糧食作物中主要真菌毒素及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

王 星， 楊新文*， 費(fèi) 晨， 王 印

(1.安徽中儲(chǔ)糧糧油質(zhì)監(jiān)中心， 安徽 合肥 230000； 2.山東中儲(chǔ)糧糧油質(zhì)監(jiān)中心有限公司， 山東 濟(jì)南 250100)

糧食作物是人類賴以生存的基礎(chǔ)物質(zhì)，容易受到真菌毒素的污染。真菌毒素是真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一類對(duì)人和動(dòng)物具有毒害作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，目前已知真菌毒素及其類似物有400余種，其中3/4已被證實(shí)對(duì)人類健康有影響[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有2%的農(nóng)作物因污染嚴(yán)重而失去經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失和資源浪費(fèi)，同時(shí)給人和動(dòng)物食物安全帶來(lái)極大威脅，甚至?xí)a(chǎn)生細(xì)胞毒性、免疫毒性及“三致”等毒副作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，人類和動(dòng)物即使攝入微量的真菌毒素及其代謝物也會(huì)產(chǎn)生富集作用，危害健康。糧食作物中因多種產(chǎn)毒菌污染產(chǎn)生的協(xié)同毒性遠(yuǎn)大于單種或多種毒素相加的作用[4]。因此，建立有效的真菌毒素污染監(jiān)控至關(guān)重要，世界各國(guó)正逐漸強(qiáng)化對(duì)毒素污染的管理和防治，目前已有100余個(gè)國(guó)家和地區(qū)出臺(tái)食品中真菌毒素限量規(guī)定，極大地推動(dòng)了真菌毒素檢測(cè)方法的發(fā)展和相關(guān)法規(guī)的規(guī)范。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)真菌毒素進(jìn)行了大量研究，為進(jìn)一步深入研究真菌毒素的種類及其檢測(cè)技術(shù)，有效防控糧食作物的真菌毒素污染提供參考，從目前糧食作物中已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素、赭曲霉毒素及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等主要真菌毒素種類及其檢出限，以及真菌毒素檢測(cè)方法2方面對(duì)相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1糧食作物中主要真菌毒素及其檢出限

1.1黃曲霉毒素

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一種由黃曲霉和寄生曲霉等代謝形成的有嚴(yán)重毒性的物質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)的衍生物多達(dá)20余種，常見(jiàn)的有AFB1和AFB2等，其中，AFB1的毒性最強(qiáng)，其毒性約是氰化鉀、砒霜等劇毒物質(zhì)的幾十倍。AFB1可導(dǎo)致人和動(dòng)物的急、慢性中毒，對(duì)肝臟、肺和腎臟等多種組織器官造成不可逆的損害，黃曲霉毒素是目前已知最強(qiáng)致癌物，具有很強(qiáng)的“三致”作用[1]，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為I類致癌物。黃曲霉毒素性質(zhì)穩(wěn)定，在強(qiáng)酸及高溫等常見(jiàn)脫毒條件下難以完全分解。AFB1廣泛存在于玉米、花生等日常食用的糧油作物中，HACBEKIROGDU等[5]對(duì)采集的62種樣品進(jìn)行黃曲霉毒素污染的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，毒素超標(biāo)的樣品在75%以上，其中栗子等食品的毒素含量最大。目前，我國(guó)僅對(duì)部分食品中的AFB1和AFM1作限量規(guī)定[6]：小麥、大麥、小麥粉、麥片和其他谷物，豆類及其制品、其他熟制堅(jiān)果及籽類中AFB1的最高允許限量≤5.0 μg/kg；稻谷、糙米和大米中AFB1≤10.0 μg/kg；玉米、玉米面(渣、片)及玉米制品，花生及其制品、花生油和玉米油中AFB1≤20.0 μg/kg；嬰幼兒配方食品中AFB1≤0.5 μg/kg；乳、乳制品和 (較大)嬰兒配方食品中AFM1≤0.5 μg/kg。對(duì)AFT總量等的限量標(biāo)準(zhǔn)仍需進(jìn)一步探討。

1.2脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又名嘔吐毒素，是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬單端孢霉烯族化合物，具有強(qiáng)烈的毒性，可使人和動(dòng)物產(chǎn)生惡心、嗜睡或嘔吐等急性中毒癥狀；若長(zhǎng)期食用被DON污染的物質(zhì)將造成細(xì)胞免疫反應(yīng)功能障礙[7]、皮膚炎癥[8]、溶血性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等損傷。DON對(duì)糧食污染的廣泛性是世界性問(wèn)題，常見(jiàn)于小麥和玉米等農(nóng)作物生長(zhǎng)、儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中?；贒ON的嚴(yán)重危害性，世界各國(guó)或組織都對(duì)食品中DON的允許限量作出明確規(guī)定：中國(guó)規(guī)定小麥、玉米及制品中DON的最高允許限量≤1 000 μg/kg[6]；美國(guó)規(guī)定未清洗軟質(zhì)小麥中DON≤2 000 μg/kg，食用小麥最終產(chǎn)品中DON≤1 000 μg/kg，飼料用小麥及其制品中DON≤4 000 μg/kg；歐盟規(guī)定小麥和燕麥中DON≤1 750 μg/kg，谷粉和玉米粉中DON≤750 μg/kg。

1.3玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮(ZEN)是由多種鐮刀菌產(chǎn)生的一種難溶于水，易溶于甲醇的非甾體雌激素樣作用的真菌毒素，亦稱F2毒素，其在霉變的玉米和高粱等谷類作物中廣泛存在，是污染范圍最廣的鐮刀菌毒素之一。因其毒性較強(qiáng)，在飼料和食品的加工過(guò)程中不易被破壞；能夠產(chǎn)生生殖毒性和細(xì)胞免疫毒性等，嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物的生命健康。各國(guó)或組織都對(duì)ZEN的限量標(biāo)準(zhǔn)作出具體規(guī)定：中國(guó)規(guī)定玉米類飼料中ZEN最高允許限量≤500 μg/kg，谷物(小麥、玉米)及其制品中ZEN≤60 μg/kg[6]；歐盟于2007年規(guī)定玉米和谷物中ZEN的最高允許限量分別≤350 μg/kg和≤100 μg/kg；澳大利亞規(guī)定黑麥中ZEN≤60 μg/kg。

1.4赭曲霉毒素

赭曲霉毒素(Ochratoxins，OT)是主要由赭曲霉、硫色曲霉等多種曲霉菌和鮮綠青霉產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物。赭曲霉毒素有 A、B、C和D 4種異構(gòu)體，其中赭曲霉毒素A(OTA)在自然界中分布最廣泛[9]，毒副作用最強(qiáng)，人和動(dòng)物食用含有OTA的食物易產(chǎn)生神經(jīng)、免疫毒性等危害[10]。OT不僅能引起不可逆性的腎功能衰竭(大鼠經(jīng)口LD50為20 mg/kg)[11]，還對(duì)肝臟、腎臟及泌尿系統(tǒng)具有“三致”作用，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IRAC)及世界衛(wèi)生組織(WHO)將其列入2B類致癌物。目前，已有多個(gè)國(guó)家對(duì)OTA的限量作出規(guī)定：我國(guó)規(guī)定谷物、豆類及其制品中OTA的含量≤5 μg/kg[6]，瑞士規(guī)定谷物及其制品中OTA的含量≤2 μg/kg，巴西規(guī)定小麥、玉米、豆類OTA的含量≤50 μg/kg等。丹麥和法國(guó)規(guī)定谷物中OTA的含量≤5 μg/kg。

1.5伏馬毒素

伏馬毒素(fumonisin，F(xiàn)UM)主要是由串珠鐮刀菌和輪狀鐮刀菌產(chǎn)生的一類雙酯化合物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，耐熱，遇酸后水解產(chǎn)物仍有部分毒性。伏馬毒素可對(duì)人和動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)、肺部和免疫系統(tǒng)造成極大損傷，并有較強(qiáng)的致癌性，致癌機(jī)理主要是髓鞘樣堿基的異常堆積，破壞DNA的正常合成[12]，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IRAC)將其歸為2B類致癌物。FUM廣泛分布在玉米、水稻等農(nóng)作物中，目前已知的FUM衍生物有FA1和FB1等11種，其中FB1含量最高，毒性最強(qiáng)。美國(guó)規(guī)定玉米及其谷物制品中FUM最高允許限量≤1 000 μg/kg，嬰幼兒玉米制品谷物中FUM≤200 μg/kg；法國(guó)規(guī)定谷物中FUM≤1 000 μg/kg；我國(guó)尚未對(duì)FUM作出限量規(guī)定。有監(jiān)測(cè)表明，我國(guó)部分地區(qū)的玉米、水稻中的FUM檢出率為28%～100%，最高含量達(dá)15.2 mg/kg[13]。

2真菌毒素的檢測(cè)

2.1定性檢測(cè)方法

2.1.1電子鼻分析法通過(guò)模擬動(dòng)物嗅覺(jué)器官實(shí)現(xiàn)對(duì)氣味的有效識(shí)別及組分判斷，是一種比較前沿的定性分析方法。當(dāng)前，通過(guò)此方法已能完成玉米和稻谷等糧油作物中赭曲霉毒素和嘔吐毒素等真菌毒素的特異性鑒別檢測(cè)，識(shí)別率≥80%，且此技術(shù)仍在不斷地研究?jī)?yōu)化，預(yù)計(jì)將來(lái)可在糧油真菌毒素監(jiān)測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[14]。

2.1.2生物鑒定法通過(guò)在生物體上試驗(yàn)判定真菌產(chǎn)生的危害，并對(duì)其毒性部位和毒性機(jī)理進(jìn)行驗(yàn)證，是一種比較傳統(tǒng)和直觀的定性分析法。常見(jiàn)的生物鑒定法有種子發(fā)芽試驗(yàn)、皮膚毒性試驗(yàn)和組織細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)等，其具有對(duì)樣本純度要求較低的優(yōu)點(diǎn)，但也存在精準(zhǔn)度低、易污染，特異性、重復(fù)性及靈敏度不佳等缺點(diǎn)。故此法僅用作化學(xué)法等其他分析方法的輔助方法[15]。

2.1.3質(zhì)譜成像分析法質(zhì)譜成像技術(shù)(MSI)是一種簡(jiǎn)單、高效的定性方法，其通過(guò)質(zhì)譜離子掃描與成像技術(shù)結(jié)合測(cè)定，再對(duì)得到的目標(biāo)物質(zhì)荷比(m/z)信息進(jìn)行分析、歸類[16]。SEBASTAIN等[17]采用基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間質(zhì)譜成像技術(shù)同時(shí)檢測(cè)鑒別被污染葡萄中的OTA及12種伏馬毒素，直觀地看到其污染程度和污染區(qū)域。BERISHA等[18]研究指出，采用激光解吸-高分辨質(zhì)譜成像技術(shù)快速篩查鑒定小麥種子中的DON，樣品無(wú)需前處理，結(jié)果誤差<2×10-6μg/kg，且不受水分含量影響。MSI檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單、效率高，且可同時(shí)測(cè)定多種毒素污染的程度和分布，但由于進(jìn)一步的確證和定量仍需借助其他檢測(cè)技術(shù)。因此，MSI在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用尚不廣泛。

2.2定量檢測(cè)方法

2.2.1理化檢測(cè)法

1) 薄層色譜法(TLC法)。TLC法是一種最早被廣泛用于真菌毒素檢測(cè)的經(jīng)典的化學(xué)分析方法，主要通過(guò)特征性的顯色反應(yīng)和色譜保留規(guī)律，對(duì)樣品進(jìn)行分離、定性和定量分析，該方法操作簡(jiǎn)便快速，難度低，損耗低。AOAC首次提出用薄層色譜檢測(cè)法測(cè)定花生中的黃曲霉毒素[19]，后被多個(gè)國(guó)家認(rèn)可并采納為標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法在2009年以前曾長(zhǎng)期作為我國(guó)真菌毒素檢測(cè)國(guó)標(biāo)第一法。TEIXEIRA等[20]使用TLC法和電荷耦合檢測(cè)器(CCD)對(duì)88份紅酒樣品中的OTA污染情況進(jìn)行篩查發(fā)現(xiàn)，其污染率為5.7%，該方法的定量限和檢測(cè)限分別為0.8 μg/L和0.2 μg/L，平均回收率為82.3%。TLC法雖可操作性高，但存在過(guò)程復(fù)雜、精密度差、結(jié)果易受主觀影響和無(wú)法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等缺點(diǎn)，目前已經(jīng)難以適應(yīng)當(dāng)下日常檢測(cè)的需要。在一些實(shí)驗(yàn)條件有限的情況下，TLC法在監(jiān)測(cè)和分析研究等方面仍具有一定的優(yōu)越性。快速的定性篩選判斷仍多采用此法。

2) 高效液相色譜法(HPLC法)。HPLC法是現(xiàn)代科學(xué)領(lǐng)域中重要的分離、分析技術(shù)，是以液體作為流動(dòng)相，用顆粒極細(xì)的高效固定相進(jìn)行成分分離的柱色譜技術(shù)。真菌毒素檢測(cè)廣泛地采用HPLC法，其檢測(cè)分離效能高，可同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素。HPLC法常與穩(wěn)定快速的樣品前處理方法、衍生方法結(jié)合使用，免疫親和柱凈化法(IAC)是最有效的前處理方法，其原理是用抗原-抗體的免疫反應(yīng)作為依據(jù)，利用單克隆抗體與目標(biāo)真菌毒素的特異性吸附進(jìn)行分離凈化。于彥彬等[21]將花生樣品通過(guò)固相萃取凈化后，采用柱后衍生-高效液相色譜法測(cè)定其中的4種黃曲霉毒素，回收率為68.8%～101%，RSD為5.0%～7.1%。謝剛等[22]通過(guò)研究自動(dòng)化免疫親和在線凈化-HPLC法，實(shí)現(xiàn)樣品凈化和檢測(cè)同步化，且支持高通量樣品檢測(cè)，有效提高了樣品檢測(cè)的效率。由于HPLC法前處理過(guò)程復(fù)雜、經(jīng)濟(jì)成本高，因此其雖靈敏度高，結(jié)果精確，但無(wú)法滿足大批量樣品的快速篩查。

3) 液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS法)。LC-MS/MS法兼具色譜法的高效分離和質(zhì)譜檢測(cè)器的通用性，對(duì)真菌毒素檢測(cè)適用性廣、靈敏度高，可同時(shí)完成對(duì)多種毒素的檢測(cè)。MEERPOEL等[23]采用UPLC-MS法同時(shí)對(duì)食品、飼料中的OTA和柑桔素進(jìn)行檢測(cè)，定量限分別為5.6 μg/kg和3.9 μg/kg，該方法的相關(guān)指標(biāo)滿足歐盟No.401/2006/EC和No.2002/657/EC指令要求。STEFANOVIC等[24]對(duì)比ELISA法和高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)(UPLC-MS)測(cè)定牛奶(n=250)中AFM1及玉米(n=100)中AFB1，回歸分析結(jié)果顯示，AFB1樣品之間的一致性(R2=0.994)高于AFM1樣品之間的一致性(R2=0.920)，進(jìn)一步驗(yàn)證了2種方法的適用性和可靠性。近年來(lái)，為了適應(yīng)檢測(cè)需要，提高分析效率，常將實(shí)時(shí)直接分析技術(shù)(DART)與UPLC-MS法融合應(yīng)用于食品真菌毒素的分析檢測(cè)。宮小明等[25]應(yīng)用QuEChERS技術(shù)對(duì)紅酒樣品進(jìn)行前處理后，直接進(jìn)樣分析表明，在1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和10 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下，回收率為88.7%～105.7%，RSD為8.5%～12.8%，定量限為0.5 μg/kg。既方便省時(shí)，又減少溶劑污染，比較適合進(jìn)行大批量的樣品檢測(cè)處理。

4) 氣相色譜檢測(cè)法(GC法)。GC法是利用惰性氣體將氣化的樣品帶入色譜柱中進(jìn)行分離檢測(cè)，常用于具有良好氣化性能、弱熒光或弱吸收的真菌毒素檢測(cè)，具有分離效能高、方法靈敏度高、分析速度快和選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。YUE等[26]使用GC法分析中草藥及相關(guān)產(chǎn)品中的嘔吐毒素含量，檢出限為2 μg/kg，加標(biāo)試驗(yàn)回收率為85.5%～97.2%，RSD<6.3%，與GC-MS的測(cè)定結(jié)果一致，驗(yàn)證了2種方法的適用性和可靠性。此外，GC法也是展青毒素、玉米赤霉烯酮和鏈格孢毒素的常用檢測(cè)方法[27]。

5) 氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS法)。GC-MS法利用物料在色譜柱中吸附性能的差異、極性及沸點(diǎn)不同進(jìn)行分離和鑒定混合物，該法優(yōu)點(diǎn)是抗干擾能力極強(qiáng)、高靈敏度、誤差小、回收率高且可同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素。TANG等[28]采用GC-MS技術(shù)測(cè)定谷物中DON含量，只需真空干燥和衍生化2步簡(jiǎn)單前處理即可進(jìn)樣分析，該法分析時(shí)間<15 min，對(duì)3-keto-DON、3-epi-DON和DON的檢測(cè)回收率為89.5%～103.6%，檢出限分別為5×10-11mg/L、3×10-9mg/L和8×10-10mg/L。但GC-MS法不適于鏈格孢霉毒素等穩(wěn)定性強(qiáng)、難揮發(fā)的真菌毒素測(cè)定。

6) 超臨界流體色譜法(SFC法)。SFC法利用改變超臨界流體溶劑的溫度和壓力控制超臨界流體中不同組分的溶解度，從而達(dá)到分離、檢測(cè)待測(cè)物的目的。該法具有對(duì)環(huán)境友好和高效等特點(diǎn)，且在真菌毒素檢測(cè)過(guò)程中，能夠?qū)Σ煌婢舅禺悩?gòu)體實(shí)現(xiàn)分離。MARTHE等[29]首次提出采用超高效-超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測(cè)啤酒中游離菌毒素和修飾菌毒素，成功測(cè)出啤酒樣品中的6種鐮刀菌毒素及其衍生物，為真菌毒素的檢測(cè)拓展了新思路。但此法保留機(jī)制復(fù)雜，洗脫不穩(wěn)定，也限制了UPLC-SFC法在多菌毒素分析中的應(yīng)用。LEI等[30]用異丙醇稀釋經(jīng)13C標(biāo)記的食用油樣品，再經(jīng)乙腈-飽和己烷萃取，最后以超臨界CO2和甲醇作為流動(dòng)相對(duì)萃取液進(jìn)行梯度洗脫，此方法無(wú)需純化就能在30 min內(nèi)對(duì)食用油中4種AFT完成檢測(cè)，其檢出限為0.05～0.12 mol/ L，RSD<8.5%，形成了一種新的基于超臨界流體色譜技術(shù)的測(cè)定法——SFC-MS/MS法，其在食品痕量分析領(lǐng)域潛力巨大。

2.2.2免疫化學(xué)法

1) 酶聯(lián)免疫法(ELISA法)。ELISA法是把酶的高效催化作用和抗體、抗原的免疫反應(yīng)有機(jī)結(jié)合的一種顯色檢測(cè)技術(shù)，分為間接競(jìng)爭(zhēng)和直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法2種形式[31]。馬冬月[32]建立農(nóng)產(chǎn)品中嘔吐毒素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其通過(guò)交叉反應(yīng)試驗(yàn)證明抗體具有較高的特異性，此法IC50的檢出限和靈敏度分別為 0.003 mg/kg和0.03 mg/kg。潘明飛等[33]建立了一種能夠快速檢測(cè)谷物食品中殘留AFB1的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法，成功檢測(cè)出花生樣品中的AFB1含量，檢出限為0.006 6 μg/L，靈敏度為0.027 μg/L。目前，酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)已成為我國(guó)糧油食品中國(guó)標(biāo)規(guī)定的真菌毒素篩選檢測(cè)方法，酶聯(lián)免疫法選擇特異性好、靈敏度高且操作簡(jiǎn)單，但仍存在標(biāo)記物酶易失活、重復(fù)性差、無(wú)法多毒素同時(shí)檢測(cè)，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化及假陽(yáng)性概率較高等缺點(diǎn)，且難以滿足越來(lái)越低的限量標(biāo)準(zhǔn)需求。

2) 時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)(TRFIA法)。TRFIA法是一種由光激發(fā)產(chǎn)生的均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)，以稀土元素為熒光標(biāo)記物，使用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定熒光信號(hào)強(qiáng)度，光信號(hào)強(qiáng)度與樣品中的分析物濃度成反比，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定被測(cè)樣品中分析物的含量。與ELISA法相比，結(jié)果穩(wěn)定性高。張兆威等[34]使用自制時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條對(duì)不同農(nóng)產(chǎn)品的AFB1進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，測(cè)定結(jié)果與HPLC法檢測(cè)結(jié)果相互驗(yàn)證，檢測(cè)限為0.3 μg/kg。周彬等[35]利用DON多克隆抗體和光(680 nm)激發(fā)產(chǎn)生的均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)，通過(guò)標(biāo)記免疫反應(yīng)建立起均相的DON-AlphaLISA免疫檢測(cè)法，測(cè)定的樣品光信號(hào)強(qiáng)度與 DON 濃度成反比，此法時(shí)間短，穩(wěn)定性好，有效范圍更寬，為0.007～100 ng/mL，靈敏度為0.007 ng/mL，批內(nèi)批間變異系數(shù)均<5%， 無(wú)明顯基質(zhì)干擾。TRFIA法靈敏度高、重現(xiàn)效果佳且能一次測(cè)定多個(gè)樣品，不足點(diǎn)在于易受背景熒光的干擾且測(cè)定需要的試劑可能損害人體健康，務(wù)必要在嚴(yán)密的防護(hù)條件下進(jìn)行操作。

3) 膠體金免疫層析技術(shù)(GICA法)。GICA法是將試紙條中的抗體與樣液中的特異性抗原結(jié)合顯色后，經(jīng)膠體金標(biāo)記，通過(guò)對(duì)試紙條顯色反應(yīng)的深淺進(jìn)行儀器對(duì)比讀取，從而確定真菌毒素的含量。其在當(dāng)前的免疫學(xué)快速檢測(cè)方法中以操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短、靈敏度強(qiáng)及污染少等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注，常見(jiàn)于糧油食品在收購(gòu)、加工和抽查復(fù)核過(guò)程中快速篩查真菌毒素。杜兵耀等[36]通過(guò)對(duì)比膠體金免疫層析技術(shù)和HPLC技術(shù)測(cè)定谷物樣品中AFB1的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相符率在90%以上，檢測(cè)時(shí)間<5 min，適用于在田間地頭建立流動(dòng)性高的實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè)和大批量糧油食品的篩查檢測(cè)，但其仍存在樣品提取效率低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)多樣品同時(shí)檢測(cè)等缺點(diǎn)，需要進(jìn)一步優(yōu)化。

4) 放射免疫測(cè)定技術(shù)(RIA法)。RIA法通過(guò)同位素標(biāo)記靶標(biāo)并加入特異性抗體檢測(cè)真菌毒素。閆磊等[37]建立了用CharmⅡ放射免疫法檢測(cè)牛奶樣品中AFT的流程法，通過(guò)18次陰性樣品空白試驗(yàn)和加標(biāo)試驗(yàn)，結(jié)果全部與液相法交叉驗(yàn)證，表明該方法靈敏度和精密度良好，檢出限為0.25 μg/kg。此法前處理簡(jiǎn)單，測(cè)定周期短、效率高，但也容易對(duì)其他物質(zhì)產(chǎn)生污染，成本較高，還需要更進(jìn)一步的探究?jī)?yōu)化。

5) 橫向流動(dòng)免疫檢測(cè)技術(shù)(LFD)。LFD的發(fā)展源于臨床分析中的大分子檢測(cè)，研究者利用橫向流動(dòng)(LFD)原理研制出一種快速檢測(cè)OTA的免疫檢測(cè)方法：先通過(guò)篩選和交叉反應(yīng)找出最優(yōu)的OTA抗體，然后用染色的血清感光乳膠顆粒對(duì)抗體進(jìn)行吸附固定，通過(guò)LFD中的測(cè)試線和質(zhì)控線進(jìn)行結(jié)果定性：2條線均存在時(shí)表明樣品很少或沒(méi)有OTA存在；僅有1條時(shí)表明樣品中有大量的OTA存在[38]。該方法可用于快速鑒別OTA的產(chǎn)毒真菌，對(duì)毒素的早期預(yù)防有重要意義。

2.2.3電化學(xué)生物傳感器法電化學(xué)生物傳感器法通過(guò)將生物與電子技術(shù)相結(jié)合，以物質(zhì)在溶液中電化學(xué)性質(zhì)規(guī)律變化為基礎(chǔ)，將微弱的生物化學(xué)反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)變成可定量的物理、化學(xué)信號(hào)進(jìn)行分析測(cè)定的一種方法。電化學(xué)生物傳感器法不僅能快速檢測(cè)組分復(fù)雜的樣品，且能連續(xù)分析被測(cè)物，擁有直觀高效、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，在食品工業(yè)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。閆好杰等[39]自制一種核酸適體/捕獲探針DNA/羧基化多孔碳-納米金/氨基化金電極(Apt/c DNA/c PC-Au NPs/NH2-Au E)傳感器，以亞甲基藍(lán)為信號(hào)反應(yīng)器，對(duì)OTA的檢測(cè)靈敏度顯著提升，檢測(cè)限為1.0×10-6ng/mL。DALY等[40]利用表面等離子共振(SPR)生物傳感器建立黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)分析黃曲霉毒素偶聯(lián)物和抗黃曲霉毒素抗體作用時(shí)折光指數(shù)的變化檢測(cè)真菌毒素的含量，該方法在3～98 ng/mL對(duì)AFB1檢測(cè)具有良好的重復(fù)性。SCHNER等[41]用類似的生物傳感器檢測(cè)小麥中DON發(fā)現(xiàn)，其工作范圍在0.13～10 .00 μg/mL，檢測(cè)限為2.50 ng/mL，表明該方法檢測(cè)靈敏度較高。此外，還有以光纖倏逝波和以聲表面波為原理設(shè)計(jì)的傳感器，此傳感器檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，為新技術(shù)的研究拓寬了視野，但也存在成本較高和重復(fù)性差等缺點(diǎn)，仍需進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.4光譜分析法通過(guò)光譜分析法快速檢測(cè)和鑒別待測(cè)樣品中的真菌毒素類型，并據(jù)此進(jìn)行定性和定量分析，常用于AFT和OTA等真菌毒素的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。該法能從空白樣品中篩選出DON污染值>310 mg/kg的樣品[42]。KOS等[43]采用中紅外(MIR)/衰減全反射(ATR)光譜測(cè)定玉米中霉菌毒素的分布情況，并采用完全交叉驗(yàn)證法對(duì)最小二乘(PLS)回歸模型進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，經(jīng)主成分分析/聚類分析(PCA / CA)分類后真菌毒素的分離效率為100%，PLS模型的交叉驗(yàn)證顯示相關(guān)系數(shù)為r=0.992 6，無(wú)異常值。SENTHILKUMAR等[44]采用近紅外高光譜成像系統(tǒng)(NIR)對(duì)儲(chǔ)藏大麥OTA污染情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，其對(duì)大麥各時(shí)期OTA的污染程度分析準(zhǔn)確性≥82%。QU等[45]建立了一種薄層色譜-表面增強(qiáng)拉曼光譜(TLC-SERS)檢測(cè)技術(shù)，用手提式拉曼光譜儀對(duì)薄層色譜分離的斑點(diǎn)進(jìn)行定性、定量分析鑒別的結(jié)果表明，該法檢測(cè)時(shí)間<5 min，AFB1和AFG1檢測(cè)限分別為1.5×10-6mg/kg和1.2×10-6mg/kg，選擇性較高，目前已成功用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。隨著中/近紅外(MIR/NIR)光譜技術(shù)的發(fā)展和數(shù)據(jù)模型的完善，光譜分析法將在真菌毒素檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

2.2.5蛋白芯片分析法蛋白芯片分析法是建立在微電子學(xué)和生命科學(xué)等多學(xué)科交叉基礎(chǔ)上的一種新方法，其由于分析時(shí)間短、多樣品參數(shù)同時(shí)處理及自動(dòng)化程度高等方面的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)已成為研究的熱點(diǎn)。宋慧君等[46]通過(guò)液相芯片技術(shù)平臺(tái)和間接競(jìng)爭(zhēng)法原理，對(duì)偶聯(lián)抗原濃度進(jìn)行優(yōu)化，探索出AFB1抗原抗體結(jié)合的最佳反應(yīng)時(shí)間和單抗臨界飽和濃度，建立起一套高效的定量檢測(cè)方法，靈敏度為2.33 ng/mL。

2.2.6熒光光度法熒光光度法是實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的一種分析技術(shù)，根據(jù)不同真菌毒素的熒光特性，可通過(guò)對(duì)樣品中真菌毒素的提取、純化，借助熒光分光光度計(jì)建立定性及定量分析方法。WANG等[47]利用摻氮碳點(diǎn)和納米銀熒光法，提高了熒光強(qiáng)度，對(duì)啤酒和面粉中的OTA進(jìn)行快速測(cè)定的檢出限為8.7 nmol/L，有效擴(kuò)寬了檢測(cè)范圍，縮短了測(cè)定時(shí)間。該檢測(cè)技術(shù)易普及、分析速度快、操作簡(jiǎn)便且結(jié)果直觀，但也存在無(wú)法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的局限性[48]。

3小結(jié)

中國(guó)作為人口大國(guó)，更要重視糧食作物中真菌毒素對(duì)人生命健康的嚴(yán)重危害。伴隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和各學(xué)科前沿技術(shù)的交叉普及應(yīng)用，真菌毒素檢測(cè)技術(shù)也不斷呈現(xiàn)出高效準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便低耗的特點(diǎn)，該研究以國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究為參考，通過(guò)對(duì)常見(jiàn)真菌毒素的種類、特性及其檢出限要求和檢測(cè)分析技術(shù)進(jìn)行較為全面的綜述，及時(shí)追蹤新方法、新技術(shù)的研究進(jìn)展，不斷總結(jié)完善，探索適用于行業(yè)各層次的在線監(jiān)測(cè)技術(shù)，可滿足市場(chǎng)對(duì)檢測(cè)方法提出的高效和準(zhǔn)確需要，對(duì)加強(qiáng)我國(guó)食品安全的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控，保障行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展及消費(fèi)者的身體健康，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。