miR-203a-3p抗彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的作用及機(jī)制研究

趙 婷， 劉安生， 王 華

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是一種非霍奇金淋巴瘤，也是一種具有高度侵襲性的淋巴系統(tǒng)彌漫性惡性增生性疾病，存在生發(fā)中心B細(xì)胞樣和活化B細(xì)胞樣兩個主要分子亞型[1-4]?，F(xiàn)階段治療DLBCL多采用利妥昔單抗聯(lián)合化療，雖然可以有效治療大多數(shù)患者，但仍有約1/3的患者存在難治愈和復(fù)發(fā)的情況[5-6]。因此，有必要進(jìn)一步了解DLBCL發(fā)生的分子機(jī)制，確定新分子靶點和治療策略，提高DLBCL患者的預(yù)后率。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一組長度為18～23個核苷酸的非編碼RNA[7]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA作為腫瘤的抑制劑或者癌基因參與人類多種不同類型的疾病[8]。有研究報道，miRNA可通過與mRNA 3′-UTR堿基互補(bǔ)配對來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，因此miRNA的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[9-10]。miR-203a-3p在很多腫瘤中已被研究，如在鼻咽癌中，通過抑制LASP1蛋白的表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和代謝[11]，在胃癌中下調(diào)胰島素樣生長受體-1(insulin like growth factors receptor 1, IGF-1R)抑制腫瘤的增殖[12]。然而，在DLBCL細(xì)胞中，miR-203a-3p的生物學(xué)作用和機(jī)制尚不清楚。FOXP1是FOXP家族成員之一[8]，參與機(jī)體的多種生理過程，且過表達(dá)于多種腫瘤組織中，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-15]。本研究擬檢測miR-203a-3p和FOXP1在DLBCL組織中的表達(dá)水平，同時探究二者對DLBCL細(xì)胞增殖和侵襲的作用，揭示miR-203a-3p和FOXP1在DLBCL發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為DLBCL患者的預(yù)后提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織 收集30例DLBCL組織，均經(jīng)病理證實(根據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織的分類)，患者均未接受過相關(guān)治療。另取20例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生(reactive hyperplasia of lymphnode, RH)組織作為對照。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.1.2細(xì)胞 人DLBCL細(xì)胞株SU-DHL-4和HBL-1(編號：BNCC 340176和BNCC 341660，上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，用含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)溫度為37 ℃，二氧化碳的體積分?jǐn)?shù)為5%。

1.1.3試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液(批號：R8758，美國Sigma公司)；胎牛血清(南美特級，批號：40130ES76，美國Hyclone公司)；miR-203a-3p模擬物(miR-203a-3p mimic)及其相應(yīng)的對照物(NC-mimic)(廣州日博生物有限公司)；FOXP1小干擾RNA(si-FOXP1)及其對照物(Scramble)(美國Santa公司)；熒光素酶報告基因質(zhì)粒(美國Promega公司)；FOXP1過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-FOXP1)(美國Addgene公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(批號：C0029，碧云天生物技術(shù)有限公司)；Wnt1(貨號：ab105740)、β-catenin(貨號：ab6302)、Cyclin D1(貨號：ab134175)及c-Myc(貨號：ab32072)(艾博抗生物科技有限公司)；山羊抗兔二抗(貨號：31402，美國賽默飛科技公司)。

1.1.4儀器 Esco CelSafe CO2培養(yǎng)箱(藝思高生物科技有限公司)；奧林巴斯倒置顯微鏡(CKX53，明美光電技術(shù)有限公司)；SpectraMax iD5多功能微孔板讀板(Molecular Devices公司)；流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，美國BD公司)；實時熒光定量PCR儀(美國ABI StepOne公司)；SDS-PAGE凝膠電泳儀(JX196552JY-JX5，邢臺潤聯(lián)科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將SU-DHL-4和HBL-1細(xì)胞接種到24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。3 μL的Lipofectamine RNAiMAX試劑和1 μL miRNA或siRNA分別稀釋到50 μL無血清的培養(yǎng)液中，混合5 min后，將稀釋好的Lipofectamine RNAiMAX試劑加入稀釋好的miRNA或siRNA中孵育10 min，再加入培養(yǎng)板中孵育24 h。將2.5 μg的pcDNA-FOXP1與空載質(zhì)粒(Vector)分別與5 μL Lipofectamine RNAiMAX共同混合在125 μL的無血清培養(yǎng)液中，與細(xì)胞共孵育。

1.2.2RNA提取和實時定量PCR 組織和細(xì)胞總RNA的提取使用TRIzol試劑，按照說明書的要求操作。檢測miRNA采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)，使用TaqMan微小RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃ 30 min→42 ℃ 30 min→85 ℃ 5 min。U6為miRNA的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。mRNA檢測采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，cDNA擴(kuò)增采用PrimeScript RT Master Mix，反轉(zhuǎn)錄條件：95 ℃ 10 min，40個循環(huán)，95 ℃ 15 s→60 ℃ 60 s。GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計算miR-203a-3p和FOXP1的表達(dá)。引物如下：

miR-203a-3p：

正向：5′-GGCGGGCTGAAATGTTTAGGA-3′

反向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′

FOXP1：

正向：5′-TCAGTGGTAAC CCTTCCCTTA-3′

反向：5′-GTACAGGATGCACGGCTTG-3′

1.2.3細(xì)胞增殖 采用CCK-8試劑評估細(xì)胞增殖。收集對數(shù)期的細(xì)胞接種在96孔板中，并調(diào)整細(xì)胞密度為每孔3×104個，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)24，48和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵化2 h后，用微型平板分析儀測定光密度值(OD值)。

1.2.4細(xì)胞侵襲 細(xì)胞以每孔3×104個接種到24孔板小室，下層添加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。孵育24 h后，仔細(xì)去除未遷移的細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定后，用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的結(jié)晶紫染色15 min。在顯微鏡下計算5個視野的細(xì)胞侵襲數(shù)并計算平均值。

1.2.5細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞消化處理后收集到對應(yīng)的EP管中，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，將5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶在黑暗中加入裝有樣品的EP管中，室溫下孵育20 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6熒光素酶報告基因分析 使用microrna.org數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-203a-3p和FOXP1之間的靶向關(guān)系。構(gòu)建野生型FOXP1質(zhì)粒(WT-FOXP1)和突變型FOXP1質(zhì)粒(Mut-FOXP1)熒光素酶報告載體，采用脂質(zhì)體3 000分別將WT-FOXP1和Mut-FOXP1與miR-203a-3p mimic和NC-mimic共轉(zhuǎn)染，24 h后使用雙熒光素酶測定系統(tǒng)測定熒光素酶活性。

1.2.7免疫印跡 收集細(xì)胞并用RIPA裂解液提取總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。上樣后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜后一抗孵育4 ℃過夜，加二抗室溫孵育2 h，ECL試劑檢測蛋白。

2 結(jié) 果

2.1miR-203a-3p在DLBCL組織中的表達(dá)水平 與RH組織比較，DLBCL組織中miR-203a-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01，圖1A)。在SU-DHL-4和HBL-1細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)染NC-mimic比較，轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic可顯著增加兩種細(xì)胞株中miR-203a-3p的表達(dá)水平，差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1B)。

2.2過表達(dá)miR-203a-3p對DLBCL細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡的影響 與NC-mimic組比較，過表達(dá)miR-203a-3p能夠明顯抑制SU-DHL-4和HBL-1細(xì)胞的增殖(P<0.01，圖2A和2B)；Transwell實驗結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞株的相對侵襲細(xì)胞數(shù)在轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic后明顯降低(P<0.01，圖2C)。而凋亡實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-203a-3p可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.01，圖2D和2E)。

nRH=20； nDLBCL=30. A：qPCR檢測miR-203a-3p 在RH和DLBCL組織中的表達(dá)；B：轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic后，qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率. 與NC-mimic組比較，△△：P<0.01.圖1 miR-203a-3p在DLBCL組織中的表達(dá)水平Fig 1 The expression of miR-203a-3p in DLBCL tissues

2.3FOXP1與miR-203a-3p的關(guān)系研究 采用microrna.org數(shù)據(jù)庫預(yù)測到在FOXP1的3′-UTR區(qū)域存在與miR-203a-3p的結(jié)合位點(圖3A)。熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，WT-FOXP1質(zhì)粒和miR-203a-3p mimic共轉(zhuǎn)染后的熒光強(qiáng)度顯著低于WT-FOXP1質(zhì)粒和NC-mimic共轉(zhuǎn)染組(P<0.01，圖3B)，而Mut-FOXP1質(zhì)粒和miR-203a-3p mimic共轉(zhuǎn)染后的熒光強(qiáng)度與Mut-FOXP1質(zhì)粒和NC-mimic共轉(zhuǎn)染后無明顯區(qū)別。DLBCL患者組織中FOXP1的表達(dá)水平顯著高于RH組(P<0.01，圖3C和3D)，SU-DHL-4和HBL-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic后，顯著抑制FOXP1的表達(dá)(P<0.01，圖3E)。

2.4下調(diào)FOXP1的表達(dá)對DLBCL細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡的影響 在SU-DHL-4和HBL-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FOXP1小干擾RNA，F(xiàn)OXP1的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)(P<0.01，圖4A)。下調(diào)FOXP1后，細(xì)胞增殖能力明顯被抑制(P<0.01，圖4B和4C)，細(xì)胞侵襲能力也顯著下降(P<0.01，圖4D)，而細(xì)胞凋亡則明顯增加(P<0.01，圖4E和4F)。

nRH=20, nDLBCL=30. A：生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測miR-203a-3p與FOXP1的靶向位點及FOXP1的突變位點；B：熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測熒光素酶的活性；C,D：qPCR檢測RH和DLBCL患者組織中FOXP1的mRNA表達(dá)及Western-blot檢測組織中FOXP1的蛋白表達(dá)量；E：轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic后FOXP1的表達(dá)量. 與NC-mimic和FOXP1-WT組比較，△△：P<0.01；與NC-mimic組比較，##：P<0.01.圖3 FOXP1與miR-203a-3p的關(guān)系Fig 3 Relationship between FOXP1 and miR-203a-3p

A：qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率，Western-blot檢測FOXP1蛋白表達(dá)量；B，C：CCK-8實驗檢測轉(zhuǎn)染后SU-DHL-4 和HBL-1細(xì)胞的增殖能力；D：Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲能力；E：F圖對應(yīng)的統(tǒng)計分析結(jié)果；F：流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況. 與Scramble組比較，△△：P<0.01.圖4 下調(diào)FOXP1的表達(dá)對DLBCL細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡的影響Fig 4 Effects of FOXP1 silence on proliferation, invasion and apoptosis of DLBCL cells

2.5過表達(dá)FOXP1和miR-203a-3p對DLBCL細(xì)胞的增殖和侵襲的影響 單獨過表達(dá)FOXP1時，F(xiàn)OXP1的mRNA和蛋白水平均高于Vector組(P<0.01)，而同時過表達(dá)miR-203a-3p和FOXP1時，可逆轉(zhuǎn)單獨過表達(dá)FOXP1對FOXP1水平的增加作用(P<0.01，圖5A和5B)。細(xì)胞增殖實驗和Transwell實驗顯示，當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA-FOXP1或共轉(zhuǎn)染pcDNA-FOXP1和NC-mimic時，細(xì)胞的增殖和侵襲能力均增加，而共轉(zhuǎn)染pcDNA-FOXP1與miR-203a-3p mimic時，F(xiàn)OXP1對細(xì)胞增殖和侵襲的促進(jìn)作用得到逆轉(zhuǎn)(P<0.01，圖5B～5F)。凋亡實驗結(jié)果顯示，與Vector組比較，過表達(dá)FOXP1可顯著抑制細(xì)胞凋亡(P<0.05，圖5G和5H)；而共轉(zhuǎn)染pcDNA-FOXP1與miR-203a-3p mimic時，逆轉(zhuǎn)過表達(dá)FOXP1對細(xì)胞凋亡的抑制作用。

2.6miR-203a-3p和FOXP1對Wnt/β-catenin信號通路的影響 免疫蛋白印跡實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-203a-3p或下調(diào)FOXP1時，Wnt1,β-catenin,Cyclin D1和c-Myc的蛋白水平顯著降低(P<0.01)；共轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic和si-FOXP1時，可進(jìn)一步降低Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)(P<0.01)；而過表達(dá)FOXP1可顯著增加Wnt1,β-catenin,Cyclin D1和c-Myc的蛋白表達(dá)水平(P<0.01)；當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic和pcDNA-FOXP1時，Wnt1,β-catenin,Cyclin D1和c-Myc的表達(dá)水平得到逆轉(zhuǎn)(P<0.01，圖6)。

1：NC mimic+Scramble；2：NC mimic+Vector；3：miR-203a-3p mimic+Scramble；4：NC mimic+ si-FOXP1-1；5：NC mimic+pcDNA-FOXP1；6：miR-203a-3p mimic+si-FOXP1-1；7：miR-203a-3p mimic+pcDNA-FOXP1. A：Western-blot實驗檢測SU-DHL-4轉(zhuǎn)染后Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；B：Western-blot實驗檢測HBL-1轉(zhuǎn)染后Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；C，D分別是A，B對應(yīng)的統(tǒng)計分析結(jié)果. 與NC-mimic+Scramble組比較，△：P<0.05；與NC-mimic+Vector組比較，#：P<0.05；與miR-203a-3p+Scramble組比較，☆：P<0.05.圖6 miR-203a-3p和FOXP1對Wnt/β-catenin信號通路的影響Fig 6 Effects of miR-203a-3p and FOXP1 on Wnt/β-catenin signaling pathway

3 討 論

研究報道，miRNA在人類癌癥發(fā)展的過程中扮演著重要的角色，其在腫瘤中的生物學(xué)作用和機(jī)制也逐漸明確[16]。miRNA通過與靶基因的3′-UTR結(jié)合來調(diào)控與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因。miRNA的失調(diào)同樣參與DLBCL的發(fā)展過程，如耐潑尼松的DLBCL耐藥細(xì)胞中，miR-148b表達(dá)下調(diào)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對潑尼松的抗性[17]；下調(diào)miR-195的表達(dá)，可促進(jìn)DLBCL的發(fā)生和免疫逃逸[3]；高表達(dá)miR-27a通過抑制MET/PI3K/AKT通路促進(jìn)DLBCL細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制DLBCL的發(fā)展[18]。

以往研究表明，miR-203a-3p在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，包括肝癌、骨肉瘤及結(jié)直腸癌等，提示miR-203a-3p參與腫瘤的發(fā)展[19-21]。本研究以miR-203a-3p在DLBCL進(jìn)展中的作用為出發(fā)點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DLBCL組織中，miR-203a-3p的表達(dá)量較RH組織顯著降低，提示miR-203a-3p在DLBCL中也存在異常表達(dá)的現(xiàn)象。當(dāng)SU-DHL-4和HBL-1細(xì)胞過表達(dá)miR-203a-3p時，細(xì)胞增殖與侵襲受到抑制，且具有顯著性，表明miR-203a-3p在DLBCL中發(fā)揮抑癌作用。

FOXP1蛋白是多功能轉(zhuǎn)錄因子，從參與器官的發(fā)生到調(diào)節(jié)免疫功能代謝都發(fā)揮著重要的作用[22]。研究報道FOXP1在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，既有抑癌作用，也有作為癌基因的作用，這取決于細(xì)胞環(huán)境，如Sheng等報道FOXP1在肺癌的發(fā)生發(fā)展中通過促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡而起到保護(hù)作用[23]；相反，Wang等報道FOXP1能夠促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的進(jìn)展[24]；另有文獻(xiàn)報道FOXP1可增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌的致瘤性[25]，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，DLBCL組織中FOXP1的表達(dá)水平顯著升高，當(dāng)下調(diào)FOXP1時，可顯著抑制DLBCL細(xì)胞的增殖與侵襲，促進(jìn)凋亡，說明FOXP1在DLBCL中扮演著癌基因的作用。

通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測到FOXP1是miR-203a-3p的一個靶基因，當(dāng)細(xì)胞過表達(dá)miR-203a-3p時，F(xiàn)OXP1的表達(dá)受到抑制，說明miR-203a-3p可下調(diào)FOXP1的表達(dá)，而逆轉(zhuǎn)實驗同樣也說明miR-203a-3p可調(diào)節(jié)FOXP1的表達(dá)。文獻(xiàn)報道FOXP1可通過激活Wnt/β-catenin信號通路來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[27]，因此本研究也進(jìn)一步探討miR-203a-3p對FOXP1的調(diào)控是否與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。當(dāng)過表達(dá)miR-203a-3p或者下調(diào)FOXP1，Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)受到抑制，而當(dāng)高表達(dá)FOXP1時，Wnt/β-catenin信號通路處于激活狀態(tài)，相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著升高，以上結(jié)果均說明miR-203a-3p調(diào)控FOXP1表達(dá)參與DLBCL的發(fā)展是通過Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，miR-203a-3p在體外能夠抑制DLBCL細(xì)胞的增殖、侵襲，促進(jìn)凋亡，過表達(dá)miR-203a-3p能夠抑制FOXP1表達(dá)，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路的失活。這些結(jié)果均提示miR-203a-3p是DLBCL中一個重要的抑癌分子，可能成為DLBCL患者早期診斷或治療的潛在靶點。