大蒜素對(duì)白色念珠菌毒力因子作用機(jī)制的研究

熊延靖，吳艷紅，陳 京

（皖南醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與醫(yī)學(xué)免疫學(xué)教研室，安徽蕪湖 241002）

白色念珠菌Candida albicans是常駐于人體內(nèi)的一種條件致病性真菌。目前隨著抗癌藥物、HIV感染、免疫抑制劑的大量使用等引起的免疫功能下降,以及侵入性治療如血透、插管技術(shù)等廣泛應(yīng)用,均可能造成全身或局部真菌感染。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì),侵襲性念珠菌病在全球范圍內(nèi)已達(dá)25萬人/年,死亡案例超過5萬［1］,并且已成為重癥監(jiān)護(hù)室重癥感染的首要病因［2］。由于抗真菌藥物本身的不良反應(yīng),同時(shí)藥物的不合理應(yīng)用導(dǎo)致的耐藥問題亦日趨嚴(yán)重［3］,給抗感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)。因此,尋找新型高效、廣譜、低毒的抗真菌藥物具有重要意義。

大蒜素是從百合科植物大蒜Allium sativumL.的鱗莖中提取的含硫有機(jī)化合物的主要有效成分［4］。研究顯示大蒜素對(duì)多種細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等均具有良好的抑制作用,被譽(yù)為天然廣譜抗生素藥物［5］。本研究旨在探討大蒜素對(duì)白色念珠菌毒力因子的作用機(jī)制,以期闡明大蒜素的抗真菌作用機(jī)制,為豐富大蒜素的臨床應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)；同時(shí)拓寬大蒜素的應(yīng)用價(jià)值,加快傳統(tǒng)中醫(yī)藥的發(fā)展。

1 材料

1.1 供試菌株 白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：AX2-2086,購自廣州市微生物研究所。臨床分離念珠菌4株,CA1、CA2、CA3、CA4。經(jīng)科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基和酵母樣真菌鑒定卡鑒定為白色念珠菌。所有菌株均連續(xù)在改良沙氏固體培養(yǎng)基中接種2次,保持菌株活力,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與藥物 二甲基亞砜 （DMSO,美國Sigma公司,批號(hào)D2650）；RPMI-1640培養(yǎng)基（批號(hào) BL303A）、PBS磷酸鹽緩沖液 （批號(hào)BL302A）（北京Biosharp公司）；葡萄糖 （批號(hào)F20190509）、甘露醇（批號(hào)20190321）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蛋白胨（北京Solarbio公司,批號(hào)P8450）；營(yíng)養(yǎng)肉湯（北京Solarbio公司,批號(hào)N8300）；瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號(hào)01-023）；卵黃乳液（青島海博生物技術(shù)有限公司,批號(hào)HB8295）；科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基（批號(hào)CA220）、酵母樣真菌鑒定卡（批號(hào)21343）（法國-生物梅里埃公司）。RNA提取試劑盒（美國Omega公司,批號(hào)R6870-01）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司,批號(hào)RR047A）；qRTPCR試劑盒 （瑞士 Roche公司,批號(hào)6402712001）；引物（上海生工生物工程有限公司合成）。大蒜素（江蘇正大清江制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H32025683,批號(hào)190307）。

1.3 儀器 BECKMAN Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼公司）；THERMOFISHER IMH100隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermofisher公司）；微量培養(yǎng)板 （96孔、6孔；美國Coring公司）；ESCO CLASSⅡBSC生物安全柜（新加坡艾斯克公司）；ZQZY-VS2恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；ELGA Purelabflex 2純水機(jī)（英國埃爾格公司）；FA2004型電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；雙目顯微鏡、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；BioDrop核酸蛋白分析儀（英國柏點(diǎn)公司）；Biotek Eon全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；Roche lighelycler 96熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）。

1.4 培養(yǎng)基制備

1.4.1 改良沙氏培養(yǎng)基 葡萄糖40 g、蛋白胨10 g,加入雙蒸水定容至1 L,112 ℃高壓滅菌15 min,待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右時(shí)加入青霉素20 U/mL、鏈霉素40 U/mL,即為改良沙氏液體培養(yǎng)基。若制備改良沙氏固體培養(yǎng)基,則在上述改良沙氏液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g再高壓滅菌。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 Spider培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯10 g、甘露醇10 g、K2HPO42 g,加入雙蒸水定容至1 L,調(diào)整培養(yǎng)基pH 7.2 （25 ℃）,121 ℃高壓滅菌20 min,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 卵黃乳液瓊脂培養(yǎng)基 NaCl 5.73 g、蛋白胨1 g、葡萄糖3 g、CaCl20.055 g、瓊脂粉2 g,加入雙蒸水定容至100 mL。121 ℃高壓滅菌20 min,待高壓鍋溫度降至70 ℃時(shí),立即取出并加入10%卵黃乳液混勻。在培養(yǎng)基中分別加入不同濃度大蒜素（終濃度為1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC）,混勻后分裝至無菌培養(yǎng)皿,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 菌液制備 將白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株分別接種于改良沙氏固體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h后,挑取培養(yǎng)基中單克隆菌落,轉(zhuǎn)種至5 mL改良沙氏液體培養(yǎng)基,于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,使白色念珠菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。經(jīng)麥?zhǔn)媳葷峁芗把?xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),以RPMI-1640培養(yǎng)液將菌液調(diào)整至濃度為2×106CFU/mL,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 藥液制備 將大蒜素溶解于DMSO中,再用RPMI-1640培養(yǎng)液作倍比稀釋,使其質(zhì)量濃度依次為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大蒜素對(duì)白色念珠菌的最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）推薦的真菌敏感性檢測(cè)方法CLSI-M27-A3［6］,采用微量液基稀釋法中的操作步驟進(jìn)行并略作改良。

用RPMI-1640培養(yǎng)液將白色念珠菌菌液濃度稀釋至2×103CFU/mL。將上述濃度的大蒜素依次加入96孔微量培養(yǎng)板中,每孔100 μL,并設(shè)生長(zhǎng)對(duì)照孔（RPMI-1640培養(yǎng)液100 μL+菌液100 μL,無大蒜素）和空白對(duì)照孔 （RPMI-1640培養(yǎng)液200 μL,無菌液,無大蒜素）,每個(gè)濃度均設(shè)3復(fù)孔。將配制好的菌液加入相應(yīng)孔中,每孔100 μL,使得每一梯度藥液和菌液分別被1 ∶1稀釋至終濃度。將96孔微量培養(yǎng)板置37 ℃溫箱靜置培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。以上實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間重復(fù)3次。

結(jié)果判斷采用視覺法,肉眼觀察孔內(nèi)菌株生長(zhǎng)情況,與不含藥物的空白對(duì)照孔比較,觀察到生長(zhǎng)完全抑制、培養(yǎng)基清亮所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為MIC。

2.4 白色念珠菌時(shí)間-殺菌曲線 采用不同時(shí)間點(diǎn)取樣點(diǎn)板計(jì)數(shù)的方法繪制大蒜素對(duì)白色念珠菌的時(shí)間-殺菌曲線。選取白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AX2-2086和臨床菌株CA2為試驗(yàn)菌株（下同）。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟為：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌,用沙氏改良液體培養(yǎng)基稀釋菌液濃度為2×106CFU/mL。以各試驗(yàn)菌株的MIC值為依據(jù),設(shè)置大蒜素終濃度依次為 1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC。將白色念珠菌菌液2 mL加入無菌試管中,再依次加入不同濃度大蒜素。同時(shí)設(shè)立不加藥物的空白對(duì)照組。混勻后置37 ℃,200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、2、4、8、12、24 h時(shí)取10 μL菌液按10倍倍比稀釋,取100 μL稀釋液均勻涂布于改良沙氏固體培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)算菌落數(shù)目。以時(shí)間點(diǎn)為橫軸,以不同時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)的菌落數(shù)的對(duì)數(shù)為縱軸,繪制時(shí)間-殺菌曲線。

2.5 大蒜素對(duì)白色念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響 檢測(cè)大蒜素對(duì)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AX2-2086和臨床菌株CA2在Spider液體培養(yǎng)基中形態(tài)轉(zhuǎn)化能力的影響。用Spider液體培養(yǎng)基將白色念珠菌稀釋至2×106CFU/mL。將菌液和不同濃度大蒜素分別加入6孔板中,大蒜素終濃度分別為1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC。同時(shí)設(shè)立不加藥物的空白對(duì)照孔。37 ℃靜置孵育6 h。取出孔板,在倒置顯微鏡明場(chǎng)下觀察白色念珠菌菌絲形成情況并拍照。

2.6 qRT-PCR檢測(cè)大蒜素對(duì)菌絲相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.6.1 總RNA提取 將大蒜素與菌液混勻,置37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,收集菌體,用無菌PBS緩沖液清洗3次后提取總RNA,按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6.2 引物設(shè)計(jì)與合成 所用引物序列見表1,由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR

2.6.3 cDNA制備 根據(jù)TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書操作。第一步,RNA 1 μg,5×gDNA Eraser Buffer 2 μL,gDNA Eraser 1 μL,加RNase Free dH2O至10 μL,反應(yīng)條件為42 ℃2 min；第二步,取第一步反應(yīng)液10 μL,Master Mix 10 μL,反應(yīng)條件為37 ℃15 min,85 ℃5 sec。

2.6.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 按照試劑盒說明,制備反應(yīng)體系見表2。將所有試劑加好后,置于熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃600 s；擴(kuò)增定量程序?yàn)?5 ℃10 s,60 ℃15 s,72 ℃20 s,擴(kuò)增程序?yàn)?5個(gè)循環(huán)；熔解曲線65～95 ℃。每個(gè)樣品平行3次。

表2 RT-PCR反應(yīng)體系Tab.2 Reaction system of RT-PCR

2.6.5 定量分析 qRT-PCR分別測(cè)定的目的基因和內(nèi)參基因的CT值,將實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值,計(jì)算并統(tǒng)計(jì)。最后基因表達(dá)水平用2-△△CT法進(jìn)行分析。

2.7 大蒜素對(duì)白色念珠菌細(xì)胞外磷脂酶活性的影響 分別取白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AX2-2086和臨床菌株CA2的菌液（1×107CFU/mL）1 μL,滴加在含有不同濃度大蒜素（終濃度為1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC）的卵黃乳液瓊脂培養(yǎng)基中,同時(shí)設(shè)置不加藥物的空白對(duì)照組。將培養(yǎng)基置37 ℃培養(yǎng)4 d后,白色念珠菌在平板上形成菌落,并在菌落周圍形成乳黃色不透明的沉淀圈。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用游標(biāo)卡尺測(cè)定菌落直徑和沉淀圈（含菌落）直徑。細(xì)胞外磷脂酶活性用Pz表示,Pz=d1/d2,其中,d1為菌落直徑,d2為沉淀圈直徑。 Pz值越小,表明磷脂酶活性越強(qiáng),反之則活性越弱。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理,計(jì)量資料以（）表示,組間差異比較采用單因素方差分析檢驗(yàn),P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大蒜素對(duì)白色念珠菌的MIC值 采用CLSIM27-A3推薦的微量稀釋法,經(jīng)過3次重復(fù)體外藥物敏感性試驗(yàn),大蒜素對(duì)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AX2-2086的MIC為25 μg/mL。對(duì)于臨床分離菌株,大蒜素的MIC為12.5～25 μg/mL。結(jié)果見表3,表明,大蒜素對(duì)白色念珠菌具有良好的抑菌作用。后續(xù)選用白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AX2-2086和臨床菌株CA2作為試驗(yàn)菌株。

表3 大蒜素對(duì)白色念珠菌的MIC值（μg/mL）Tab.3 MIC values of allicin to C.albicans（μg/mL）

3.2 大蒜素對(duì)白色念珠菌的時(shí)間-殺菌曲線 時(shí)間-殺菌曲線可以反映各時(shí)間點(diǎn)藥物的抑菌或殺菌作用。本實(shí)驗(yàn)通過計(jì)數(shù)平板上白色念珠菌單克隆菌落的數(shù)量,并根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出原始CFU。結(jié)果表明,2 MIC和4 MIC濃度的大蒜素對(duì)白色念珠菌保持有效的抑制作用,1 MIC濃度組也具有一定的抑制作用。但是1/4 MIC濃度組未顯示明顯抑制作用,這與大蒜素對(duì)白色念珠菌的MIC值結(jié)果基本相符,見圖1。

圖1 大蒜素對(duì)白色念珠菌的時(shí)間-殺菌曲線Fig.1 Time-kill curve of allicin against C.albicns

3.3 大蒜素抑制白色念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化 菌絲是白色念珠菌最主要的致病因子之一,酵母相-菌絲相形態(tài)轉(zhuǎn)化也是其生物被膜形成的重要一步［7］。通過倒置顯微鏡觀察大蒜素對(duì)白色念珠菌菌絲形成的影響,結(jié)果見圖2。在Spider液體培養(yǎng)基中,未經(jīng)藥物處理的白色念珠菌能在6 h內(nèi)形成較長(zhǎng)且密的菌絲,錯(cuò)綜復(fù)雜,相互纏繞重疊。當(dāng)加入1 MIC濃度大蒜素時(shí),視野內(nèi)可觀察到菌絲長(zhǎng)度明顯變短,且與對(duì)照組比較數(shù)量明顯減少。而4 MIC濃度則能夠基本抑制菌絲的生長(zhǎng),鏡下觀察以酵母相細(xì)胞為主。這一現(xiàn)象表明,大蒜素可以抑制白色念珠菌由酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)化,且這種抑制作用具有劑量依賴性,即隨著藥物濃度的升高,抑制作用更加明顯。

3.4 大蒜素對(duì)白色念珠菌菌絲相關(guān)基因表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較,經(jīng)1 MIC、2 MIC和4 MIC濃度的大蒜素干預(yù)后,參與正向調(diào)控白色念珠菌菌絲生長(zhǎng)的基因RAS1、 CDC35、 EFG1的表達(dá)均明顯下降,而負(fù)向調(diào)控菌絲生長(zhǎng)的基因PDE2的表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3,結(jié)果顯示,大蒜素對(duì)白色念珠菌菌絲生長(zhǎng)的作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)菌絲形成相關(guān)基因的表達(dá),從而抑制菌絲的形成。

圖2 大蒜素對(duì)白色念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響（×400）Fig.2 Effect of allicin on morphological transition of C.albicans（×400）

圖3 大蒜素對(duì)白色念珠菌菌絲相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of allicin on gene expression of C.albicanshyphae

3.5 大蒜素抑制白色念珠菌細(xì)胞外磷脂酶活性卵黃乳液瓊脂平板法是檢測(cè)細(xì)胞外磷脂酶的經(jīng)典方法［8］。在結(jié)果觀察中,菌落直徑代表菌細(xì)胞數(shù)目的多少,沉淀圈直徑代表磷脂酶催化的沉淀產(chǎn)物的量,兩者直徑比值（Pz）可近似反映單位細(xì)胞數(shù)量的磷脂酶活性。 Pz越低,反映磷脂酶產(chǎn)生越多,活性越強(qiáng)。圖4表明,白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AX2-2086和臨床菌株CA2均能分泌較高活性的磷脂酶。加入濃度為1/4 MIC大蒜素未能明顯改變磷脂酶活性,菌體仍能分泌活性較高的磷脂酶。當(dāng)大蒜素濃度≥1/2 MIC時(shí),與空白對(duì)照組比較,白色念珠菌細(xì)胞外磷脂酶的活性降低,Pz逐漸升高。結(jié)果表明,大蒜素可以抑制白色念珠菌細(xì)胞外磷脂酶的活性。

4 討論

目前,應(yīng)用于臨床的抗真菌藥物數(shù)量和種類有限,但是由于臨床上有限抗真菌藥物的大量使用,導(dǎo)致真菌耐藥性的情況日益嚴(yán)重,而且出現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象［9］。其中白色念珠菌是臨床最常見的條件致病性真菌。白色念珠菌在體內(nèi)最主要的致病原因在于宿主免疫功能受損導(dǎo)致的不受控制的增殖。過度的增殖導(dǎo)致白色念珠菌毒力因子的釋放,進(jìn)而對(duì)機(jī)體造成危害［10］。白色念珠菌的毒力因子主要包括粘附、分泌酶、形態(tài)轉(zhuǎn)化、生物被膜的形成等等。

圖4 大蒜素對(duì)白色念珠菌細(xì)胞外磷脂酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of allicin on the activity of phospholipase of C.albicans

在白色念珠菌的毒力因子中,形態(tài)轉(zhuǎn)化是最主要也是最吸引注意力的一種。白色念珠菌是一種二相性真菌,從形態(tài)上分為酵母相和菌絲相。在相關(guān)誘導(dǎo)因素的刺激下,白色念珠菌能經(jīng)歷酵母相和菌絲相的相互轉(zhuǎn)化。在被感染宿主體內(nèi)的病灶部位,2種形態(tài)的白色念珠菌都能被發(fā)現(xiàn)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在小鼠系統(tǒng)性感染中,多種菌絲形成缺陷的白色念珠菌突變體,其毒力是減弱的［11］。因此,如果能抑制白色念珠菌形態(tài)的轉(zhuǎn)化,或許能抑制其毒力和感染性。

Spider培養(yǎng)基常被用來評(píng)估白色念珠菌維持菌絲生長(zhǎng)的能力［12］。在本實(shí)驗(yàn)中,將白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AX2-2086和臨床菌株CA2接種到Spider液體培養(yǎng)基中,鏡下觀察發(fā)現(xiàn)白色念珠菌形成細(xì)長(zhǎng)的錯(cuò)綜復(fù)雜的菌絲。加入大蒜素后可抑制菌絲的形成,甚至基本抑制白色念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化,使其停留在酵母相。

Ras-cAMP-Efg1途徑是調(diào)節(jié)白色念珠菌由酵母相到菌絲相轉(zhuǎn)化的重要信號(hào)通路之一,其中第二信使cAMP是重要的調(diào)控分子。cAMP由Cdc35酶合成,Pde2酶降解［13］?；駿FG1編碼的菌絲生長(zhǎng)蛋白是目前研究最深入的多功能調(diào)節(jié)因子之一,它可以正向調(diào)節(jié)菌絲的形成過程,并在生物膜形成過程中起著中心作用［14］。為驗(yàn)證大蒜素對(duì)白色念珠菌菌絲形成的作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過qRTPCR檢測(cè)了菌絲相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,大蒜素能夠下調(diào)與菌絲形成正相關(guān)基因（RAS1、 CDC35、 EFG1）,并上調(diào)菌絲形成負(fù)相關(guān)基因（PDE2）的表達(dá)。

細(xì)胞外磷脂酶是白色念珠菌重要的毒力因子之一,磷脂酶的高表達(dá)與小鼠播散性念珠菌病具有顯著相關(guān)性,而磷脂酶缺陷的白色念珠菌突變體在小鼠系統(tǒng)性感染模型中的毒力是減弱的［15-16］。本實(shí)驗(yàn)通過卵黃乳液瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定大蒜素對(duì)白色念珠菌細(xì)胞外磷脂酶活性的作用,發(fā)現(xiàn)加入大蒜素后,白色念珠菌分泌磷脂酶活性降低,表明大蒜素能夠有效地抑制白色念珠菌細(xì)胞外磷脂酶活性,從而發(fā)揮抗真菌作用。

綜上所述,大蒜素可通過抑制白色念珠菌菌絲生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)菌絲相關(guān)基因的表達(dá),以及抑制細(xì)胞外磷脂酶活性等,從而發(fā)揮抑制白色念珠菌毒力因子的作用。這將為拓寬大蒜素潛在的臨床用途奠定了基礎(chǔ)。但大蒜素對(duì)體內(nèi)白色念珠菌毒力因子的干預(yù)效應(yīng)尚有待于進(jìn)一步揭示。