高通量測序分析黑土稀有微生物群落結(jié)構(gòu)

關(guān)健飛 曹陽

摘要：稀有微生物群落作為地球生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中扮演著超比例的角色。以黑龍江省黑土中稀有微生物為研究對(duì)象，采用高通量測序技術(shù)分析黑土中稀有細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)組成及其與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性。對(duì)屬水平上稀有微生物群落進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)豐度在0.01%以下的稀有細(xì)菌菌屬420種，稀有真菌菌屬210種，各采樣點(diǎn)處稀有微生物類群分布差異性較大，存在特征稀有微生物類群，但未見黑土共有稀有菌屬的檢出。總磷和有效磷的含量分別影響不同種類的稀有細(xì)菌菌屬，其中放線孢菌屬（Actinomycetospora）與總磷含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系，無色桿菌屬（Achromobacter）與有效磷含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系。真菌稀有菌群中的小孢霉屬（Microbotryum）、頂孢霉屬（Acremonium）等與土壤含水率、有機(jī)質(zhì)含量、總氮含量、硝態(tài)氮含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：稀有微生物;群落結(jié)構(gòu);高通量測序;黑土;理化性質(zhì)

中圖分類號(hào)： S154.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）20-0288-05

微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在維持生態(tài)系統(tǒng)功能和服務(wù)過程中起著關(guān)鍵作用[1]?，F(xiàn)階段對(duì)于土壤微生物的研究主要集中在物種組成、結(jié)構(gòu)功能以及遺傳多樣性等方面。土壤中的微生物群落具有典型的物種豐度分布偏斜特征，表現(xiàn)為相對(duì)高豐度的少量優(yōu)勢物種與相對(duì)低豐度的大量稀有物種共存[2]，稀有群落作為地球生態(tài)系統(tǒng)中至關(guān)重要的組成部分，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中扮演著超比例的角色[3]，是微生物群落功能的一個(gè)潛在驅(qū)動(dòng)力[4]，稀有微生物群落是評(píng)價(jià)微生物多樣性的重要因素，是微生物遺傳和功能多樣性的存儲(chǔ)庫，具有驅(qū)動(dòng)地球化學(xué)循環(huán)[5-6]、指示環(huán)境變化[7-8]、降解污染物[9-10]、穩(wěn)定群落結(jié)構(gòu)[11]等重要功能。然而相對(duì)于優(yōu)勢類群，現(xiàn)階段對(duì)于稀有微生物類群的研究較少[12]。本研究以黑龍江省黑土為研究對(duì)象，解析土壤中稀有細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)組成，分析稀有微生物群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性，為稀有微生物的生態(tài)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

本研究以黑龍江省表層（0～20 cm）黑土為研究對(duì)象，在黑龍江省區(qū)域內(nèi)設(shè)置10個(gè)采樣點(diǎn)（圖1），于2019年5月進(jìn)行土壤樣品采集。土壤樣品采集過程中去除細(xì)根等雜物后，充分混勻，置于密封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室后，-80 ℃保存土壤樣品用于高通量測試分析，常溫風(fēng)干土壤樣品用于理化性質(zhì)測定。

1.2 高通量測序

采用Illumina MiSeq測序平臺(tái)對(duì)測序樣本進(jìn)行雙端測序，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。測序過程中，采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit提取試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤總DNA。采用細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）對(duì)高變區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min;27次循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s）;72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。20 μL反應(yīng)體系為4 μL的5×FastPfu Buffer，2 μL的2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL的Forward Primer（5 μmol/L），0.8 μL的Reverse Primer（5 μmol/L），0.4 μL的FastPfu Polymerase，0.2 μL的BSA，10 ng的Template DNA，補(bǔ)ddH2O至20 μL。真菌18S rDNA的V5-V7區(qū)引物SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和1196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）對(duì)高變區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為90 ℃預(yù)變性3 min;37次循環(huán)（95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s）;72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。20 μL反應(yīng)體系為 4 μL的5×FastPfu Buffer，2 μL的2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL的Forward Primer（5 μmol/L），0.8 μL 的Reverse Primer（5 μmol/L），0.4 μL的FastPfu Polymerase，0.2 μL的BSA，10 ng的Template DNA，補(bǔ)ddH2O至20 μL。利用QuantiFluorTM-ST微型熒光計(jì)進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測定量。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過barcode拆分后獲得的有效序列信息統(tǒng)計(jì)，使用Qiime2軟件中的DADA2插件對(duì)所有樣品的全部原始序列進(jìn)行質(zhì)量控制、去噪、拼接并且去嵌合體，形成OTU。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

土壤含水率的測定采用真空烘箱法;pH值的測定采用電位法;有機(jī)質(zhì)含量的測定采用重鉻酸鉀滴定法;全氮含量的測定采用半微量開氏法;全磷含量的測定采用氫氧化鈉堿融-鉬銻抗比色法;全鉀含量的測定則采用火焰光度法;硝態(tài)氮含量采用連續(xù)流動(dòng)分析儀法進(jìn)行測定;有效磷含量采用鉬銻抗比色法進(jìn)行測定，其中酸性土壤使用氟化銨-鹽酸作為浸提劑，堿性土壤使用碳酸氫鈉作為浸提劑;速效鉀含量則使用乙酸銨浸提-火焰光度計(jì)測定，每個(gè)土壤樣品測3次取平均值記錄，用于后續(xù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

選取代表性O(shè)TU序列，與核糖體RNA數(shù)據(jù)庫（Greengenes Database 13_8版本[按99%序列相似性聚類]）進(jìn)行比對(duì)獲得物種注釋信息。使用Excel 2010、Origin 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理以及作圖分析，使用SPSS 19.0進(jìn)行土壤理化性質(zhì)和稀有細(xì)菌、真菌菌群的Pearson相關(guān)性分析以及各采樣點(diǎn)的細(xì)菌、真菌聚類分析，本研究中細(xì)菌和真菌菌屬稀有性的定義為小于0.01%的相對(duì)豐度[13]。

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