3種藜麥皂苷的超聲提取及抗氧化活性比較

傅 鈺 張 禾 符 群,2

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院1，哈爾濱 150040) (黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室2，哈爾濱 150040)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)是藜科藜屬植物，具有一定的耐旱、耐寒、耐鹽性，根據(jù)其種皮的顏色不同可分為白、紅、黑3種。藜麥中富含多種氨基酸、維生素、多酚類[1，2]、黃酮類、皂苷和植物甾醇類物質(zhì)，其所含脂肪中不飽和脂肪酸占83%[3]，具有多種健康功效，可以抗腫瘤[4，5]、抑菌、抗病毒[6，7]、抗氧化等[8，9]。藜麥在1980年被美國宇航局用于宇航員的太空食品。聯(lián)合國糧農(nóng)組織認(rèn)為藜麥?zhǔn)俏ㄒ灰环N單體植物且可滿足人體基本營養(yǎng)需求，正式推薦藜麥為最適宜人類的全營養(yǎng)食品，因此藜麥也被國際營養(yǎng)學(xué)家稱為“未來食品”“超級谷物”[10]。皂苷又稱為皂角苷，研究發(fā)現(xiàn)皂苷具有多種生理功效，如抑菌、降低膽固醇水平等，多種中藥的有效成分都為皂苷。藜麥麩皮中含有大量皂苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)20%～30%[7]。藜麥皂苷水溶后會產(chǎn)生苦澀味，過高劑量服用會產(chǎn)生毒性，但由于其優(yōu)良特性，近年來成為醫(yī)學(xué)、食品等行業(yè)的熱點研究對象[11]。

目前，活性成分的提取方法以有機溶劑浸提為主，微波、超聲波等技術(shù)作為輔助提取。由于植物活性物質(zhì)具有多元酚羥基和一定的極性，因此在藜麥皂苷的提取中常選用水或乙醇、甲醇、丙酮等有機溶液作為提取劑，這一類溶劑具有較好的溶解性能，并且對植物細(xì)胞具有一定的穿透能力，可以促進(jìn)物質(zhì)的分離。有機溶劑萃取法成本低廉，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單，但提取效率往往比較低[12]。超聲波輔助提取是利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)，使原料的微小顆粒發(fā)生收縮和崩裂，從而釋放出活性成分[13]。已有研究對不同顏色的藜麥之間的對比較少，且藜麥制品的原料選擇也鮮有關(guān)注。趙丹青等[14]對不同品種藜麥的主要營養(yǎng)成分和礦物元素含量進(jìn)行分析，得到在不同顏色藜麥中，黑色藜麥中各類氨基酸含量均高于其他顏色的藜麥。因此本實驗通過超聲波輔助乙醇提取法[15]，在單因素實驗的基礎(chǔ)上, 運用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計實驗對藜麥中的皂苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化, 確定最佳提取條件，并對3種藜麥中提取的皂苷進(jìn)行抗氧化劑效實驗, 為提取和評價藜麥中活性成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑、紅、白藜麥：2018年采集自青海省西寧市多巴鎮(zhèn)。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(≥98%)，2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)銨鹽，齊墩果酸(≥98%)；冰乙酸、無水乙醇、香草醛、鐵氰化鉀、三氯化鐵、過硫酸鉀等均為分析純。

T6紫外可見分光光度計，KQ-300DE數(shù)控超聲清洗器，EPOCH2全波長酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 原料處理

3種藜麥挑選去雜，低溫干燥至水分恒定，破碎為60目粉末，冷藏備用。以黑色藜麥為例，研究藜麥皂苷的提取工藝。

1.2.2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與皂苷含量測定

準(zhǔn)確稱量25 mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇配制成1 mg/mL的母液。分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL母液于7個10 mL試管中，置于70 ℃水浴揮干溶劑。再加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，在60 ℃水浴下反應(yīng)15 min，取出后用冷水冷卻，加入5.00 mL冰醋酸并在暗處反應(yīng)15 min。以無標(biāo)準(zhǔn)品的空白樣為對照，在550 nm處測定吸光值，以齊墩果酸質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，吸光值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。得到線性回歸方程：Y=1.516 67X+0.016 67，R2=0.999 7。

對提取液按照該方法測定皂苷含量，將測得的吸光度值代入回歸方程中得到皂苷濃度，并按照式(1)計算提取液中皂苷提取量。

(1)

式中：c為提取液中皂苷的濃度/mg/mL；V為提取液定容體積/mL；M為藜麥粉質(zhì)量/g。

1.2.3 超聲波輔助乙醇提取藜麥皂苷的工藝研究

準(zhǔn)確稱取1.000 g黑藜麥粉，以黑色藜麥中皂苷提取量為評價指標(biāo)進(jìn)行單因素實驗，在300 W超聲功率下，分別考察液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g)，提取時間(20、30、40、50、60 min)，提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%、100%)對皂苷提取量的影響。

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采取Box-Behnken實驗設(shè)計方法，利用Design-Expert設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面工藝優(yōu)化實驗，對超聲波輔助提取藜麥中皂苷的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 藜麥提取物的抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH·自由基清除率測定

在96孔板中依次加入不同濃度梯度的樣液100 μL和0.2 mol/L DPPH·溶液100 μL，充分混勻，避光反應(yīng)30 min后于517 nm波長下測定吸光值A(chǔ)i。用100 μL無水乙醇代替DPPH·溶液，測定吸光度值A(chǔ)j。用100 μL無水乙醇代替不同濃度梯度的皂苷提取液，測定吸光度值A(chǔ)0。根據(jù)式(2)計算活性物質(zhì)對DPPH·清除率[17]。

(2)

式中：Ai為樣品液的吸光度值；Aj為樣品空白管的吸光度值；A0為空白對照管的吸光度值。

1.2.4.2 ABTS+·自由基清除率測定

將7.4 mmol/LABTS+·溶液與2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合，室溫避光靜置12～16 h，用乙醇稀釋至在734 nm處吸光度值為0.7±0.02，備用。在96孔板中依次加入25 μL不同濃度梯度的皂苷提取液，200 μL ABTS+·溶液，避光靜置6 min，在734 nm處測吸光度值，得到A1。用25 μL乙醇代替樣液，測定吸光度值，得到A0。用200 μL乙醇代替ABTS+·溶液，測定吸光度值，得到A2。根據(jù)式(3)計算活性物質(zhì)對ABTS+·清除率[17]。

(3)

式中：A0為空白對照吸光度值；A1為樣液吸光度值；A2為樣液空白管吸光度值。

1.2.4.3 總還原力的測定

取不同濃度梯度的皂苷溶液0.1 mL于試管中，并加入1.00 mL抗壞血酸、2.5 mL磷酸鹽緩沖液和鐵氰化鉀溶液，將試管置于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，取出后迅速冷卻至室溫，再加入2.5 mL三氯乙酸。將混合溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4 000 r/min的條件下離心10 min。取上清液2.5 mL于試管中，加入2.5 mL蒸餾水和1.00 mL三氯化鐵，混合均勻后，在700 nm下測量溶液的吸光值，以無水乙醇調(diào)零[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取單因素實驗結(jié)果及分析

由圖1可見，隨著液料比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，皂苷提取量總體呈先上升后下降的趨勢，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)對皂苷提取量的影響最為顯著。這可能是由于隨著液料比和提取時間的增加，固體原料與溶液的接觸面積增加且反應(yīng)時間加長，使皂苷更充分地溶解于乙醇溶液中，但當(dāng)液料比增大到一定比例后，其對接觸面積的影響將不再明顯，且時間繼續(xù)增加可能會融入其他的雜質(zhì)干擾了皂苷的溶出，并且破壞皂苷成分，從而使皂苷的提取量下降；提取溫度升高會使分子的擴(kuò)散速度快，皂苷分子溶解在乙醇溶液中的能力變強，當(dāng)溫度過高時，可能會引起溶劑的揮發(fā)過大，并且伴隨著較多雜質(zhì)物質(zhì)的溶出，從而導(dǎo)致皂苷提取量的下降；而體積分?jǐn)?shù)的增加，乙醇提取液的極性與被提取溶質(zhì)的極性逐漸接近，根據(jù)相似相溶的原理，更多的皂苷溶解在乙醇提取液中，但當(dāng)體積分?jǐn)?shù)增大到100%時被提取溶質(zhì)的極性會小于提取液的極性，且其他雜質(zhì)的溶出量會增加，從而導(dǎo)致了藜麥皂苷提取量的減小。

圖1 不同單因素對皂苷提取量的影響

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果與方差分析

根據(jù)單因素的實驗結(jié)果，以黑色藜麥中皂苷提取量為響應(yīng)值，以提取時間、提取溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析實驗，經(jīng) Design-Expert 8.0.6 trial 設(shè)計的實驗方案及結(jié)果如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計實驗結(jié)果

表2 方差分析表

2.2.2 響應(yīng)曲面與等高線分析

藜麥皂苷提取量的影響因素及其交互作用的顯著性如圖2～圖7所示。通過等高線的形狀分析交互影響的顯著程，響應(yīng)面上標(biāo)記的最高點即為最大值，說明在所選分析的因素水平范圍內(nèi)存在極值[19]。由圖2～圖7可知，提取時間、提取溫度、液料比和體積分?jǐn)?shù)對皂苷提取量均有顯著影響。圖2表明當(dāng)溫度一定時，隨著提取時間的增加，皂苷的提取量增大，當(dāng)提取時間達(dá)到50 min時提取量最高，繼續(xù)增加提取時間其提取量會發(fā)生下降；當(dāng)提取時間一定時，提取溫度有相同的趨勢，但影響較?。浑S著提取溫度的增大，皂苷的提取量先增大后減小。圖3和圖4表示隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，藜麥皂苷的提取量先增大后減小，在90%時取得最大值；液料比和提取時間對提取量均有相同的影響趨勢，但效果小于體積分?jǐn)?shù)。圖5表明當(dāng)液料比一定時，提取溫度增大會使皂苷的提取量先增大后減小，在60 ℃時達(dá)到最大值；溫度一定時，液料比對提取量有相同的影響趨勢。圖6表明體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的增大都會使皂苷提取量先增大后減小，分別在90%和60 ℃時取得最高點。圖7表明體積分?jǐn)?shù)和液料比對皂苷的提取量影響效果相同，提取量隨著體積分?jǐn)?shù)和液料比的增大而先升高后下降，在90%和50∶1 mL/g時達(dá)最大值。

圖2 提取時間及提取溫度對皂苷提取量的等高線及響應(yīng)面

圖3 提取時間及液料比對皂苷提取量的等高線及響應(yīng)面

圖4 提取時間及乙醇體積分?jǐn)?shù)對皂苷提取量的等高線及響應(yīng)面

圖5 提取溫度及液料比對皂苷提取量的等高線及響應(yīng)面

圖6 提取溫度及乙醇體積分?jǐn)?shù)對皂苷提取量的等高線及響應(yīng)面

圖7 液料比及乙醇體積分?jǐn)?shù)對皂苷提取量的等高線及響應(yīng)面

2.2.3 最佳條件確定和回歸模型驗證實驗結(jié)果

通過響應(yīng)面分析得到超聲波輔助乙醇提取藜麥中皂苷的最佳工藝條件為：提取時間51.29 min，提取溫度59.74 ℃，液料比50.02∶1 mL/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)90.57%，在此條件下皂苷提取量為12.717 5 mg/g。為使實際操作中更便于控制，調(diào)整最佳工藝為：提取時間50 min，提取溫度60 ℃，液料比50∶1 mL/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%。在此條件下進(jìn)行最優(yōu)工藝的驗證，計算出皂苷提取量為12.65 mg/g，實際得率與模型預(yù)測值的誤差為0.5%，證明模型理論預(yù)測值與實際值擬合效果良好。

采用相同方法對白色、紅色藜麥皂苷提取工藝進(jìn)行研究，因素優(yōu)化后的水平結(jié)果與黑色藜麥無顯著差異。

2.2.4 3種不同顏色的藜麥的抗氧化能力評價

2.2.4.1 DPPH·自由基清除能力

黑、白、紅3種顏色藜麥中的皂苷對DPPH· 的清除能力如圖8。隨著3種藜麥皂苷濃度增加，其清除DPPH·自由基的能力均呈現(xiàn)顯著增加趨勢，當(dāng)濃度達(dá)到10 mg/g時，3種藜麥的清除能力集中在較小的范圍內(nèi)；當(dāng)濃度較低時，3種不同品種的藜麥在其相同皂苷濃度條件下對DPPH·自由基的清除能力差異較大。黑色、紅色、白色藜麥皂苷的IC50分別為2.205、3.724、4.303 mg/g。總體趨勢表現(xiàn)為黑色藜麥>紅色藜麥>白色藜麥，即隨著其種皮顏色的由深至淺，抗氧化能力逐漸減弱。這可能是由于不同顏色的藜麥中含有的有效抗氧化皂苷量差異較大，其中深色藜麥含有較多且活性高，導(dǎo)致抗氧化能力更強。

圖8 不同藜麥皂苷對DPPH·自由基清除的影響

2.2.4.2 ABTS+·自由基清除能力

黑、白、紅3種顏色藜麥中的皂苷對ABTS+·清除能力結(jié)果如圖9。隨著皂苷濃度的增加，藜麥皂苷對ABTS+·自由基的清除能力也在逐漸增強。當(dāng)皂苷濃度達(dá)到10 mg/g時，黑、紅、白三色藜麥皂苷清除率差異顯著(P<0.05)，說明不同品種的藜麥中皂苷種類可能有所不同，因此在清除ABTS+·自由基時表現(xiàn)出了不同的能力大小。在皂苷濃度較低時，紅色和白色藜麥清除能力相近，仍顯著小于黑色藜麥。3個品種的藜麥對ABTS+·自由基的清除能力大小為：黑色藜麥>紅色藜麥>白色藜麥。

圖9 不同藜麥皂苷對ABTS+·自由基清除的影響

2.2.4.3 總還原力

黑、白、紅3種顏色藜麥中的皂苷總還原能力對比結(jié)果見圖10?？傔€原力的強弱與吸光值的大小成正比。由圖10可知，3個不同品種藜麥皂苷的總還原力隨著皂苷濃度的增大而逐漸增強，其中黑色藜麥的還原能力極顯著大于紅色藜麥和白色藜麥(P<0.01)，而白色藜麥略大于紅色藜麥。已有研究證明，皂苷類化合物的抗氧化活性與皂苷元配基的結(jié)構(gòu)和糖殘基的數(shù)量有關(guān)[20]，因此可能是由于黑色藜麥與其他兩色的糖基不同導(dǎo)致活性差異顯著。

圖10 不同藜麥皂苷總還原能力對比

3 結(jié)論

采用超聲波輔助乙醇提取藜麥中皂苷化合物，單因素實驗結(jié)果表明，4個因素對皂苷的提取量影響趨勢相似，即先增大后減小。通過響應(yīng)面優(yōu)化出最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液料比為50∶1 mL/g，超聲功率300 W，提取溫度60 ℃，提取時間50 min，此時皂苷的提取量為12.65 mg/g，結(jié)合響應(yīng)面實驗可得出4個因素對提取量的影響顯著程度為：提取時間>體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>液料比。

對比了黑、紅、白3種藜麥皂苷的抗氧化能力強弱，結(jié)果表明，在對DPPH·、ABTS+·自由基的清除能力方面表現(xiàn)為：黑色藜麥>紅色藜麥>白色藜麥；在總還原能力方面表現(xiàn)為：黑色藜麥>白色藜麥>紅色藜麥。藜麥皂苷具有良好的抗氧化能力，且由于品種的不同其抗氧化能力也有所差異，整體上表現(xiàn)為深色藜麥皂苷活性優(yōu)于淺色藜麥皂苷，其中黑色藜麥的抗氧化能力最強。本研究體現(xiàn)出顯著的皂苷與抗氧化活性間劑量-效應(yīng)關(guān)系。藜麥提取物為混合物，今后研究可對提取物的成分進(jìn)行鑒定，以充分確證和評價藜麥皂苷活性。

不同顏色的藜麥之間存在一定程度的品質(zhì)差異，在口感方面，淺色藜麥優(yōu)于深色藜麥；但在抗氧化能力方面，黑色藜麥的抗氧化能力顯著高于紅色和白色藜麥。因此，在食品加工生產(chǎn)中可根據(jù)不同產(chǎn)品需求選擇不同顏色的藜麥原料。