HPLC-CAD法測定中成藥中甜味劑及其蜂蜜類輔料的質量評價

王亞瓊，張華鋒，周 堅

（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇蘇州 215104）

口服液中可作為甜味劑的輔料有糖漿、甜菊糖、蜂蜜等多個種類,甜菊糖因口感、糖漿因工藝復雜、甜度難以控制等原因,大部分的口服制劑仍以蔗糖應用最為廣泛。2015年版《中國藥典》 中合劑項下要求：除另有規(guī)定外,含蔗糖量應不高于20%［1］。另外蜂蜜作為蜜丸、煎膏劑及蜜汁飲片中重要的輔料,在我國中藥產業(yè)中使用廣泛。然而,近年來蜂蜜摻偽的現(xiàn)象較為嚴重,間接對中藥的質量造成了不良影響［2-3］。判定蜂蜜是否摻偽,則需要結合處方量考察果糖、葡萄糖及麥芽糖的含有量及相關比值［4］。

電噴霧檢測器（CAD）是一種新型的HPLC通用質量型檢測器,可應用于各種非揮發(fā)或者半揮發(fā)化合物的檢測,特別適合糖類等無紫外吸收或紫外吸收很弱的天然產物的分析［5］。與傳統(tǒng)糖類分析使用的質量型檢測器蒸發(fā)光散射檢測器和示差檢測器相比,CAD靈敏度、重現(xiàn)性更好［6］。故本研究先就HPLC-CAD及HPLC-ELSD 2種方法進行比較,使用更優(yōu)HPLC-CAD方法測定了果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及乳糖的含有量,并應用于中成藥中甜味劑的測定及蜂蜜類輔料的質量評價。

1 材料

Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀配Corona Veo電噴霧檢測器（美國Thermo Fisher公司）；UFLC型LC-20島津高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Alltech 3300 ELSD蒸發(fā)光散檢測器（瑞士Buchi公司）；AG245電子天平（瑞士Mettler公司）。

果糖對照品（批號100231-201606,純度99.7%）、 D-無水葡萄糖對照品（批號110833-201506,純度99.9%）、蔗糖對照品（批號111507-201704,純度100%）、麥芽糖對照品（批號100287-201604,純度94.4%）及乳糖（批號100058-201605,純度94.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；水 （美國 Millpore公司）；色譜乙腈 （美國Honeywell公司）。

中成藥中甜味劑的測定樣品來源于2018年國家藥品評價性抽樣小兒咳喘靈口服液114批及顆粒劑184批,其余樣品來自江蘇省藥品抽樣及蘇州市藥品抽樣。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Hon-Sugar色譜柱 （250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相乙腈-水（75 ∶25）；體積流量1 mL/min；柱溫35 ℃。Corona電噴霧檢測器,采集頻率10 Hz,濾光片1 s,霧化器溫度設定值為high。ELSD檢測器,霧化氣體積流量1.8 L/min；漂移管溫度95 ℃,增益1。CAD圖見圖1。

2.2 對照品貯備液制備 分別精密稱取果糖、葡糖糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖對照品各1 g,加水定容于50 mL,置4 ℃密封貯藏。

2.3 供試品溶液制備 精密量取小兒咳喘靈口服液1 mL,加水稀釋并定容至20 mL,濾過,即得小兒咳喘靈口服液供試品溶液。取蜜丸類樣品,剪碎,取約1 g,精密稱定后置50 mL量瓶中,加水約40 mL,超聲（350 W,40 kHz）15 min,放冷,加水至刻度,搖勻,濾過,即得蜜丸類樣品供試品溶液。取蜜制飲片樣品,粉碎,取約1 g,同蜜丸類樣品制備供試品溶液。

2.4 線性關系考察 精密量取不同體積的果糖、葡糖糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖對照品貯備液至同一量瓶中,加水稀釋至刻度,配成系列質量濃度的果糖、葡糖糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖混合對照品溶液。在“2.1” 項色譜條件下分別進樣,以各對照品峰面積（Y）對其質量濃度（X）,并計算回歸方程。逐級稀釋對照品貯備液,在“2.1” 項色譜條件下分別進樣,以3倍信噪比估算檢測限。結果見表1。

2.5 精密度試驗 取3種質量濃度的混合對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下連續(xù)進樣6次,計算各組分的平均RSD,HPLC-CAD法測定果糖、葡糖糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖含有量的精密度分別為3.34%、4.19%、3.03%、3.57%、4.07%,HPLC-ELSD法測定果糖、葡糖糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖含有量的精密度分別為1.53%、3.26%、1.83%、3.45%、3.21%。表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取小兒咳喘靈口服液的供試品溶液6份,按“2.3” 項下制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,HPLC-CAD法測定果糖、葡萄糖、蔗糖含有量RSD分別為2.10%、3.21%、4.04%,HPLC-ELSD法測定果糖、葡萄糖、蔗糖含有量RSD分別為4.79%、1.04%、4.26%。表明該方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取小兒咳喘靈口服液的供試品溶液,分別放置0、2、4、8、16、24 h后,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,計算各組分RSD,結果HPLC-CAD法測定果糖、葡萄糖、蔗糖RSD分別為3.96%、4.24%、3.93%。HPLC-ELSD法果糖、葡萄糖、蔗糖RSD分別為4.31%、4.48%、4.92%。表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取小兒咳喘靈口服液的供試品溶液,分別精密加入約等量對照品適量,濾過,在“2.1”項色譜條件下進樣,測得回收率均在95%～105%之間,結果見表2。

2.9 樣品含有量測定 114批小兒咳喘靈口服液蔗糖含有量介于0～15.53%,均未超過2015年版《中國藥典》 中合劑項下規(guī)定的限度20%。但其中17批樣品,涉及5家生產企業(yè)的蔗糖含有量高于3%,同時HPLC-UV法測出甜菊糖的含有量均低于定量限0.026 ng/mL。推測這些批次的樣品中矯味劑以蔗糖為主,與執(zhí)行標準處方描述“加入甜菊糖” 為矯味劑不一致。184批小兒咳喘靈顆粒劑樣品中蔗糖含有量不同生產企業(yè)差別較大,蔗糖含有量介于2.14%～87.13%。結果表明不同企業(yè)在顆粒劑制粒環(huán)節(jié)中輔料的用量差別較大。制粒過程中輔料使用比例過大,導致浸膏量比例減少,建議標準中明確浸膏的相對密度及加入量,控制制劑中輔料的比例。見圖2～3。

圖1 小兒咳喘靈制劑中各成分CAD色譜圖

圖2 不同生產企業(yè)小兒咳喘靈制劑中蔗糖含有量頻數(shù)分布圖

圖3 不同生產企業(yè)蔗糖含有量箱式圖

表3 加煉蜜的中成藥及飲片中糖類含有量推算標準

2015年版《中國藥典》 一部“蜂蜜” 項下規(guī)定,蜂蜜中含蔗糖及麥芽糖分別不得過5.0%,果糖與葡萄糖的總量不得少于60.0%,果糖與葡萄糖含有量比值不得小于1.0。按不同成藥及飲片炮制的煉蜜用量折算,結果見表3。據(jù)參考文獻［2-3］中均提出藥材中含有蔗糖,因此蔗糖含有量不予考慮。加煉蜜的中成藥及飲片中糖類測定結果顯示,果糖與葡萄糖含有量比值均大于1.0,麻仁潤腸丸中麥芽糖的含有量超標,蛇膽川貝枇杷膏中輔料為蜂蜜,因處方量未公開,無法推算限度,但麥芽糖含有量偏高。根據(jù)含有量推算標準麻仁丸、疏風活絡丸及蜜制款冬花的果糖與葡萄糖的總量均小于推算限度,可確定煉蜜質量存在一定問題。見表4、圖4。

表4 加煉蜜的中成藥及飲片中糖類含有量（%）

圖4 加煉蜜的中成藥及飲片中各成分CAD色譜圖

3 討論

糖類的分析方法有很多種,早期的有光度法、容量分析法等,目前,液相色譜法、氣相色譜法、PMP衍生法等,新技術有氣相-質譜連用、液相-質譜連用、核磁法、超臨界流體等也用于糖類分析［7-12］。在藥物分析領域中應用較為普遍的是液相法分離,ELSD和示差檢測器檢測,由于示差檢測器對環(huán)境高,不能梯度分離樣品,同時穩(wěn)定性也受多個因素影響,不適合于大批量樣品的分析,因此,本研究比較了HPLC-ELSD法和新型HPLC-CAD法的差異,CAD法比ELSD法的線性范圍更寬廣,靈敏度也更高,穩(wěn)定性也非常適合大批量樣品長時間的進樣。同時,在儀器維護方面,由于CAD直接連接氮氣為載氣,低溫分析,長時間分析穩(wěn)定性高,而ELSD空氣泵易產生水汽,長時間分析干燥管變色,檢測池進水后將無法繼續(xù)分析。

本研究采用HPLC-CAD法測定了國家評價性抽樣中小兒咳喘靈口服液及顆粒劑中甜味劑的含有量,發(fā)現(xiàn)部分企業(yè)違規(guī)采用非標準規(guī)定的矯味劑投料；并對普通抽樣中部分中成藥及飲片中蜂蜜類輔料進行質量評價,發(fā)現(xiàn)部分中成藥中加入的煉蜜質量存在一定的問題。HPLC-CAD法樣品提取方法簡單快捷,分析方法穩(wěn)定可靠,以期為中成藥中甜味劑的測定及中成藥及飲片中蜂蜜類輔料的質量評價提供參考。