基于LC-MS代謝組學(xué)研究黃芪注射液對(duì)白細(xì)胞減少癥模型小鼠的干預(yù)作用

劉騰 許晉芳 盧曉林 侯宏保 李震宇 曲婷麗 趙正保

摘 要 目的：研究黃芪注射液對(duì)白細(xì)胞減少癥模型小鼠的干預(yù)作用。方法：將昆明種小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和藥物組，每組8只。模型組和藥物組小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺以復(fù)制白細(xì)胞減少癥模型，正常組小鼠腹腔注射等體積無(wú)菌注射用水。造模成功后，正常組和模型組小鼠均腹腔注射等體積無(wú)菌注射用水，藥物組小鼠腹腔注射黃芪注射液0.04 mL/10 g，每日1次，連續(xù)7 d。在檢測(cè)各組小鼠血常規(guī)指標(biāo)（白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)）的基礎(chǔ)上，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）分析血清中的代謝產(chǎn)物，并通過(guò)主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)分析以及HMDB、METLIN、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)指認(rèn)、鑒定差異代謝物;借助MetPA在線工具對(duì)差異代謝物的代謝通路進(jìn)行分析，并基于皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析血常規(guī)指標(biāo)與差異代謝物的相關(guān)性。結(jié)果：與正常組比較，模型組小鼠血常規(guī)指標(biāo)計(jì)數(shù)均顯著減少（P<0.01）;與模型組比較，黃芪注射液組小鼠上述血常規(guī)指標(biāo)均顯著增加（P<0.01）。正常組和模型組小鼠血清樣品的LC-MS圖譜明顯不同，且黃芪注射液組血清樣品LC-MS代謝組學(xué)數(shù)據(jù)與正常組接近。多元統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中L-異亮氨酸、二十碳五烯酸等17個(gè)代謝物含量顯著升高，亞精胺等4個(gè)代謝物含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，黃芪注射液可回調(diào)小鼠血清中檸檬酸、L-脯氨酸、乙酰肉堿、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、1-磷酸鞘氨醇、溶血磷脂酰肌醇、二十碳五烯酸和亞油酸等9個(gè)代謝物的含量（P<0.05或P<0.01），且主要與亞油酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，苯丙氨酸代謝等通路有關(guān)（代謝通路影響值均大于0.1）。相關(guān)性分析顯示，血常規(guī)指數(shù)與模型組中含量升高的D-鞘氨醇、亞油酸、檸檬酸等含量之間的相關(guān)性較明顯（r的絕對(duì)值普遍大于0.5）。結(jié)論：黃芪注射液可增加白細(xì)胞減少癥模型小鼠的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞計(jì)數(shù);其升高白細(xì)胞的作用可能與亞油酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成及苯丙氨酸代謝等途徑有關(guān)。

關(guān)鍵詞 黃芪注射液;白細(xì)胞減少癥;環(huán)磷酰胺;液質(zhì)聯(lián)用技術(shù);代謝組學(xué);小鼠

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the intervention effects of Huangqi injection on leucopenia model mice. METHODS： Kunming mice were randomly divided into normal group， model group and drug group， with 8 mice in each group. Model group and drug group were given intraperitoneal injection of cyclophosphamide to induce leukopenia model. Normal group was given intraperitoneal injection of equal volume of sterile water. After modeling successfully， normal group and model group were given intraperitoneal injection of equal volume of sterile water; drug group was given intraperitoneal injection of Huangqi injection 0.04 mL/10 g， once a day， for consecutive 7 d. Based on the detection of blood routine indexes （leukocyte， lymphocyte， neutrophil， monocyte count） of mice in each group， the metabolites in serum were analyzed by LC-MS. Principal component analysis （PCA）， partial least squares discriminant analysis （PLS-DA）， orthogonal partial least squares-discriminant analysis （OPLS-DA）， HMDB， METLIN， KEGG and other databases as well as related literatures were used to identify the differential metabolites. The metabolic pathways of differential metabolites were analyzed with MetPA online tools， and the correlation of blood routine indexes and differential metabolites were analyzed on the basis of Pearson correlation coefficient. RESULTS： Compared with normal group， blood rountine indexes of model group were decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， above blood rountine indexes of drug group were all increased siginificantly （P<0.01）. LC-MS chromatogram of serum samples in normal group and model group were significantly different， and LC-MS metabonomics data of serum samples in drug group were similar to those of normal group. Multivariate statistical analysis and correlated database analysis revealed that compared with normal group， serum contents of 17 metabolites as L-isoleucine， eicosapentaenoic acid were increased significantly in model group， while the contents of 4 metabolites as spermidine were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， Huangqi injection could reverse the serum contents of 9 metabolites in mice， such as citric acid， L-proline， acetylcarnitine， L-isoleucine， L-phenylalanine， sphingosine-1-phosphate， lysophosphatidylinositol， eicosapentaenoic acid and linoleic acid （P<0.05 or P<0.01）， which were associated with linoleic acid metabolism， biosynthesis of phenylalanine， tyrosine and tryptophan， and phenylalanine metabolism （metabolism pathway influential values were all higher than 0.1）. Correlation analysis showed that there was a significant correlation between blood routine indexes and the contents of D-sphingosine， linoleic acid and citric acid in model group （the absolute values of r were generally greater than 0.5）. CONCLUSIONS： Huangqi injection can increase the counts of leukocytes， lymphocytes， neutrophils and monocytes in leucopenia model mice. The increase of leukocytes may be related to linoleic acid metabolism， biosynthesis of phenylalanine， tyrosine and tryptophan， and phenylalanine metabolism.

KEYWORDS ? Huangqi injection; Leucopenia; Cyclophosphamide; LC-MS; Metabolomics; Mice

黃芪注射液由單味黃芪藥材經(jīng)水提醇沉工藝制備而成，收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第17冊(cè)）》[1]，具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾利濕等功效，可用于治療心氣虛損、心功能不全和血脈瘀阻之病毒性心肌炎、脾虛濕困之肝炎等癥[1-4]，在臨床上亦可用于治療消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、原發(fā)性腎病綜合征等[5-10]。有研究指出，黃芪注射液在臨床上可作為腫瘤治療的輔助用藥，具有明顯的升高白細(xì)胞的作用[11-14]，但有關(guān)該作用具體機(jī)制的研究報(bào)道較少。本課題組前期采用核磁共振（NMR）代謝組學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液升高白細(xì)胞的機(jī)制可能與其調(diào)控能量代謝、氨基酸代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)和膽堿代謝有關(guān)[15]。但由于生物樣本的復(fù)雜性，代謝物的NMR圖譜通常會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的信號(hào)重疊，加之方法靈敏度相對(duì)較低，使得對(duì)差異代謝物的檢測(cè)不夠全面，故該方法并不適用于分析低含量的代謝物[16]。氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）具有強(qiáng)大的分離能力，且靈敏度較高，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究中[16]?；诖耍狙芯拷柚鶯C-MS代謝組學(xué)的方法對(duì)黃芪注射液升高白細(xì)胞的藥效作用及其具體機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討，以期為該藥的臨床應(yīng)用提供更為充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與軟件

HEMAVET 950FS型動(dòng)物血液分析儀（美國(guó)Drew Scientific公司）;Q Exactive型高分辨LC-MS儀、Xcalibur 3.2工作站軟件、Compound Discoverer 3.0軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;Simca-P 13.0軟件（瑞典Umetrics公司）;KDC-149HR型離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用環(huán)磷酰胺（德國(guó)Baxter Oncology GmbH公司，批號(hào)：8J270A，規(guī)格：1.0 g）;黃芪注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1807163，規(guī)格：每支裝10 mL）;滅菌注射用水（石家莊四藥有限公司，批號(hào)：1903093205，規(guī)格：500 mL）;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠24只，雄性，體質(zhì)量（20±2） g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（晉）2019-0001。所有小鼠均自由攝食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組與給藥

將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和藥物組，每組8只。模型組和藥物組小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺（80 ? ?mg/kg，每日1次，連續(xù)3 d）以復(fù)制白細(xì)胞減少癥模型，正常組小鼠腹腔注射等體積無(wú)菌注射用水。通過(guò)比較模型組、藥物組與正常組小鼠血常規(guī)指標(biāo)[白細(xì)胞（WBC）、中性粒細(xì)胞（NE）、淋巴細(xì)胞（LY）、單核細(xì)胞（MO）計(jì)數(shù)]是否有顯著差異來(lái)判斷模型是否復(fù)制成功[17]。造模成功后，藥物組小鼠腹腔注射黃芪注射液（0.04 mL/10 g，劑量設(shè)置參考本課題組前期研究結(jié)果[15]），正常組和模型組小鼠均腹腔注射等體積滅菌注射用水，每日1次，連續(xù)7 d。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每隔2 d稱定小鼠體質(zhì)量1次，并及時(shí)根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整環(huán)磷酰胺和黃芪注射液的劑量。

2.2 血樣采集

各組小鼠末次給藥并禁食、禁水過(guò)夜后處死，摘取眼球取血適量，置于含乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）的EP管中，用于血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè);同法取血適量，不抗凝，于4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，分離得血清樣品，于-80 ℃條件下保存，用于LC-MS代謝組學(xué)分析。

2.3 小鼠血常規(guī)指標(biāo)水平檢測(cè)

取“2.2”項(xiàng)下各組小鼠經(jīng)抗凝處理的血樣適量，使用動(dòng)物血液分析儀檢測(cè)其WBC、NE、LY、MO計(jì)數(shù)等指標(biāo)。采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果，與正常組小鼠比較，模型組小鼠WBC、NE、LY、MO計(jì)數(shù)均顯著減少（P<0.01）;與模型組比較，藥物組小鼠上述血常規(guī)指標(biāo)均顯著增加（P<0.01），詳見(jiàn)表1。

2.4 小鼠血清樣品LC-MS分析

2.4.1 血清樣品的處理 取“2.2”項(xiàng)下凍存的血清樣品適量，解凍后，精密吸取100 μL，置于EP管中，依次加入甲醇225 μL、乙腈75 μL以沉淀蛋白，渦旋2 min后，于4 ℃下以13 000 r/min離心15 min后，取上清液，待測(cè)。

2.4.2 質(zhì)控（QC）樣品的制備 分別取“2.4.1”項(xiàng)下制備的所有待測(cè)血清樣品各10 μL，混合，即得QC樣品。

2.4.3 LC-MS條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，98%A;2～3 min，98%A→65%A;3～15 min，65%A→30%A;15～18 min，30%A;18～29 min，30%A→2%A;29～31 min，2%A;31～33 min，2%A→98%A;33～35 min，98%A）;柱溫：40 ℃;流速：0.2 mL/min;進(jìn)樣量：5 ? ?μL。離子源：電噴霧離子源（ESI）;采用正、負(fù)離子切換采集模式和Full Scan/dd-MS2掃描模式;正、負(fù)極電壓： ? 3 500 V;毛細(xì)管溫度：320 ℃;鞘氣流速：35 Arb;輔氣流速：10 arb;掃描范圍：m/z 100～1 500。

2.4.4 LC-MS檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性分析 在進(jìn)行小鼠血清樣品LC-MS代謝組學(xué)分析的過(guò)程中，各血清樣品每分析6次，需隨機(jī)檢測(cè)QC樣品1次以監(jiān)測(cè)LC-MS檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。本研究隨機(jī)選擇6只小鼠（下同）的原始檢測(cè)數(shù)據(jù)（即色譜峰峰面積，下同）進(jìn)行分析：將LC-MS原始數(shù)據(jù)的“Raw”格式文件導(dǎo)入Compound Discover 3.0軟件中進(jìn)行提取和預(yù)處理，再將所得數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件進(jìn)行面積歸一化處理后，通過(guò)Simca-P 13.0軟件進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），其得分圖見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，正常組、模型組小鼠血清樣品和QC樣品均分別聚在一起，提示該LC-MS代謝組學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性良好[18]。

2.4.5 代謝物分析 采用“2.4.3”項(xiàng)下LC-MS條件，于正、負(fù)離子模式下采集正常組和模型組小鼠血清樣品的總離子流圖（TIC），詳見(jiàn)圖2、圖3。結(jié)果顯示，代謝物在較短時(shí)間內(nèi)可被很好地分離，且在正、負(fù)離子模式下，正常組和模型組小鼠血清代謝物有所不同?；诖?，本研究進(jìn)一步采用多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)對(duì)正常組和模型組之間的差異進(jìn)行分析。

2.4.6 多元統(tǒng)計(jì)分析 將LC-MS原始數(shù)據(jù)的“Raw”格式文件按“2.4.4”項(xiàng)下方法處理后，使用Simca-P 13.0軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）、PLS-DA和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)分析以尋找差異代謝物。以正常組和模型組比較的OPLS-DA模型所得的變量投影重要度（VIP）值（VIP>1.0）為標(biāo)準(zhǔn)篩選潛在的差異代謝物[19-21]。

首先，對(duì)正常組、模型組、藥物組小鼠的數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，其得分圖見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，藥物組與正常組的數(shù)據(jù)較為接近，且這兩者與模型組數(shù)據(jù)分布在不同象限，提示黃芪注射液對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠代謝紊亂具有一定的回調(diào)作用。

其次，對(duì)正常組和模型組小鼠的血清樣品進(jìn)行PCA，其得分圖見(jiàn)圖5A。由圖5A可知，正常組與模型組小鼠血清中的代謝物均能明顯區(qū)分，表明造模藥物環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠血清內(nèi)源性代謝物產(chǎn)生了明顯的影響。為了驗(yàn)證分類模型的有效性，筆者對(duì)模型進(jìn)行了排列試驗(yàn)驗(yàn)證（n=200），其置換檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5B。由圖5B可知，其中所有的R2和Q2值（分別表示模型的解釋、預(yù)測(cè)能力）都低于原始模型，表明判別模型穩(wěn)定、預(yù)測(cè)能力良好[22]。隨后，對(duì)正常組和模型組小鼠的血清樣品進(jìn)行OPLS-DA，其得分圖見(jiàn)圖5C。由圖5C可知，正常組與模型組小鼠血清中的代謝物可沿縱軸明顯分開(kāi)，說(shuō)明兩組之間有明顯的差異。在通過(guò)Compound Discoverer 3.0軟件獲取代謝物的m/z和準(zhǔn)確分子量后，結(jié)合S-plot圖（圖5D）中的VIP值（VIP>1.0）和t檢驗(yàn)（P<0.05），利用HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、METLIN（http：//enigma.lbl.gov/metlin/）、KEGG（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）等在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行初步分析指認(rèn);最后，通過(guò)與上述在線數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)[21，23]中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比，共鑒定出差異代謝物21個(gè)，詳見(jiàn)表2（表中，保留時(shí)間以正常組樣品為例，各組各代謝物的含量均以歸一化后的峰面積百分比表示）。由表2可見(jiàn)，與正常組比較，模型組小鼠血清中脯氨酰胺、甜菜堿、檸檬酸、L-脯氨酸、乙酰肉堿、煙酰胺、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、1-磷酸鞘氨醇、D-鞘氨醇、1-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇、溶血磷脂酰肌醇、1-十七烷酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿、二十碳五烯酸、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸酐、亞油酸等17個(gè)差異代謝物的含量均顯著升高，而亞精胺、葡萄糖、尿酸、芥酰胺等4個(gè)差異代謝物的含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，黃芪注射液可明顯回調(diào)血清中9個(gè)差異代謝物的含量，分別為檸檬酸、L-脯氨酸、乙酰肉堿、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、1-磷酸鞘氨醇、溶血磷脂酰肌醇、二十碳五烯酸、亞油酸（P<0.05或P<0.01）。

2.5 代謝通路分析

為了尋找與白細(xì)胞減少癥相關(guān)的代謝通路，筆者將“2.4.6”項(xiàng)下所得的21個(gè)差異代謝物導(dǎo)入MetPA在線工具（MetaboAnalyst 3.0，http：//www. Metaboanalyst.ca）中進(jìn)行分析，共尋找到與白細(xì)胞減少癥最相關(guān)的6條代謝途徑[代謝通路影響（Pathway impact）值大于0]，分別為亞油酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，苯丙氨酸代謝，煙酸和煙酰胺代謝，檸檬酸（TCA）循環(huán)，半乳糖代謝，詳見(jiàn)圖6。結(jié)合表2中黃芪注射液可顯著回調(diào)的差異代謝物分析結(jié)果可知，黃芪注射液治療白細(xì)胞減少癥可能與亞油酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，苯丙氨酸代謝等途徑有關(guān)。

2.6 血常規(guī)與差異代謝物的相關(guān)性分析

本研究采用MetPA在線工具計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)以考察血常規(guī)指標(biāo)WBC、NE、LY、MO計(jì)數(shù)與21個(gè)差異代謝物含量之間的相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)圖7（圖中，1～21分別對(duì)應(yīng)表2中的21個(gè)差異代謝物）。由圖7可知，LY計(jì)數(shù)與差異代謝物含量之間的相關(guān)性大于WBC、NE、MO計(jì)數(shù)（前者r的絕對(duì)值普遍大于后三者）;WBC、NE、LY、MO計(jì)數(shù)與模型組中含量降低的差異代謝物芥酰胺、葡萄糖、尿酸、亞精胺含量之間的相關(guān)性均較小（r分別為-0.20～-0.30、-0.16～-0.32、-0.15～-0.31、 ? ?-0.06～-0.48，絕對(duì)值普遍小于0.5），與模型組中含量升高的差異代謝物D-鞘氨醇、亞油酸、檸檬酸含量之間的相關(guān)性均較大（r分別為-0.67～-0.55、-0.68～ ? -0.56、-0.73～-0.49，絕對(duì)值普遍大于0.5）。

3 討論

3.1 黃芪注射液給藥劑量的選擇

黃芪注射液在臨床上的用量為20 mL/d，以成人的體質(zhì)量60 kg計(jì)算，成人用量為3.33×10-4 mL/（g·d），再根據(jù)體表面積換算成小鼠等效劑量為成人的10倍，小鼠用量應(yīng)為3.33×10-3 mL/（g·d）。本課題組前期實(shí)驗(yàn)中采用白細(xì)胞減少癥動(dòng)物模型，考察了給藥劑量分別為3×10-3、4×10-3、5×10-3的黃芪注射液升高白細(xì)胞的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)劑量組均有升高白細(xì)胞的作用，因此在本實(shí)驗(yàn)中選擇了4×10-3 mL/（g·d）的給藥劑量，即每日給藥劑量為0.04 mL/10 g。

3.2 黃芪注射液升高白細(xì)胞的代謝通路分析

3.2.1 亞油酸代謝 亞油酸和油酸是組成細(xì)胞膜的主要成分，其含量升高可能與造血干細(xì)胞的壞死和凋亡有一定關(guān)系[24]。本研究使用環(huán)磷酰胺造模后，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠體內(nèi)亞油酸含量顯著升高，這一結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果[25-27]基本一致，說(shuō)明環(huán)磷酰胺可通過(guò)作用于亞油酸代謝途徑而引起白細(xì)胞減少。給予黃芪注射液后，小鼠體內(nèi)的亞油酸含量顯著降低，提示黃芪注射液可回調(diào)小鼠亞油酸水平，這種回調(diào)作用可能與亞油酸代謝通路有關(guān)。

3.2.2 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成以及苯丙氨酸代謝 氨基酸是蛋白質(zhì)的重要組成部分，氨基酸代謝在氨基酸的生物合成和代謝中起著重要作用，是細(xì)胞增殖、生存和發(fā)育的必經(jīng)途徑[15，21]。已有研究報(bào)道，調(diào)節(jié)氨基酸代謝可作為治療白細(xì)胞減少癥的手段之一[15，21]。苯丙氨酸是人體必需的芳香族氨基酸之一，在正常情況下可以作為氨基酸殘基在人體組織細(xì)胞中參與合成各種蛋白質(zhì)，其也可在肝臟中產(chǎn)生酪氨酸，而酪氨酸可促進(jìn)某些激素和神經(jīng)遞質(zhì)（如多巴胺、腎上腺素和去甲腎上腺素）的分泌[28]。有研究指出，肝臟和腎臟疾病和免疫力、神經(jīng)體液、遺傳和其他因素都有可能引發(fā)苯丙氨酸代謝疾病，因此苯丙氨酸代謝的穩(wěn)定狀態(tài)有助于人體正常生長(zhǎng)發(fā)育和生理機(jī)能的維持[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠體內(nèi)的葡萄糖水平顯著降低，而L-苯丙氨酸水平顯著升高，說(shuō)明環(huán)磷酰胺可引起苯丙氨酸的生物合成發(fā)生變化，與文獻(xiàn)結(jié)果[21，29]基本一致。在給予黃芪注射液后，小鼠體內(nèi)L-苯丙氨酸水平顯著降低，說(shuō)明黃芪注射液可通過(guò)作用于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成及苯丙氨酸代謝通路，發(fā)揮治療白細(xì)胞減少癥的作用。

3.3 血常規(guī)指標(biāo)與差異代謝物的相關(guān)性

白細(xì)胞減少癥以體內(nèi)WBC低于4.0×109 L-1為診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組小鼠的WBC、NE、LY、MO計(jì)數(shù)均顯著減少，說(shuō)明模型復(fù)制成功;給予黃芪注射液后，藥物組小鼠上述血常規(guī)指標(biāo)均顯著增加，說(shuō)明黃芪注射液有升高白細(xì)胞的作用。本研究對(duì)各組小鼠的血清樣品進(jìn)行LC-MS代謝組學(xué)分析，共鑒定出差異代謝物21個(gè)，與正常組比較，模型組小鼠血清中亞精胺、葡萄糖、尿酸、芥酰胺等4個(gè)差異代謝物的含量顯著下降;相關(guān)性分析顯示，下降的差異代謝物含量與血常規(guī)指標(biāo)水平呈正相關(guān)（r普遍大于0），說(shuō)明血常規(guī)的檢測(cè)結(jié)果與代謝組學(xué)的檢測(cè)結(jié)果一致，一定程度上驗(yàn)證了代謝組學(xué)結(jié)果的可靠性。

3.4 NMR代謝組學(xué)結(jié)果與LC-MS代謝組學(xué)結(jié)果比較

本課題組前期采用NMR代謝組學(xué)方法研究黃芪注射液升高白細(xì)胞的作用機(jī)制，找到了差異代謝物19個(gè)，共涉及7條代謝通路[15]。LC-MS代謝組學(xué)與NMR代謝組學(xué)分析結(jié)果相比，有能被兩種方法同時(shí)檢出的差異代謝物（如葡萄糖、甜菜堿、異亮氨酸等），也有只能通過(guò)單一方法檢出的差異代謝物（如乳酸、肌酸、賴氨酸、精氨酸等只能被NMR法檢出，亞油酸、D-鞘氨醇只能被LC-MS法檢出）?？梢?jiàn)，兩種代謝組學(xué)方法結(jié)合使用將有助于更全面地篩選環(huán)磷酰胺致白細(xì)胞減少的差異代謝物。兩種代謝組學(xué)方法分析結(jié)果均涉及到了TCA和半乳糖代謝，同時(shí)也涉及到了其余不同的代謝途徑，亦可將這兩種方法互為補(bǔ)充。

綜上所述，本研究采用LC-MS代謝組學(xué)的方法對(duì)黃芪注射液干預(yù)環(huán)磷酰胺致小鼠白細(xì)胞減少癥的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，確定了模型小鼠血清中21個(gè)差異代謝物，闡明了黃芪注射液升高白細(xì)胞的作用機(jī)制可能是與亞油酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成以及苯丙氨酸代謝等通路有關(guān)。本研究結(jié)果可與之前NMR代謝組學(xué)的結(jié)果相互補(bǔ)充，能更全面地闡明黃芪注射液治療白細(xì)胞減少癥的作用機(jī)制，為該制劑在臨床上用于腫瘤輔助治療提供更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在后續(xù)的研究中，本課題組將采用Western blotting等方法檢測(cè)前文所得代謝通路中一些關(guān)鍵代謝物的表達(dá)情況，對(duì)上述代謝組學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

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（收稿日期：2020-03-21 修回日期：2020-08-20）

（編輯：張?jiān)拢?/p>