“靜態(tài)保種”在中國地方豬種遺傳資源保護(hù)中的應(yīng)用進(jìn)展

張樹山,韓雪峻,姜紅菊,戴建軍,吳彩鳳,孫玲偉,張德福?

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室,上海201106;2上海祥欣畜禽有限公司∕上海種豬工程技術(shù)研究中心,上海201302)

1992 年聯(lián)合國環(huán)境與發(fā)展大會上通過了《生物多樣性公約》,首次提出了家畜遺傳資源保護(hù)在全世界范圍內(nèi)保障食品安全和滿足需求具有重要的意義,極大地推動了全球范圍內(nèi)家畜遺傳資源保護(hù)進(jìn)程。 目前,動物遺傳資源保存(即“保種”)主要有“動態(tài)保種”和“靜態(tài)保種”兩種方式。 “動態(tài)保種”[1]即傳統(tǒng)的活體保種,需要專門建立以群體為保種對象的保種場、保種基地,需要維持一定數(shù)量個體的保種群并制定合理的選種選配方案,維持成本較高且面臨著疾病、疫情和自然災(zāi)害等風(fēng)險。 “靜態(tài)保種”[2](即生物技術(shù)保種,對遺傳物質(zhì)進(jìn)行冷凍保存),一般指通過對保種群體部分或全部的配子(精子和卵母細(xì)胞)、胚胎、體細(xì)胞和DNA 等進(jìn)行冷凍保存( -196 ℃)建立動物“遺傳資源庫”(或“基因庫”),具有占地少、可完全不受外界疾病、疫情影響,但其應(yīng)用對相關(guān)技術(shù),如配子冷凍、輸精∕移植、體細(xì)胞克隆等要求較高。

我國地方豬遺傳資源豐富,但目前部分品種已滅絕或瀕臨滅絕,傳統(tǒng)的活體保種方式抵抗疫情、自然災(zāi)害等的能力十分有限,迫切需要“靜態(tài)保種”手段對我國現(xiàn)有地方豬種遺傳資源進(jìn)行有效的備份,從而提高其遺傳資源保護(hù)的可靠性。 近年來,尤其隨著豬精液冷凍保存、克隆等技術(shù)日益成熟,表明“靜態(tài)保種”已成為可部分替代傳統(tǒng)保種的切實可行的手段。

1 我國地方豬種遺傳資源保護(hù)現(xiàn)狀和緊迫性

我國地域遼闊,不同地區(qū)文化、民族風(fēng)俗和飲食喜愛等的多元化及復(fù)雜多樣的自然環(huán)境孕育出了約占世界豬種數(shù)1∕3 的豬品種,是大自然和先人留給我們的寶貴遺產(chǎn)。 然而自改革開放以來,我國育種者和生產(chǎn)者受高生長速率、高瘦肉率等指標(biāo)為主的需求導(dǎo)向影響,重引進(jìn)、輕本土品種理念占主導(dǎo)地位,地方品種的選育工作進(jìn)展緩慢[3]。 此外,近20 年來我國快速城市化、工業(yè)化對地方豬種活體保種空間的擠壓、對本土豬遺傳資源重視程度不夠及保種措施不當(dāng)?shù)纫蛩?造成我國大量地方豬種原有的優(yōu)良性狀逐漸退化,部分品種甚至絕種或已瀕臨絕種。 如河北省的定縣豬、江蘇橫涇豬已證實絕種,福州黑豬、莆田黑豬、廣東大花白豬和藍(lán)塘豬等多個地方品種已處于瀕臨絕種邊緣。

依照原農(nóng)業(yè)部2006 年頒布的《畜禽遺傳資源保種場保護(hù)區(qū)和基因庫管理辦法》中提出的國家級地方豬種資源保護(hù)場標(biāo)準(zhǔn),有50 個以上地方豬保種場符合條件。 共計有42 個地方豬品種被列入國家級畜禽遺傳資源保護(hù)名錄(農(nóng)業(yè)部公告第2061 號)。 傳統(tǒng)保種要求具有良好生物隔離的專門場地且需要一定的維持費用,相當(dāng)部分專門化保種場虧損嚴(yán)重而難以完成保種目標(biāo)。

眾所周知,豐富的地方豬種資源是一個國家的戰(zhàn)略資源,是目前和未來豬育種工作的基本素材,地方豬種遺傳資源保護(hù)開始受到各界人士和政府的關(guān)注和重視。 隨著人民生活水平的不斷提高,我國豬肉消費需求已步入“量穩(wěn)質(zhì)升”階段,消費者開始注重豬肉的品質(zhì)。 這意味著,培育優(yōu)質(zhì)生態(tài)豬肉的品種必須要有豐富的地方豬種資源作為支撐。 此外,從2018 年開始非洲豬瘟給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大沖擊至今,這一影響也給傳統(tǒng)的活體保種敲響了生物安全警鐘。 僅憑傳統(tǒng)的活體保種方式存在較大的生物安全風(fēng)險,采用“靜態(tài)保種”的手段對地方豬種遺傳資源進(jìn)行備份顯得尤為重要。

2 家畜“靜態(tài)保種”研究進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 靜態(tài)保種涉及相關(guān)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

“靜態(tài)保種”涉及技術(shù)主要包括配子和胚胎等細(xì)胞∕組織的冷凍保存及人工輸精、胚胎移植和體細(xì)胞克隆等遺傳資源的使用技術(shù),這些技術(shù)的發(fā)展水平直接決定其能否廣泛應(yīng)用。

2.1.1 豬精液冷凍保存技術(shù)

該技術(shù)一般指對大體積豬精液通過離心濃縮、添加保護(hù)成份并經(jīng)過適當(dāng)?shù)慕禍仄胶夂屠鋬?使精子細(xì)胞的代謝幾乎完全停止,從而達(dá)到長期保存( -196 ℃)的目的。 豬精液冷凍保存技術(shù)研究最早始于20世紀(jì)50 年代,一直到70 年代才有使用冷凍精液產(chǎn)仔報道[4]。 豬冷凍精液劑型主要有顆粒、細(xì)管(0.5 mL和5 mL)和扁平袋(5 mL)等,目前以與程序化冷凍儀和精液灌封機(jī)等標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)設(shè)備相配套的0.5 mL細(xì)管為主。 豬的顆粒和細(xì)管冷凍精液1975 年就開始用于豬育種,但受制于精液冷凍和輸精技術(shù)水平,直到本世紀(jì)初使用冷凍精液的母豬數(shù)量還不到1%[5]。 近十幾年來,國內(nèi)外豬精液冷凍技術(shù)發(fā)展主要聚焦在以下幾方面并取得了較大突破:(1)冷凍稀釋液研發(fā)主要在冷凍保護(hù)劑、抗氧化、抗菌等成分篩選、添加試驗,已有多個品牌的商業(yè)化冷凍稀釋粉(液);(2)精準(zhǔn)降溫的程序化降溫儀問世,可實現(xiàn)豬精子冷凍降溫速率實現(xiàn)最優(yōu)化;(3)豬精液冷凍專用的精液分裝、細(xì)管打印和封口等設(shè)備研發(fā)。 使豬冷凍精液規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化的商業(yè)生產(chǎn)成為可能;(4)與冷凍精液相配套的母豬發(fā)情鑒定和深部位輸精技術(shù)研究,大幅度提高了豬冷凍精液的實用價值。 迄今為止,國際上已經(jīng)召開了八次關(guān)于豬精液冷凍保存的大型國際會議,對豬精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用起到了積極的推動作用[6]。 我國豬精液冷凍保存技術(shù)研究雖略晚于國外,但巨大的市場需求極大推動了我國豬冷凍精液商業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程開始步入商業(yè)化生產(chǎn)和大面積推廣階段[7]。

2.1.2 胚胎∕卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)

理論上講,胚胎含有動物個體所有的遺傳信息,卵母細(xì)胞僅包括雌性動物遺傳物質(zhì)。 冷凍的胚胎∕卵母細(xì)胞保存不再受時空限制,在豬遺傳資源的保護(hù)均具有重要意義,可以作為傳統(tǒng)保種體系的有效補(bǔ)充。胚胎和卵母細(xì)胞冷凍方法類似,先后歷經(jīng)慢速冷凍法、快速冷凍法和玻璃化冷凍法,前二者需要昂貴的程序冷凍儀,后來的玻璃化冷凍法采用將胚胎或卵母細(xì)胞含高濃度冷凍保護(hù)劑的冷凍液里,直接投入液氮快速冷凍,具有操作簡單、對儀器要求低和冷凍效果好等優(yōu)點,已逐漸取代傳統(tǒng)方法成為目前家畜胚胎∕卵母細(xì)胞冷凍保存的主要手段。 與其他動物相比,豬的胚胎和卵母細(xì)胞均含有較高比例的脂肪成分,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)容易在冷凍-解凍過程發(fā)生不可逆性損傷,這是豬胚胎和卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)進(jìn)展緩慢的主要原因[8-9]。 豬胚胎和卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)難度較大,雖然20 世紀(jì)90 年代豬冷凍胚胎移植就已成功產(chǎn)下仔豬,但至今仍沒有較大突破[10]。 由于冷凍卵母細(xì)胞需要額外經(jīng)歷體外受精操作,豬的冷凍卵母細(xì)胞的應(yīng)用難度明顯高于冷凍胚胎,直到2014 年和2015 年才有處于GV 期[11]和MII 期[12]冷凍卵母細(xì)胞上獲得存活后代。 另外,冷凍豬胚胎保存技術(shù)應(yīng)用也受胚胎移植技術(shù)水平制約,冷凍豬卵母細(xì)胞則受體外受精和胚胎移植兩方面因素影響。 目前豬的胚胎移植主要采用常規(guī)手術(shù)或腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù),對操作人員和移植條件要求較高,對母豬維持妊娠有一定負(fù)面影響。 在科研人員不懈努力下,已有非手術(shù)法豬胚胎移植專用的商品化器械問世,大大降低了技術(shù)難度[13-14]。

2.1.3 體細(xì)胞的冷凍保存與體細(xì)胞克隆技術(shù)

1997 年,英國科學(xué)家利用體細(xì)胞核移植成功獲得世界首例克隆綿羊[15],隨后在牛[16-17]、山羊[18]和豬[19-20]等家畜先后獲得成功。 這意味著可以從任意一頭家畜采集體細(xì)胞,經(jīng)培養(yǎng)、構(gòu)建細(xì)胞庫和冷凍保存,在需要的時候解凍體細(xì)胞后采用體細(xì)胞核移植的方法克隆出大量與供體遺傳信息一致的個體[21]。 該方法可在不影響生產(chǎn)的情況下大批量地采集公、母畜的體細(xì)胞,細(xì)胞采集、培養(yǎng)和建庫等流程可行性高、成本低。 但受制于傳統(tǒng)體細(xì)胞克隆對儀器和操作技能較高要求,多年來家畜體細(xì)胞的冷凍保存一直不被重視。 近幾年手工克隆技術(shù)(即徒手克隆)[22]的問世,大幅度地降低了豬的克隆成本和技術(shù)難度,為體細(xì)胞冷凍保存在豬靜態(tài)保種中的應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ),具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.2 國內(nèi)外家畜“靜態(tài)保種”手段在家畜遺傳資源保護(hù)中應(yīng)用及現(xiàn)狀

目前,在畜牧業(yè)高度良種化和集約化的歐美發(fā)達(dá)國家中,原有眾多品種減少到少數(shù)經(jīng)濟(jì)價值高的品種和雜交品種,畜禽遺傳資源相對匱乏。 而在一些發(fā)展中國家,由于良種化程度較低和地域相對封閉等因素,使得一些原有本土品種得以幸存。 在過去全球經(jīng)濟(jì)一體化進(jìn)程中,發(fā)展中國家常常忽視本土原有畜禽遺傳資源保護(hù),一味通過大量引進(jìn)外來品種提高畜牧業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益,已造成原有地方畜禽品種數(shù)量急劇減少。

美國政府從20 世紀(jì)90 年代至21 世紀(jì)初,先后啟動了多個畜禽遺傳資源保護(hù)項目,調(diào)查了本土畜禽品種的數(shù)量和地理分布信息,詳細(xì)測定了每個品種的特性(如外形、育種值和對環(huán)境適應(yīng)性等),并通過全美遺傳資源信息網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)了信息共享;收集并冷凍保存了奶(肉)牛、豬、綿羊和山羊等家畜的遺傳物質(zhì)(如精液、胚胎、卵母細(xì)胞和DNA 等),并建立了用于檢索的電子數(shù)據(jù)庫[23-24]。 美國已建成一個國家級的畜禽“基因庫”,收集了列入國家保種規(guī)劃的畜禽品種(包括一些外來品種)的遺傳資源[24]。

盡管同在歐盟體系下,英國、法國和荷蘭等國均建立自己了國家級的畜禽“基因庫”,對畜禽瀕危品種、具有優(yōu)異性能的非瀕危品種和育種群的典型樣本等的精液、胚胎等遺傳物質(zhì)進(jìn)行有效冷凍保存[25-26]。巴西和印度在畜禽“基因庫”建設(shè)上也取得了不俗的成績。 如,巴西國家遺傳資源與生物技術(shù)研究中心下屬“基因庫”共計保存了牛、山羊、綿羊、馬和驢等14 個品種的52 230 劑冷凍精液和220 枚胚胎[27];印度的國家動物遺傳資源局下屬的“基因庫”已收集了多達(dá)31 個畜禽品種97 835 劑冷凍精液(來自257 頭種公畜)[28]。 前蘇聯(lián)至少冷凍保存了26 個品種192 頭公牛的12.3 萬份精液和33 個品種252 只公羊的45.6 萬份精液[29]。

我國家畜遺傳資源的保護(hù)工作幾乎與歐美發(fā)達(dá)國家同步,面對需要保存的地方畜禽品種數(shù)量較多。從1986 年開始,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧研究所在四年里建成包括來自4 個牛品種和3 個綿羊品種的冷凍“精子庫”,共計34 091 份;從1996 年到2000 年,全國畜牧總站畜禽遺傳資源保存利用中心初步建立志家畜種質(zhì)基因庫(國家家畜基因庫前身),基因庫由冷凍精液(牛和豬)、冷凍胚胎(牛和豬)及家禽的血樣和DNA 等遺傳物質(zhì),并建立了生物技術(shù)保種(即“靜態(tài)保種”)技術(shù)規(guī)程和遺傳物質(zhì)安全管理規(guī)范,以及牛、豬和羊等家畜的DNA 數(shù)據(jù)庫[30]。

中國政府十分重視利用“靜態(tài)保種”手段建立畜禽“基因庫”工作,先后頒布了《畜禽遺傳資源保種場保護(hù)區(qū)和基因庫管理辦法》(2006 年7 月)、《中國國家級畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》(2014 年2 月)等法規(guī),并相繼建立了國家級畜禽基因庫(北京)、國家級地方雞種基因庫(江蘇和浙江各1 個)和國家級水禽基因庫(江蘇和福建各1 個)等[31-32]。 以國家級畜禽基因庫(北京)為例,截至2017 年10 月,該基因庫共收集和保存了冷凍保存了家畜精液、胚胎和體細(xì)胞等遺傳物質(zhì)共計39.4 萬份以上。 其中,牛、羊、豬和馬等家畜冷凍精液35 萬份,共涉及86 個品種;來自51 個品種的牛、羊冷凍胚胎1.2 萬枚;采集、培養(yǎng)和冷凍保存了牛、羊、豬和馬等家畜耳成纖維細(xì)胞8 000 份以上,共31 個品種[33]。

我國地方農(nóng)科院系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位在豬地方品種遺傳資源保存也做出巨大貢獻(xiàn)。 2002 年,江西農(nóng)業(yè)大學(xué)建成國內(nèi)最完備的地方豬種資源基因組DNA 庫。 該庫采集了國內(nèi)現(xiàn)存的70 個地方豬種(群)、4 000多個豬個體的血樣和組織樣,提取并保存了1.2 萬份DNA 樣品;重慶畜牧科學(xué)院建立了榮昌豬的冷凍“精子庫”[34];上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所從20 世紀(jì)90 年代至今,對上海地區(qū)地方豬品種和培育品種遺傳資源進(jìn)行了有效保存,初步建立了上海白豬(農(nóng)系、上系)、梅山豬和浦東白豬等多個品種的冷凍精子庫、體細(xì)胞庫,及相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫[21,35-36]。

綜上,豬精液冷凍保存-深部位輸精技術(shù)體系已發(fā)展成熟,豬冷凍精液已步入商業(yè)化生產(chǎn)并在育種得到了廣泛應(yīng)用,冷凍精液是目前針對公豬性價比最高的“靜態(tài)保種”手段;玻璃化冷凍法的問世大大降低胚胎∕卵母細(xì)胞冷凍的技術(shù)難度和成本,并提高了二者的冷凍效果,二者的應(yīng)用價值也隨著體外受精和胚胎非手術(shù)移植方法的優(yōu)化而提高;豬體細(xì)胞冷凍保存也是一種被廣泛看好的“靜態(tài)保種”手段,基于前期細(xì)胞采集、培養(yǎng)和冷凍保存等過程具有較高可行性,可以對整個保種群體實現(xiàn)體細(xì)胞冷凍保存,這樣就可在必要的時候?qū)δ承﹤€體進(jìn)行按需“復(fù)制”。 此外,還應(yīng)該以前瞻性的眼光來看問題,不能因為某種遺傳物質(zhì)目前的應(yīng)用價值較低而忽視,其價值極有可能在未來因某項技術(shù)的突破而大幅度提升。

3 結(jié)論

從2018 年開始影響至今的非洲豬瘟對我國養(yǎng)豬生產(chǎn)和地方豬種質(zhì)資源保護(hù)均造成了巨大沖擊,使仍以活體保種為主的地方豬種面臨滅絕的風(fēng)險。 豬種質(zhì)資源是一個國家的戰(zhàn)略資源,是今后開展豬育種工作的基本素材,對我國未來豬育種和養(yǎng)豬業(yè)實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展至關(guān)緊要。 通過政府的政策導(dǎo)向和資金支持,加強(qiáng)科研院所、豬育種企業(yè)和專門保種場的“產(chǎn)-學(xué)-研”合作、形成合力,以現(xiàn)有“靜態(tài)保種”手段為現(xiàn)存的地方豬種做好遺傳資源的備份,具有非常重要的現(xiàn)實意義。