硫胺素對(duì)魯氏接合酵母高鹽適應(yīng)性的影響

姚婉婷，李 可，宋 娜，王 慧，盧慧芳，陳 雄，李 沛，姚 娟，代 俊

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

醬油因其獨(dú)特、渾厚、濃郁的風(fēng)味，在食品調(diào)味方面起著十分重大的作用，已成為東方飲食的主要調(diào)味品之一[1]。酵母是產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的主要微生物，在醬油釀造過(guò)程中，具有產(chǎn)醇、產(chǎn)香、增鮮等作用[2]。然而高鹽稀態(tài)釀造醬油是在高鹽條件下進(jìn)行的，因此提高醬油酵母的高鹽適應(yīng)性，是醬油產(chǎn)生高風(fēng)味成分的關(guān)鍵因素之一[3]。魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是一種常用于醬油發(fā)酵的耐鹽芳香型酵母，能代謝產(chǎn)生醇、醛和酯，影響發(fā)酵醬油的風(fēng)味[4]。然而醬油釀造過(guò)程中的鹽脅迫會(huì)減少Z.rouxii的細(xì)胞生長(zhǎng)并影響其發(fā)酵性能，減少風(fēng)味的產(chǎn)生。

為了加速發(fā)酵過(guò)程中香味物質(zhì)的形成，需要提高增香酵母的生物量控制發(fā)酵過(guò)程。因此，提高Z.rouxii的高鹽適應(yīng)性對(duì)于增強(qiáng)醬油發(fā)酵至關(guān)重要。Z.rouxii在鹽脅迫下表現(xiàn)為胞內(nèi)積累鈉離子脅迫和滲透壓脅迫[5]，其耐鹽機(jī)制主要有：一是產(chǎn)生胞內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)物；二是通過(guò)Na+/K+-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶和Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)胞內(nèi)陽(yáng)離子的動(dòng)態(tài)平衡[6]。研究表明，細(xì)胞會(huì)采取一些策略來(lái)抵御鹽脅迫，如調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境、細(xì)胞膜和細(xì)胞代謝等[7]。硫胺素即維生素B1（vitamin B1，VB1），是所有生物體的重要化合物，其功能形態(tài)焦磷酸硫胺素（thiamine diphosphate，TDP）在細(xì)胞代謝中的行使多種輔助功能[8]。據(jù)報(bào)道，TDP依賴(lài)性酶如轉(zhuǎn)酮酶或α-酮戊二酸脫氫酶影響細(xì)胞氧化還原狀態(tài)[9]。LUKIENKOP I等[10]研究發(fā)現(xiàn)，硫胺素能發(fā)揮更直接的作用，其能與自由基潛在相互作用而被氧化，導(dǎo)致三環(huán)硫色素（tricyclic thiochrome）的形成，顯示出抗氧化性質(zhì)。

本研究通過(guò)額外添加一定量的硫胺素，研究Z.rouxii菌株的生理代謝過(guò)程，從而探討在高鹽脅迫下，硫胺素對(duì)魯氏接合酵母高鹽適應(yīng)性的影響，以期為增加食品工業(yè)醬油的風(fēng)味品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）CCTCC M2013310：湖北工業(yè)大學(xué)功能酵母與釀造微生物研究室[4]。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20 g/L。固體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g/L。

1.1.3 試劑

酵母浸粉（生化試劑）：賽默飛世爾科技有限公司；葡萄糖（生化試劑）、氯化鈉（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；硫胺素、三氯乙酸（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；液體樣本甘油含量酶法測(cè)定試劑盒：北京普利萊基因技術(shù)有限公司；腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）酶試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

WFJ2000型可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；YXQ-LS-100SⅡ型高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；5810R型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；SBA-90型生物分析傳感儀：山東省科學(xué)院生物研究所；7890B型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；ZA3300型原子吸收光譜儀：日本HITACHI公司；Ultimate 3000型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魯氏接合酵母種子液的制備

將魯氏接合酵母接種于5 mL YEPD培養(yǎng)基，30 ℃、200r/min條件下培養(yǎng)24h，按5%（V/V）的接種量接種于YEPD培養(yǎng)基，裝液量50 mL/250 mL，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h，作為二級(jí)種子液備用。

1.3.2 硫胺素濃度的確定

由于Z.rouxii在含180 g/L NaCl的YEPD平板上生長(zhǎng)狀態(tài)較差，因此，選用含140 g/L NaCl的YEPD平板探究不同質(zhì)量濃度硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母生長(zhǎng)的影響。

將二級(jí)種子液采用10倍梯度稀釋法稀釋至10-1、10-2、10-3，在加入不同質(zhì)量濃度硫胺素（0、0.5 mg/L、5 mg/L、50 mg/L、0.5 g/L、5 g/L、10 g/L）的含140 g/L NaCl YEPD固體培養(yǎng)基平板上點(diǎn)樣0.8 μL，30 ℃靜置培養(yǎng)60 h，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。

1.3.3 高鹽脅迫下魯氏接合酵母顯微形態(tài)觀察

將二級(jí)種子液按5%（V/V）的接種量分別接種于含有180 g/L NaCl的50 mL YEPD培養(yǎng)基（對(duì)照組）、含有5 g/L硫胺素和180 g/L NaCl的50 mL YEPD培養(yǎng)基中（試驗(yàn)組），30 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵，取不同生長(zhǎng)階段的發(fā)酵液備用。取適量發(fā)酵液涂布于載玻片中央，蓋上蓋玻片在微分干涉對(duì)比（differential interference contrast，DIC）顯微鏡下觀察酵母的形態(tài)特征。

在載玻片中央滴加一滴1 g/L亞甲藍(lán)染液，取適量待觀察菌液置于染液中，混勻后放置3 min，在明場(chǎng)（bright field，BF）鏡頭下觀察細(xì)胞并根據(jù)細(xì)胞顏色區(qū)分死活細(xì)胞。

細(xì)胞周期中取樣點(diǎn)的確定：首先根據(jù)菌株不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線確定其生長(zhǎng)周期各階段；再根據(jù)細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞周期階段中相似的時(shí)間點(diǎn)取樣。對(duì)照組：延滯期時(shí)取樣時(shí)間點(diǎn)為12 h、對(duì)數(shù)期取樣時(shí)間點(diǎn)為36 h、穩(wěn)定期取樣時(shí)間點(diǎn)為72 h；試驗(yàn)組：延滯期取樣時(shí)間點(diǎn)為12 h、對(duì)數(shù)期取樣時(shí)間點(diǎn)為24 h、穩(wěn)定期取樣時(shí)間點(diǎn)為72 h。

1.3.4 測(cè)定方法

生物量的測(cè)定：OD600nm值的測(cè)定：取5 mL發(fā)酵液，5 000 r/min離心10 min，取其上清液作為參比液，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD600nm值。細(xì)胞干質(zhì)量的測(cè)定：稱(chēng)取離心管的質(zhì)量，取5 mL發(fā)酵液于離心管中，5 000 r/min離心10 min，用清水洗滌2次后于80 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，電子天平稱(chēng)離心管和菌體的質(zhì)量，計(jì)算出每毫升發(fā)酵液的細(xì)胞干質(zhì)量。

葡萄糖含量的測(cè)定[11]：采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dini trosalicylic acid，DNS）法。

乙醇濃度的測(cè)定[12]：使用SBA-40C生物傳感器。

甘油含量的測(cè)定[13]：將發(fā)酵液于12 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液待測(cè)胞外甘油含量，菌體用去離子水清洗3次后加入1 mL超純水，加入適量玻璃珠用渦旋儀破碎10 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清液待測(cè)胞內(nèi)甘油含量。使用液體樣本甘油含量酶法測(cè)定試劑盒測(cè)定甘油含量。

胞內(nèi)海藻糖含量的測(cè)定[14]：將發(fā)酵液于12 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，收集菌體，用無(wú)菌水清洗3次，菌體用0.5 mol/L的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）常溫下提取3次，每次20 min。收集3次提取液，稀釋后用硫酸蒽酮法測(cè)定其中的海藻糖含量。

胞內(nèi)鈉鉀比率（Na+/K+）的測(cè)定[15]：采用HITACHI原子吸收光譜儀測(cè)定胞內(nèi)的鈉和鉀離子的濃度。

Na+/K+-ATP酶活性的測(cè)定：采用ATP酶試劑盒[16]。

脂肪酸的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[17]采用GC法。

2-苯乙醇含量的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[18]采用HPLC法。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用Origin 9.0軟件作圖，采用Excel 2010進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度硫胺素對(duì)魯氏接合酵母生長(zhǎng)的影響

硫胺素通過(guò)TDP依賴(lài)性酶如轉(zhuǎn)酮酶或α-酮戊二酸脫氫酶影響細(xì)胞氧化還原狀態(tài)和與自由基的潛在相互作用參與不同抗脅迫的生化反應(yīng)[19]。由于Z.rouxii在含180 g/L NaCl的YEPD平板上生長(zhǎng)狀態(tài)較差，因此選用含140 g/L NaCl的YEPD平板探究不同質(zhì)量濃度硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，外源添加5 g/L、10 g/L的硫胺素對(duì)Z.rouxii細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最大，而添加其他質(zhì)量濃度的硫胺素，促進(jìn)作用不明顯。因此，選擇外源添加5 g/L硫胺素考察其對(duì)Z.rouxii耐鹽脅迫機(jī)制的影響。

圖1 不同質(zhì)量濃度硫胺素對(duì)魯氏接合酵母生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different concentrations of thiamine on growth status of Z.rouxii

2.2 高鹽脅迫下魯氏接合酵母的形態(tài)特征

當(dāng)細(xì)胞所處的外環(huán)境滲透壓驟升時(shí)，水分會(huì)迅速流向低水分活度的胞外環(huán)境，細(xì)胞收縮[20]。使用蔡司顯微鏡DIC觀察Z.rouxii細(xì)胞在有無(wú)5 g/L硫胺素添加的含180 g/L NaCl YEPD培養(yǎng)基中不同生長(zhǎng)階段的形態(tài)變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，Z.rouxii細(xì)胞不運(yùn)動(dòng)，以出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖，在延滯期的形狀趨于球形，直徑＜5 μm，細(xì)胞表面出現(xiàn)褶皺，有許多細(xì)胞聚集成團(tuán)。細(xì)胞的相對(duì)表面積增大，有利于細(xì)胞的物質(zhì)交換從而保護(hù)細(xì)胞。在對(duì)數(shù)期，細(xì)胞拉長(zhǎng)呈橢球形，短徑約5 μm，細(xì)胞表面光滑，出芽率高。在穩(wěn)定期，對(duì)照組的Z.rouxii細(xì)胞大部分呈單細(xì)胞狀態(tài)，出芽現(xiàn)象不明顯；而添加5 g/L硫胺素的Z.rouxii細(xì)胞仍存在出芽現(xiàn)象，細(xì)胞表面更加圓潤(rùn)飽滿(mǎn)。說(shuō)明在180 g/L NaCl的脅迫下，外源添加硫胺素可能會(huì)增加細(xì)胞活力，延緩細(xì)胞的衰老。

圖2 對(duì)照組（a）及試驗(yàn)組（b）魯氏接合酵母不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Cell morphology of Zygosaccharomyces rouxii at different growth stages in control group (a) and test group (b)

使用顯微鏡BF觀察Z.rouxii細(xì)胞分別在有無(wú)5 g/L硫胺素添加的含180 g/L NaCl YEPD培養(yǎng)基中不同生長(zhǎng)階段的亞甲藍(lán)染色情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 對(duì)照組（a）及試驗(yàn)組（b）魯氏接合酵母不同生長(zhǎng)階段的亞甲藍(lán)染色情況Fig.3 Results of methylene blue staining of Zygosaccharomyces rouxii at different growth stages in control group (a) and test group (b)

由圖3可知，Z.rouxii細(xì)胞在延滯期和對(duì)數(shù)期細(xì)胞活力較強(qiáng)，幾乎不被染色；在穩(wěn)定期，部分細(xì)胞呈藍(lán)色或淡藍(lán)色。與添加硫胺素的試驗(yàn)組相比，對(duì)照組中死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞數(shù)目更多。在一定程度上說(shuō)明了外源添加硫胺素增加了Z.rouxii細(xì)胞對(duì)高鹽脅迫的適應(yīng)性，延緩了細(xì)胞的衰老。

2.3 硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和葡萄糖消耗的影響

Z.rouxii發(fā)酵利用葡萄糖的過(guò)程有3種途徑，有氧呼吸生成CO2和H2O，無(wú)氧呼吸生成乙醇或者生成甘油[21]。探究硫胺素的添加對(duì)Z.rouxii細(xì)胞的生長(zhǎng)和葡萄糖消耗的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 硫胺素添加對(duì)魯氏接合酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和葡萄糖消耗的影響Fig.4 Effect of thiamine addition on growth and glucose consumption of Zygosaccharomyces rouxii cells

由圖4可知，對(duì)照組中，Z.rouxii經(jīng)過(guò)24 h的延滯期后細(xì)胞快速生長(zhǎng)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組中葡萄糖的消耗更迅速，Z.rouxii細(xì)胞的延滯期縮短了12 h，穩(wěn)定期時(shí)生物量提高了7.1%。試驗(yàn)組在12 h之前，雖然葡萄糖在消耗，但生物量增加較少；在12 h之后隨著葡萄糖的消耗，生物量迅速增加。這種現(xiàn)象表明，硫胺素的加入促進(jìn)了葡萄糖的消耗；在延滯期，葡萄糖的消耗可能不是用于細(xì)胞的生長(zhǎng)而是用于合成平衡細(xì)胞滲透壓的物質(zhì)。胞內(nèi)生物相容性的物質(zhì)有甘油和海藻糖等，其可以提高酵母在高滲透壓下的生長(zhǎng)，硫胺素是否促進(jìn)葡萄糖的分解代謝用于合成甘油和海藻糖需要進(jìn)一步探討。

2.4 硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母乙醇產(chǎn)量的影響

乙醇對(duì)于醬油香氣的形成有重要作用。優(yōu)化醬油酵母產(chǎn)乙醇條件，提高醬油中乙醇產(chǎn)量，有利于醬油的增香和保存[22]。硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母乙醇產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母乙醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of thiamine addition on ethanol yield of Zygosaccharomyces rouxii

由圖5可知，乙醇在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始積累，當(dāng)葡萄糖消耗完全時(shí)達(dá)到最大濃度。對(duì)照組中，乙醇產(chǎn)量最大達(dá)到2.77 g/L；與對(duì)照組相比，添加硫胺素后，乙醇產(chǎn)量最大達(dá)到4.5 g/L，比對(duì)照組高62.5%。硫胺素焦磷酸在丙酮酸脫羧酶催化丙酮酸脫羧形成乙醛的反應(yīng)中行使輔助因子功能，促使更多的乙醛還原成乙醇。因此，在高鹽脅迫下，外源添加硫胺素能提高Z.rouxii的乙醇產(chǎn)量。

2.5 硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母甘油和胞內(nèi)海藻糖含量的影響

在Z.rouxii中甘油和海藻糖是重要的生物相容性物質(zhì)。甘油由于含有羥基，親水性能好，能有效地維持細(xì)胞內(nèi)水分活度，保護(hù)細(xì)胞免受脫水的侵害，平衡高鹽引起的細(xì)胞內(nèi)外滲透壓[23]。海藻糖是酵母細(xì)胞高滲透壓下的一種典型代謝物質(zhì)，可以保護(hù)細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、核酸和其他生物大分子免受脅迫損傷[12]。硫胺素的添加對(duì)Z.rouxii胞內(nèi)外甘油含量的影響見(jiàn)圖6。

圖6 硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母胞內(nèi)（A）、胞外（B）甘油含量的影響Fig.6 Effect of thiamine addition on intracellular (A) and extracellular(B)glycerol contents of Zygosaccharomyces rouxii

由圖6可知，對(duì)照組中，Z.rouxii在前30 h的適應(yīng)階段，胞內(nèi)甘油的含量都隨著葡萄糖的消耗而有效的合成，在30 h時(shí)達(dá)到最大積累量（81 mg/g菌體干質(zhì)量），在30 h之后細(xì)胞進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段，胞內(nèi)積累的甘油被迅速消耗，可能是用于脂類(lèi)合成或其他保護(hù)性物質(zhì)的合成。試驗(yàn)組中，Z.rouxii菌體胞內(nèi)甘油在前12 h積累并達(dá)到最大積累量（75 mg/g菌體干質(zhì)量），之后也迅速減少，但每克干菌體細(xì)胞的最大胞內(nèi)甘油積累量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。說(shuō)明外源添加硫胺素能促使高滲甘油應(yīng)答途徑[23]中甘油合成的提前，確保遲滯期細(xì)胞產(chǎn)生較多的胞內(nèi)甘油，以平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)高鹽環(huán)境。

由圖6亦可知，試驗(yàn)組中Z.rouxii胞外甘油積累速率比對(duì)照組更快，最高含量比對(duì)照組高59.7%。胞外甘油在細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期積累，在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)中期開(kāi)始消耗，當(dāng)葡萄糖消耗完時(shí)，積累的胞外甘油也消耗完畢。結(jié)合胞內(nèi)外甘油的產(chǎn)量，說(shuō)明外源添加硫胺素能促進(jìn)甘油的合成，至于胞外甘油對(duì)Z.rouxii在高鹽脅迫下能否起到更為長(zhǎng)期的保護(hù)作用需要進(jìn)一步的研究。

硫胺素的添加對(duì)Z.rouxii胞內(nèi)海藻糖含量的影響見(jiàn)圖7。海藻糖作為一種典型應(yīng)激代謝物，其合成分解在Z.rouxii胞內(nèi)是可調(diào)控的。由圖7可知，與對(duì)照組相比，添加了硫胺素的培養(yǎng)基中，海藻糖作為碳源被分解代謝的速率更快，更有效的參與細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝過(guò)程，這可能是由于硫胺素促進(jìn)了糖異生的代謝。在高鹽脅迫下Z.rouxii胞內(nèi)海藻糖積累現(xiàn)象不明顯可能是更多的碳通量流向高滲甘油應(yīng)答途徑或者此時(shí)細(xì)胞內(nèi)又產(chǎn)生其他具有保護(hù)性的物質(zhì)。

圖7 硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母胞內(nèi)海藻糖含量的影響Fig.7 Effect of thiamine addition on intracellular trehalose content of Zygosaccharomyces rouxii

在高鹽脅迫條件下，酵母會(huì)產(chǎn)生相容性滲透調(diào)節(jié)物對(duì)抗脅迫，它們的主要作用是保持水平衡、穩(wěn)定酶系統(tǒng)正常代謝功能以及恢復(fù)正常細(xì)胞容積。甘油和海藻糖是常見(jiàn)的兩種重要滲透調(diào)節(jié)物，也是酵母對(duì)抗高滲脅迫的主要方式。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相比于海藻糖，Z.rouxii主要是依靠甘油的產(chǎn)生和富集來(lái)適應(yīng)高鹽脅迫。特別是在硫胺素添加的鹽脅迫條件下，Z.rouxii胞內(nèi)甘油含量在遲滯期末達(dá)到最高值的時(shí)間比對(duì)照組提前了18 h，表明這段時(shí)期的細(xì)胞迅速產(chǎn)生甘油來(lái)平衡滲透壓，使其迅速適應(yīng)環(huán)境；當(dāng)細(xì)胞適應(yīng)了環(huán)境后，胞內(nèi)甘油也慢慢降到一個(gè)平衡點(diǎn)，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)已趨于穩(wěn)定；胞內(nèi)甘油生產(chǎn)的增加，也伴隨著甘油的溢出，這導(dǎo)致胞外甘油含量持續(xù)增加至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期；當(dāng)葡萄糖被消耗完全后，作替代碳源和能量來(lái)源的甘油也隨之減少。而Z.rouxii胞內(nèi)海藻糖在硫胺素添加的鹽脅迫條件下，一直呈減少趨勢(shì)，在32 h消耗至最低，且消耗速率快于對(duì)照組；值得注意的是，海藻糖在Z.rouxii胞內(nèi)沒(méi)有富集，而是作為一種儲(chǔ)存性的碳源被消耗，在葡萄糖消耗完全時(shí)，胞內(nèi)的海藻糖的含量也達(dá)到最低水平。在對(duì)照組中，甘油和海藻糖的代謝趨勢(shì)也與實(shí)驗(yàn)組類(lèi)似。上述結(jié)果表明，Z.rouxii在面臨鹽脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生并富集甘油而不是海藻糖來(lái)適應(yīng)脅迫，而硫胺素的添加，能促進(jìn)甘油的有效合成，加快海藻糖的代謝，使細(xì)胞能更快適應(yīng)高鹽脅迫條件。

2.6 硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母胞內(nèi)Na+/K+及Na+/K+-ATP酶活性的影響

ATP酶是一類(lèi)分布廣泛的膜結(jié)合蛋白酶，其中Na+/K+-ATP酶在維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡與細(xì)胞膜完整性中起到了重要的作用[16]。Z.rouxii在高鹽脅迫的環(huán)境中，胞內(nèi)Na+的濃度要遠(yuǎn)高于K+的濃度。當(dāng)Z.rouxii細(xì)胞膜上Na+/K+-ATP酶被激活時(shí)，會(huì)將細(xì)胞內(nèi)的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，同時(shí)將細(xì)胞外的K+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。硫胺素添加對(duì)Z.rouxii胞內(nèi)鈉鉀比率（Na+/K+）及細(xì)胞膜上Na+/K+-ATP酶活性的影響見(jiàn)圖8。

圖8 硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母胞內(nèi)Na+/K+（A）及細(xì)胞膜上Na+/K+-ATP酶活性（B）的影響Fig.8 Effect of thiamine addition on Na+/K+(A) in cell and Na+/K+-ATP enzyme activity (B) on cell membrane of Zygosaccharomyces rouxii

由圖8可知，Z.rouxii胞內(nèi)Na+/K+在對(duì)數(shù)期降低，在穩(wěn)定期有所升高。在對(duì)數(shù)期，添加硫胺素的培養(yǎng)基中胞內(nèi)Na+/K+為43.6，比對(duì)照組低11.3%。相反，試驗(yàn)組中Z.rouxii細(xì)胞膜上Na+/K+-ATP酶的活性在對(duì)數(shù)期升高，在穩(wěn)定期有所下降。這是因?yàn)樵诩?xì)胞受到外界脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基含量會(huì)升高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Z.rouxii胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的ROS會(huì)導(dǎo)致膜的氧化損傷，使Na+/K+-ATP酶活性出現(xiàn)下降，胞內(nèi)Na+/K+升高，最終導(dǎo)致細(xì)胞活性下降甚至進(jìn)入凋亡[24]。Z.rouxii在延滯期的Na+/K+-ATP酶活性很低，為0.004 U/mg蛋白，這可能與延滯期菌體生物量少，菌體未適應(yīng)脅迫條件，酶活被抑制有關(guān)。在對(duì)數(shù)期，添加硫胺素的培養(yǎng)基中Na+/K+-ATP酶活性為0.91 U/mg蛋白，比對(duì)照組高361.6%；在穩(wěn)定期，添加硫胺素的培養(yǎng)基中Na+/K+-ATP酶活性為0.59 U/mg蛋白，比對(duì)照組高111.4%（P＜0.05）。在高鹽脅迫下，外源添加硫胺素能增加Na+/K+-ATP酶活性，降低胞內(nèi)Na+/K+，減少Na+對(duì)細(xì)胞的毒害作用從而增加細(xì)胞活性。

2.7 硫胺素添加對(duì)魯氏接合酵母胞內(nèi)脂肪酸組成的影響

脂肪酸鏈的飽和度影響著細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透性[25]，因此，脂肪酸的合成將影響Z.rouxii在含180 g/L NaCl YEPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。硫胺素添加對(duì)魯氏接合酵母胞內(nèi)脂肪酸組成的影響見(jiàn)表1。

表1 硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母胞內(nèi)脂肪酸組成的影響Table 1 Effect of thiamine addition on fatty acid composition in Zygosaccharomyces rouxii cell

由表1可知，Z.rouxii胞內(nèi)的脂肪酸主要有棕櫚酸（C16：0）、棕櫚油酸（C16：1）、硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1）和亞油酸（C18：2）。對(duì)照組中，Z.rouxii胞內(nèi)主要不飽和脂肪酸的含量是總脂肪酸含量的81.07%，主要飽和脂肪酸的含量為17.92%。添加硫胺素的培養(yǎng)基中，Z.rouxii胞內(nèi)主要不飽和脂肪酸含量是總脂肪酸含量的57.82%，主要飽和脂肪酸的含量是36.49%。

與對(duì)照組相比，添加硫胺素后，Z.rouxii細(xì)胞內(nèi)棕櫚油酸（C16：1）、油酸（C18：1）和亞油酸（C18：2）含量分別減少1.21%、17.56%和4.48%，月桂酸（C12：0）、豆蔻酸（C14：0）、棕櫚酸（C16：0）和硬脂酸（C18：0）含量分別增加0.42%、1.12%、10.24%和6.79%，飽和脂肪酸含量提高18.57%，而不飽和脂肪酸含量減少23.25%。外源添加硫胺素使Z.rouxii通過(guò)改變脂肪酸的組成，降低不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例，從而提高了脂肪酸的飽和度，增加了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，避免酵母細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)外滲透差而導(dǎo)致膜的破裂，保證了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，使得細(xì)胞在高鹽脅迫下能夠更好的生長(zhǎng)。

2.8 硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母2-苯乙醇產(chǎn)量的影響

Z.rouxii在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乙醇、高級(jí)醇（如2-苯乙醇）及芳香雜醇類(lèi)物質(zhì)，在高鹽環(huán)境中還能轉(zhuǎn)化糖類(lèi)物質(zhì)生成多元醇（如甘油）及糖醇類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)[26]。2-苯乙醇是發(fā)酵食品中具有玫瑰風(fēng)味的重要風(fēng)味成分之一，若醬油中不含或少含2-苯乙醇類(lèi)的高級(jí)醇，會(huì)使醬油味淡薄，風(fēng)味不足。硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母2-苯乙醇產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖9。

圖9 硫胺素的添加對(duì)魯氏接合酵母2-苯乙醇產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of thiamine addition on 2-phenylethanol production of Zygosaccharomyces rouxii

由圖9可知，對(duì)照組中，Z.rouxii在延滯期的2-苯乙醇產(chǎn)量為4.7 mg/L，對(duì)數(shù)期的2-苯乙醇產(chǎn)量為0.04 g/L，穩(wěn)定期的2-苯乙醇產(chǎn)量為0.05 g/L。添加硫胺素后，Z.rouxii在延滯期的2-苯乙醇產(chǎn)量為5.2 mg/L，對(duì)數(shù)期的2-苯乙醇產(chǎn)量為0.05 g/L，穩(wěn)定期的2-苯乙醇產(chǎn)量為0.07 g/L。與對(duì)照組相比，添加了硫胺素使Z.rouxii的2-苯乙醇產(chǎn)量在對(duì)數(shù)期提高了17.9%，在穩(wěn)定期提高了35.3%。在延滯期，無(wú)論是否添加硫胺素，因?yàn)榫w正處在對(duì)環(huán)境的適應(yīng)階段，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生物量少，代謝產(chǎn)生的2-苯乙醇量低，所以?xún)烧咦兓幻黠@。

在氮源豐富的條件下，細(xì)胞只能通過(guò)莽草酸途徑合成少量的2-苯乙醇[27]。莽草酸途徑中，來(lái)源于糖酵解途徑的磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸戊糖途徑的4-磷酸赤蘚糖經(jīng)一系列酶促反應(yīng)生成2-苯乙醇[28]。硫胺素焦磷酸在3-磷酸甘油醛生成4-磷酸赤蘚糖的轉(zhuǎn)酮酶反應(yīng)中行使輔助因子功能，因此，在高鹽脅迫下，外源添加硫胺素能提高2-苯乙醇在莽草酸途徑上的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，外源添加硫胺素（5 g/L）增加了Z.rouxii細(xì)胞對(duì)高鹽脅迫的適應(yīng)性，增加了細(xì)胞活力，延緩了細(xì)胞的衰老；使高鹽脅迫下細(xì)胞的延滯期縮短了12 h，生物量提高了7.1%；促進(jìn)葡萄糖的分解代謝，使高滲甘油應(yīng)答途徑中甘油的合成提前并提高甘油的產(chǎn)量；促進(jìn)海藻糖分解代謝參于細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝過(guò)程；增加了Na+/K+-ATP酶活性，降低了胞內(nèi)Na+/K+，減少Na+對(duì)細(xì)胞的毒害作用從而增加細(xì)胞活性；通過(guò)改變脂肪酸的組成，降低不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例，從而提高脂肪酸的飽和度，保證細(xì)胞膜的流動(dòng)性，維持細(xì)胞在高鹽脅迫下的生長(zhǎng)。除此之外，硫胺素的添加還提高了62.5%的乙醇產(chǎn)量以及提高了35.3%的2-苯乙醇產(chǎn)量，有利于醬油的增香和保存，提高醬油的風(fēng)味品質(zhì)。

由此可見(jiàn)，硫胺素能增強(qiáng)Z.rouxii的高鹽適應(yīng)性，提高鹽脅迫條件下的生物量，加速發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的形成，結(jié)果將有助于探索醬油發(fā)酵過(guò)程中耐鹽產(chǎn)香酵母風(fēng)味形成的機(jī)理，并改善傳統(tǒng)醬油釀造的營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味。