還尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。

本研究明確了引起‘靈武長棗’采后腐爛變質(zhì)的主要病原真菌為交鏈格孢（A.alternata）、灰葡萄孢（B.cinerea）、米根霉（R.oryzae）、出芽短梗霉（A.pullulans）和球派倫霉（P.glomerata），這將為控制‘靈武長棗’采后腐爛和提出針對性的防腐貯藏手段提供借鑒和思路。已有研究發(fā)現(xiàn)，低溫、減壓和臭氧（-2 ℃、40.5 kPa和O3mg/m3）處理不僅能夠減緩‘冬棗’淀粉和抗壞血酸降解速度，還具有抑制交鏈格孢孢子繁殖和降低棗果腐爛的作用[23]。此外，通過對長棗噴施不同濃度隱球酵母（Cryptococcussp.）菌懸液，能夠誘導(dǎo)長棗抗病性，大大降低了由根霉菌引起的爛果率[24]?！瑮棥珊螅枚∠憔秃投∠憔?殼聚糖復(fù)合物處理棗果，可以降低‘冬棗’貯藏期灰霉病感染率[25]。因此，結(jié)合現(xiàn)有的廣譜殺菌措施，針對‘靈武長棗’采后病原真菌篩選有效的選擇性殺菌劑，可以為預(yù)防‘靈武長棗’采后致腐病害和延長貨架期提供技術(shù)支撐。