采煤塌陷地抗生素抗性基因污染現(xiàn)狀與機(jī)理分析

袁 濤，程 森，路 平，瞿 旭

(1.江蘇建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州221116；(2.中國礦業(yè)大學(xué) 環(huán)境與測繪學(xué)院，江蘇 徐州221116)

0 引言

抗生素是微生物在生活過程中產(chǎn)生的能夠抗病原體的物質(zhì)，還被用作飼料添加劑和獸藥。目前它們被越來越多地用于畜禽養(yǎng)殖，以治療感染和促進(jìn)生長，其生產(chǎn)量、使用量均得到了快速增長。我國是抗生素生產(chǎn)和使用大國，抗生素濫用現(xiàn)象十分嚴(yán)重，使用的抗生素包括紅霉素、慶大霉素、諾氟沙星和阿莫西林等，不能完全被動物吸收，大部分會伴隨動物的糞便和尿液釋放到環(huán)境中。如果這些糞便沒有得到正確的處理，抗生素殘留物便會直接釋放進(jìn)入土壤，通過淋溶、滲濾等方式遷移到其他環(huán)境介質(zhì)，造成環(huán)境中抗生素的廣泛存在，并誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。

根據(jù)2017年聯(lián)合國環(huán)境署發(fā)布的《2017前沿報告》和2019年中國工程院戰(zhàn)略咨詢中心發(fā)布的《全球工程前沿》報告，抗生素抗性基因(ARG)是一種新興環(huán)境污染物，ARG的遷移是生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域科學(xué)研究前沿。雖然ARG普遍存在于環(huán)境[1]，來自家庭、醫(yī)院、制藥系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)徑流等方面的抗菌化合物被釋放到環(huán)境中后，將會與自然細(xì)菌群落發(fā)生直接接觸，從而演變出更多的耐藥細(xì)菌?？股睾蜕蛩剡x擇壓力下，加劇了細(xì)菌耐藥性，例如超級細(xì)菌金黃色葡萄球菌(MRSA)和肺炎克雷伯菌等菌。根據(jù)英國媒體發(fā)布的奧尼爾勛爵(Lord O’Neill)報告，到2050年，每年因ARG而死亡的人數(shù)可達(dá)1 000萬人，甚至高于當(dāng)今癌癥造成的死亡。我國對ARG的傳播問題越來越重視。中國政府相繼出臺了《遏制細(xì)菌耐藥國家行動計劃(2016-2020年)》，《中國兒童合理使用抗菌藥物行動計劃(2017-2020)》、《2017年動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測計劃》，旨在從國家、社會各層面出發(fā)，多領(lǐng)域入手，遏制細(xì)菌耐藥，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，維護(hù)人民群眾的身體健康。

采煤塌陷區(qū)較多采取漁業(yè)、農(nóng)業(yè)復(fù)墾。水產(chǎn)/畜禽養(yǎng)殖、糞肥/污水灌溉、生活污水排放等產(chǎn)生大量抗生素，在大氣降水沖刷下，匯集于采煤塌陷低洼積水區(qū)底質(zhì)。底質(zhì)成為環(huán)境中抗生素及抗生素抗性基因(ARG)的重要儲存庫[2]，污染地表水和地下水，危害城鄉(xiāng)供水安全[3]。更可怕的是，底質(zhì)中細(xì)菌長期暴露于抗生素的選擇壓力之下，加劇抗生素抗性基因(ARG)廣泛傳播和擴(kuò)散，可能嚴(yán)重降低抗生素療效，對公眾健康、生態(tài)系統(tǒng)健康構(gòu)成威脅，并且，阻礙礦區(qū)土地復(fù)墾和生態(tài)修復(fù)進(jìn)程，成為可持續(xù)發(fā)展的制約性因素。通過對我國東部煤礦采煤塌陷地土壤與地下水調(diào)查，檢出5類抗生素(四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、奎諾酮類、青霉素類、磺胺類和林可霉素類)，鐵、錳、鉻、鎘、砷等重金屬，硫酸鹽和氟化物等無機(jī)鹽，12種揮發(fā)性有機(jī)物，13種半揮發(fā)性有機(jī)物等污染物質(zhì)。宏基因組測序顯示evgS、macB、sav1866、ethA、katG等多種ARG在采煤塌陷地淺層地下水被檢出，最高相對豐度達(dá)3.90×102PPM。地下水中抗生素耐藥細(xì)菌不動桿菌屬Acinetobacter相對豐度高達(dá)55.53%，Acinetobacter是感染人類的重要致病菌，可引起呼吸道感染、敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、傷口及皮膚感染、泌尿生殖道感染等，重癥者可導(dǎo)致死亡。

國內(nèi)外均有ARG污染地下水的報道[4]，尤其我國多個城市地下水[5]、鄉(xiāng)村井水[6]、畜禽養(yǎng)殖區(qū)井水[7]、垃圾填埋場地下水[8]，存在大量的ARG，豐度范圍在102-1011copies/L。歐洲地下水發(fā)現(xiàn)多種ARGs(tetO、ampC、ermB、vanA、mecA和blaSHV-5等)，絕對豐度在 104- 108copies/L之間。垃圾填埋場賦存大量ARG，調(diào)查發(fā)現(xiàn)周圍地下水共檢測到近200種ARG，絕對豐度在109- 1011copies/L數(shù)量級之間[8]。全國城市地下水也存在ARG污染現(xiàn)象，主要包括四環(huán)素類ARG、磺胺類ARG，絕對豐度約在103-1011copies/L之間不等[5]。鄉(xiāng)村的井水是當(dāng)?shù)刂匾乃矗幸卜蛛x到的廣譜抗菌藥耐藥基因[6]?？偹苤?，畜禽養(yǎng)殖是ARG重要排放源，但是其地下水環(huán)境中ARGs的分布情況鮮為報道。我國某畜禽場地下水四環(huán)素類、磺胺類等ARG豐度約為102-105copies/L數(shù)量級之間[7]。一些研究認(rèn)為可能是土壤中ARG通過降雨入滲從地表運(yùn)輸?shù)降叵滤校?，ARG從地表遷移到地下水的路徑和遷移機(jī)理尚不明確。多數(shù)研究僅報道了ARG的總體豐度，沒有進(jìn)一步區(qū)分ARG是存在于微生物細(xì)胞內(nèi)的DNA(胞內(nèi)ARG)，還是以游離態(tài)DNA存在于細(xì)胞外的無機(jī)環(huán)境(胞內(nèi)ARG)。然而，胞內(nèi)ARG和胞外ARG在生態(tài)環(huán)境中的遷移行為截然不同，污染地下水的機(jī)理不明，將從以下幾方面做簡要分析：

1 ARG的胞間轉(zhuǎn)移與分配影響地下水污染

ARG通常包含在質(zhì)粒或整合子中，可通過水平基因轉(zhuǎn)移到細(xì)菌體內(nèi)(胞內(nèi)ARG)，或存在于無機(jī)環(huán)境中(胞外ARG)。ARG在細(xì)胞之間的水平轉(zhuǎn)移與動態(tài)分配通過以下方式實現(xiàn)：兩個實際接觸的細(xì)胞交換遺傳信息；噬菌體將細(xì)菌遺傳信息由供體菌向受體菌轉(zhuǎn)移；受體菌捕獲胞外DNA片段獲得遺傳信息[9]。大量研究表明水平轉(zhuǎn)移受到很多因素影響：抗生素被認(rèn)為是環(huán)境中抗生素抗性基因最直接最主要的選擇壓力，研究抗生素與ARGs的豐度之間的相關(guān)性至關(guān)重要[10-12]；因為重金屬的存在促進(jìn)金屬與抗生素之間的金屬橋連作用，從而可能以某種方式降低抗生素的選擇壓力和豐富度，重金屬是影響ARGs分布與遷移的重要因素[13-21]；越來越多的證據(jù)都表明可移動元件的多樣性與ARGs的多樣性之間的關(guān)系是緊密相關(guān)的，相同可移動元件的相對豐度與ARGs的相對豐度之間也具有非常顯著的相關(guān)性，可移動元件例如I類整合子intI1被發(fā)現(xiàn)是城市湖泊中抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移傳播中非常重要的媒介，可移動元件還有質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子、基因組島、整合性結(jié)合元素、插入序列、插入序列共有區(qū)、噬菌體和基因轉(zhuǎn)移劑等等，對環(huán)境中可移動元件的控制可以看作是控制ARGs傳播行之有效的途徑[22-23]；各種金屬納米顆粒對于環(huán)境中抗性基因的影響越來越顯現(xiàn)，例如納米氧化鋁和納米氧化鈦 可以促進(jìn)ARGs的共軛轉(zhuǎn)移，銅納米顆?？稍鰪?qiáng)ARG的共軛轉(zhuǎn)移和共軛轉(zhuǎn)移頻率，金屬納米顆粒也是決定ARGs遷移的重要影響因素[24]；除了抗生素的應(yīng)用之外，非抗生素抗菌化學(xué)藥品的使用量更大，導(dǎo)致非抗生素抗菌化學(xué)藥品在更廣泛的環(huán)境中殘留量很高，因此非抗生素抗菌化學(xué)藥品選擇微生物對抗生素的耐藥性中的潛在作用創(chuàng)造了必要條件[25-27]。此外，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成是ARG分布和富集的主要決定因素[28-29]。碳、氮、硫等元素是微生物生長的物質(zhì)基礎(chǔ)，直接或間接影響和介導(dǎo)ARG的胞間分布：例如從糞肥到生物堆肥，土壤中發(fā)現(xiàn)tetW、tetQ、tetL、tetM和tetX等基因與總氮，總有機(jī)碳、水分、pH和碳氮比正相關(guān)；無機(jī)碳、溶解有機(jī)碳等理化參數(shù)通過對細(xì)菌存活的影響來介導(dǎo)ARGs的遷移轉(zhuǎn)化；大量研究發(fā)現(xiàn)垃圾填埋場的氮會顯著促進(jìn)目標(biāo)ARGs 的水平升高，畜禽養(yǎng)殖場環(huán)境介質(zhì)中總氮、總磷與intl1、sul、tet Q等眾多目標(biāo)基因有顯著相關(guān)性[30-33]，可見碳、氮等元素通過控制細(xì)菌的存活[34]或改變細(xì)胞膜通透性[35]影響ARG胞間分布。相比之下，硫?qū)RG水平轉(zhuǎn)移與胞間分布的研究十分有限，然而硫元素對微生物群落多樣性具有重要作用，僅有文獻(xiàn)報道硫在淹水條件下促進(jìn)根際特異性耐性細(xì)菌生長而富集ARG。任何能夠引起微生物群落結(jié)構(gòu)改變的因素都會在群落水平上影響ARG的分配，因此需要針對不同環(huán)境條件開展特異性研究。

2 ARG的界面吸附與滯留制約地下水污染

胞內(nèi)ARG沒有直接與環(huán)境介質(zhì)發(fā)生吸附與釋放，應(yīng)針對ARG宿主微生物開展界面作用研究。研究表明微生物表現(xiàn)出復(fù)雜的界面相互作用：微生物表面性質(zhì)、微生物疏水性，細(xì)胞外聚合物(例如蛋白質(zhì)、脂多糖、細(xì)胞外多糖)，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)(例如菌毛和鞭毛)，細(xì)胞形狀，吸附介質(zhì)表面性質(zhì)、溶液理化性質(zhì)通過改變微生物或吸附介質(zhì)表面電荷、雙電層電位、或保留位點(diǎn)等，影響微生物在固-液界面吸附與釋放[36]。并且微生物的表面特性會根據(jù)細(xì)胞對環(huán)境條件的應(yīng)變而變化[37]。有必要進(jìn)行更多的研究以更好地量化和預(yù)測微生物尤其是ARG宿主微生物，與異質(zhì)環(huán)境表面的相互作用。

環(huán)境介質(zhì)中攜帶ARG的游離胞外DNA，數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于胞內(nèi)ARG[38]。不過，由于胞外DNA穩(wěn)定性較差且易被天然受體菌捕獲[39]，對胞外ARG的吸附滯留研究較少。有限研究表明，pH 值對天然受體菌捕獲胞外ARG有顯著影響[40]，而間接影響胞外ARG的吸附作用。有待開展更多環(huán)境因素對胞外ARG的吸附作用的研究，還應(yīng)該關(guān)注天然受體菌群與環(huán)境介質(zhì)的相互作用。

3 ARG在多孔介質(zhì)環(huán)境的垂向遷移導(dǎo)致地下水污染

胞內(nèi)ARG以ARG宿主微生物為載體遷移。由于流體流動，與固-液界面弱結(jié)合的微生物受到流體動力，再次滑動或脫離，通過流體在環(huán)境介質(zhì)中遷移[41]。ARG在多孔介質(zhì)，如土壤和底質(zhì)的移動是物理過程、地球化學(xué)過程和生物過程的耦合作用結(jié)果。有限的研究表明微生物在固-液界面上分離進(jìn)而遷移受到微生物在界面的吸附解吸行為、流場水動力條件[42]和水化學(xué)條件的影響[43]。

此外，土壤或沉積物顆粒表面附著的微生物群落形成生物膜，可以保護(hù)常駐生物，免受環(huán)境壓力的影響，因此會顯著影響微生物在土壤和含水層中的傳播[44]。尚未發(fā)現(xiàn)微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)對胞內(nèi)ARG或宿主微生物遷移的作用研究。

由于對流運(yùn)輸和抑制性DNA核酸酶的效率降低，具有生物活性的無細(xì)胞DNA，如細(xì)胞外游離的ARG可以在土壤環(huán)境中運(yùn)輸[45]，且可在環(huán)境中持續(xù)長達(dá)數(shù)年的時間[46]，因此被傳遞[47]。對胞外ARG在環(huán)境中的遷移研究甚少，尤其是向地下水的垂向遷移研究更少。對ARG的阻控研究發(fā)現(xiàn)隨著污水通過處理流程，胞內(nèi)ARG數(shù)量減少而胞外ARG數(shù)量增加[48]，垂直砂濾去除研究同樣發(fā)現(xiàn)胞外ARG在砂柱中的垂直遷移能力明顯高于胞內(nèi)ARG[49-52]。這些研究表明無細(xì)胞的胞外ARG在自然環(huán)境具有強(qiáng)大的遷移擴(kuò)散能力。但是，并不能證明胞外ARG的獨(dú)自遷移能力是出水中胞外ARG數(shù)量增加的唯一原因，因為在遷移過程若發(fā)生ARG的胞間轉(zhuǎn)移和再分配也會導(dǎo)致出水中胞外ARG數(shù)量增多。因此，有待開展多孔介質(zhì)胞外ARG的垂向遷移機(jī)制研究。

4 小結(jié)與展望

為了推動礦區(qū)生態(tài)修復(fù)、土地復(fù)墾、水土資源合理開發(fā)利用，面向國家重大發(fā)展方向“全面推進(jìn)采煤塌陷區(qū)改造轉(zhuǎn)型”、“開展典型受損生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)”，針對采煤塌陷地ARG污染，圍繞當(dāng)?shù)匚锢?、化學(xué)和生物特征，環(huán)境研究領(lǐng)域需要了解、揭示抗生素抗性基因相關(guān)的風(fēng)險，并提出遏制細(xì)菌耐藥行動的內(nèi)容和重點(diǎn)方向，可在以下幾方面開展相關(guān)研究：

(1) 統(tǒng)一環(huán)境介質(zhì)中ARG的豐度表達(dá)方式?？筛鶕?jù)采用的測序技術(shù)，將絕對豐度表示為copy/cell，或根據(jù)相對豐度表示成PPM。

(2) 胞內(nèi)ARG的遷移與滯留以ARG宿主細(xì)菌為載體，而胞外ARG是游離于細(xì)胞外的DNA遷移，因此，需區(qū)分細(xì)胞內(nèi)ARG和細(xì)胞外ARG，明確ARG在胞間的動態(tài)分配機(jī)理，分別開展二者在環(huán)境介質(zhì)的界面吸附與遷移行為研究。

(3) 雖然大量報道發(fā)現(xiàn)地下水受到ARG的污染，但是缺乏ARG向地下水的遷移研究，并不清楚胞內(nèi)ARG和胞外ARG污染地下水的遷移路徑和機(jī)制。