寒熱型哮喘大鼠支氣管平滑肌鈣通道開放概率的差異

陳志斌 ，吳麗嬌 ，王春娥 ，陳可強(qiáng)

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州350003；2.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建 福州350003）

支氣管哮喘（哮喘）是臨床常見的慢性氣道炎癥性疾病，主要以慢性氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性為特征。 近年來，人們逐漸認(rèn)識到氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells，ASMCs））在哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要性。 ASMCs 不僅具備增殖能力，還可釋放細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和血管生成因子［1］。 此外氣道高反應(yīng)通過 ASMCs 介導(dǎo)，與Ca2+濃度相關(guān)［2］。 氣道平滑肌的收縮依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，并且Ca2+參與平滑肌的興奮耦聯(lián)過程。 支氣管平滑肌細(xì)胞（bronchial smooth muscle cells，BSMCs）是 ASMCs 主要組成部分，維持支氣管正常的舒張收縮功能。 哮喘在中、西醫(yī)診斷中均有各自分型，指導(dǎo)著臨床治療，而大量研究及臨床實(shí)踐證明中西醫(yī)結(jié)合治療療效顯著，因此本課題通過研究哮喘機(jī)制方法區(qū)分中醫(yī)哮喘證型差異性，為哮喘治療提供更精確的診斷依據(jù)。 中醫(yī)哮喘急性期多以寒哮、熱哮型為主，而鈣通道是氣道上細(xì)胞重要的離子通道之一，研究中醫(yī)哮喘證型鈣通道開放概率的差異性對臨床證型診斷有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)通過分離培養(yǎng)寒、熱型哮喘SD 大鼠模型，采用膜片鉗技術(shù)細(xì)胞貼附式方法檢測BSMCs 內(nèi)鈣通道開放概率，研究寒、熱型哮喘大鼠BSMCs 鈣通道變化，探討其在寒熱型哮喘發(fā)病中的意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級5～6 周齡健康雄性大鼠，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2017-0001，動物合格證編號：201908685。 飼養(yǎng)于SPF 級動物實(shí)驗(yàn)室，恒溫恒濕，模擬標(biāo)準(zhǔn)日夜系統(tǒng)（12 h 光照／12 h 黑夜），予以自由飲食及飲水。

1.2 主要試劑 雞卵清白蛋白（VOA）、脂多糖、木瓜蛋白酶（美國 Sigma 公司，貨號：A5503、S0130、P4762）；戊巴比妥鈉（上海隆盛化工有限公司，CAS：57-33-0）；PBS 緩沖液（南京生興生物有限公司，貨號：SN331）；I 型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司，貨號：C8140）；胰酶、牛血清白蛋白（美國 Hyclone 公司，型號：SH30042.01、SH30070.03）；DAB 顯色液、小鼠二抗（丹麥 DAKO 公司，貨號：K3468、K4001）；蘇木素（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，貨號：BA-4097）；氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氫氧化鋁（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，貨號：7447-40-7、10043-52-4、7786-30-3、21645-51-2、21645-51-2）；多聚甲醛（南京化學(xué)試劑股份有限公司，貨號：C0671510223）；HEPES 緩沖鹽水（上海欽誠生物科技有限公司，貨號：QC25-02540）；小鼠一抗（英國 Abcam 公司，貨號：ab7817）。

1.3 主要設(shè)備 霧化機(jī)（廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（美國 Hyclone 公司）；T-25 培養(yǎng)瓶（美國 Corning 公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國 Thermo fisher 公司）；熒光倒置顯微鏡（日本 Nikon 公司）；微電極推制器、BF150-86-10 Sutter 玻璃管（美國Sutter 公司）；膜片鉗放大器、數(shù)模／模數(shù)轉(zhuǎn)換卡、低通濾波器、微型計(jì)算機(jī)軟件（美國Axon 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 參照參考文獻(xiàn)［3-5］。將18 只大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對照組、寒哮組、熱哮組，每組各6 只，自由攝食、飲水7 d 后開始造模。 大鼠分別于造模第1 天和第8 天腹腔注射VOA 和氫氧化鋁混懸液1 mL（雞卵清白蛋白100 mg和氫氧化鋁干粉100 mg 溶于1 mL 的生理鹽水中）致敏誘喘，出現(xiàn)呼吸加快、豎毛、前肢縮抬、點(diǎn)頭呼吸等。① 熱哮組：第1 天和第8 天采用0.4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，用移液管取脂多糖稀釋液40 μL于雙側(cè)鼻孔滴鼻；第15 天開始以1%VOA 溶液超聲霧化，每次30 min，每日1 次，連續(xù)7 d。以大鼠出現(xiàn)煩躁、汗多、口渴、點(diǎn)頭、節(jié)律性收腹樣喘促等現(xiàn)象，提示造模成功。 ② 寒哮組：第15 天開始，將大鼠放入霧化箱內(nèi)，以1%VOA 超聲霧化激發(fā)，每次30 min，每天1 次；同時將大鼠放入寒箱內(nèi)（0～2℃），每次20 min，每天 1 次，連續(xù) 7 d。 將大鼠激發(fā)至哮喘發(fā)作，出現(xiàn)點(diǎn)頭、身體顫抖、節(jié)律性收腹樣喘促現(xiàn)象等，表明造模成功。 造模成功后，繼續(xù)霧化激發(fā)及寒冷刺激4 周。③ 正常對照組：以生理鹽水1 mL 取代卵蛋白生理鹽水混懸液進(jìn)行腹腔注射； 第15 天開始，以生理鹽水超聲霧化激發(fā)。

2.2 支氣管平滑肌的分離 腹腔注射大劑量戊巴比妥鈉將3 組大鼠處死后，將肺取出，置于含雙抗的PBS 緩沖液中漂洗，分離大鼠兩側(cè)肺組織中3～4 級支氣管，剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小的組織塊；加入 2 mg／mL 型膠原酶和 2.5 mg／mL 木瓜蛋白酶，置于 37 ℃培養(yǎng)箱中消化90 min，1 000 rpm 離心8 min，去除上清，加入0.125%胰酶37 ℃消化 5 min，加入含血清的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，1 000 rpm離心8 min，去除上清，加入含血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用100 目篩過濾，用DMEM 培養(yǎng)液反復(fù)沖洗、離心2 次，即可得到含支氣管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液接種至T-25 培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3 d 后，更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞長至80%～90%融合度時，使用胰酶將細(xì)胞消化下來接種至3 個培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2～3 代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 免疫組化鑒定 將分離的大鼠BSMCs 鋪板于培養(yǎng)皿內(nèi)，制作細(xì)胞爬片，培養(yǎng)24 h 后，去除培養(yǎng)液，PBS 緩沖液清洗后加入多聚甲醛固定30 min；吸去多聚甲醛后，PBS 洗3 次后加入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS 洗 3 次，每次 5 min，吸去 PBS 后加 5%牛血清白蛋白（BSA）封閉20 min（封閉電荷）；去除BSA液，每孔加入 100 μL 1∶200 稀釋的一抗，4 ℃過夜，PBS 洗 3 次后每孔加 100 μL 的二抗，37 ℃孵育 30 min；PBS 洗 3 次后，每張切片加 50～100 μL 新鮮配制DAB 溶液，顯微鏡控制顯色；顯色完全后，蒸餾水洗，蘇木素復(fù)染，吸去蘇木素，水洗，鏡下拍照。

2.4 BSMCs 的鈣通道開放概率記錄 運(yùn)用膜片鉗技術(shù)細(xì)胞貼附式方法測定不同Ca2+濃度BSMCs 內(nèi)鈣通道開放概率。 調(diào)節(jié)P-1000 拉制儀參數(shù)（RAMP-20），使得BF150-86-10 中空硅玻璃管入水阻值達(dá)到8.0～10.0 兆歐；從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，置于BSMCs外液（氯化鈉 130 mmol／L、氯化鉀 5 mmol／L、氯化鈣1 mmol／L、氯化鎂 1 mmol／L、HEPES 緩沖鹽水 20 mmol／L，pH7.4）；用微電極電阻約為 3 兆歐，單通道電流經(jīng)膜片鉗放大器放大，探頭反饋電阻為10 千兆歐，低通濾波器濾波頻率為3 kHz。 數(shù)據(jù)采集與分析：由計(jì)算機(jī)軟件控制產(chǎn)生數(shù)字脈沖，經(jīng)數(shù)／模（D／A）轉(zhuǎn)換成模擬脈沖電壓信號， 控制細(xì)胞的膜電位，電流信號通過0.1 千兆歐探頭，經(jīng)膜片鉗放大器的電流電壓轉(zhuǎn)換輸入到模／數(shù)轉(zhuǎn)換卡變成數(shù)字信號，再經(jīng)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)微型計(jì)算機(jī)軟件，采集程序輸入計(jì)算機(jī)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗(yàn)，以［M（P25，P75）］表示。

3 結(jié) 果

3.1 3 組鈣通道開放概率比較 Ca2+濃度為0.5、1、3、10 μmol／L 時，3 組鈣通道開放概率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 Ca2+濃度為 100 μmol／L 時，熱哮組和寒哮組鈣通道開放概率均較正常對照組升高（P 均＜0.01），熱哮組鈣通道開放概率較寒哮組升高更明顯（P＜0.01）。 見表1。

表1 3 組鈣通道開放概率比較［（±s）／M（P25，P75）］

表1 3 組鈣通道開放概率比較［（±s）／M（P25，P75）］

注：與正常對照組比較，1） P＜0.01；與寒哮組比較，2） P＜0.01。

組別正常對照組寒 哮 組熱 哮 組n 6 6 6 0.5 μmol／L 0.12±0.34 0.12±0.27 0.13±0.02 1 μmol／L 0.12±0.53 0.15±0.01 0.12±0.02 Ca2+濃度3 μmol／L 0.17±0.04 0.18±0.37 0.21±0.40 10 μmol／L 0.35（0.23，0.52）0.46（0.36，0.46）0.42（0.37，0.43）100 μmol／L 0.45（0.42，0.55）0.58（0.56，0.61）1）0.68（0.61，0.70）1）2）

4 討 論

ASMCs 參與哮喘氣道炎癥、氣道重塑及氣道高反應(yīng)性的發(fā)生與發(fā)展過程。 目前，對于哮喘研究大多集中于整個氣道，而針對BSMCs 的研究較少涉及。鈣通道是引起氣道平滑肌收縮的主要通道［6］，游離鈣是細(xì)胞內(nèi)第二信使，細(xì)胞的存活及其功能的維持依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+的精密調(diào)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高對ASMCs 起維持和收縮作用。 鈣通道開放增加，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，引起氣道平滑肌收縮［7］，而氣道平滑肌的收縮增強(qiáng)被認(rèn)為可能是哮喘發(fā)生氣道高反應(yīng)的重要原因，臨床上應(yīng)用支氣管擴(kuò)張劑可改善哮喘發(fā)作引起氣道攣急、呼吸困難等癥狀，進(jìn)一步說明了氣道高反應(yīng)與ASMCs 收縮有關(guān)。哮喘患者ASMCs 鈣通道開放增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加可使得哮喘患者氣道的ASMCs 處于無收縮的活性增加狀態(tài)，從而導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，此時輕微的刺激即可誘發(fā)氣道的痙攣［8］。 祖國醫(yī)學(xué)將哮病急性發(fā)作期分為熱哮、寒哮兩個證型［9］，寒哮治以宣肺散寒、化痰平喘為主，熱哮治以清熱宣肺、化痰定喘為主，二者的治法存在明顯區(qū)別。 同為哮喘病，中醫(yī)分型治法卻明顯不同，寒哮、熱哮是否為哮喘病的2 個亞型？ 在不同鈣濃度分布下鈣通道開放概率兩者是否存在差異性？ 因此，本試驗(yàn)運(yùn)用膜片鉗技術(shù)細(xì)胞貼附式方法檢測寒、熱型哮喘SD 大鼠BSMCs 內(nèi)鈣通道開放概率的變化，探討寒哮、熱哮之間的差異。

本研究結(jié)果表明：隨著Ca2+濃度的增加，寒、熱型哮喘大鼠鈣通道開放概率也不斷地增加，熱哮組、寒哮組較正常對照組鈣通道開放概率增加明顯，說明鈣通道開放概率的變化可作為哮喘的分型指標(biāo)。當(dāng) Ca2+濃度為 100 μmol／L 時，寒、熱型哮喘大鼠的鈣通道開放概率增加程度較正常對照組明顯，且熱哮組鈣通道開放概率較寒哮組明顯增加，說明寒、熱型哮喘大鼠在不同鈣濃度下鈣通道開放概率有本質(zhì)上的差異。 因此，鈣通道開放概率明顯增加，臨床應(yīng)考慮熱哮的可能，鈣通道開放概率輕度增加時，臨床上應(yīng)考慮寒哮的可能。 今后，我們將進(jìn)一步深入研究，探討鈣通道開放概率對寒、熱哮診斷的具體折點(diǎn)，以期通過對鈣通道開放概率的測定，作為寒熱哮的診斷指標(biāo)。