鳳香型酒醅微生物群落演替及其與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

陳 雪，張永利，閆宗科，孟勤燕，齊 歡，李浩浩，賈智勇

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西 鳳翔 721406）

中國白酒可分為清香型、醬香型、濃香型、鳳香型等12 種香型[1]。鳳香型白酒以乙酸乙酯為主，己酸乙酯和高級醇為輔，具有醇香秀雅、諸味諧調(diào)的特點(diǎn)，鳳香型白酒的獨(dú)特性與其生產(chǎn)工藝和微生物群落息息相關(guān)。

自2005年以來，隨著科學(xué)的發(fā)展，以羅氏公司454測序技術(shù)、Illumina公司Solexa測序技術(shù)和ABI公司的Solid測序技術(shù)為代表的高通量測序技術(shù)相繼誕生，并廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物群落的宏基因組研究中[2]，包括食醋[3]、魚露[4]、牛奶[5]、酸肉[6]、米酒[7]、濃香[8]和清香白酒[9-10]等。在白酒領(lǐng)域利用高通量測序?qū)︶劸莆⑸锶郝涞难芯恳仓饾u增加，已有研究[11-13]關(guān)于洋河濃香白酒發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及其與有機(jī)酸合成的相關(guān)性，找到與有機(jī)酸合成相關(guān)的7 個(gè)菌屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、酵母屬（Saccharomyces）、Naumovozyma、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜冷芽孢桿菌屬（Psychrobacillus）和根霉屬（Rhizopus）。黃蘊(yùn)利等[14]研究了醬香型白酒第2輪次發(fā)酵過程中微生物多樣性，檢測堆積和窖池發(fā)酵中的細(xì)菌和真菌，酒醅中主要優(yōu)勢菌屬為Lactobacillus、Saccharomyces、假絲酵母屬（Candida）、青霉菌屬（Penicillium）、鐮孢霉屬（Fusarium）。王雪山[15]分析不同環(huán)境清香類型白酒發(fā)酵微生物種群結(jié)構(gòu)比較及溯源解析，采用高通量測序得到酒醅中主要的細(xì)菌種群包含Lactobacillus、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Kroppenstedtia、魏斯氏菌屬（Weissella）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），真菌種群主要包含畢赤酵母屬（Pichia）、Candida、Kazachstania、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、Saccharomyces、維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）和曲霉屬（Aspergillus）。但鳳香型白酒釀造微生物群落的研究尚鮮有報(bào)道，對微生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、多樣性以及動(dòng)態(tài)變化情況等方面認(rèn)識仍然不足。

本研究以鳳香型白酒發(fā)酵過程中酒醅為對象，通過高通量測序技術(shù)解析不同發(fā)酵時(shí)間的酒醅微生物群落組成，評價(jià)微生物群落多樣性與理化指標(biāo)的相關(guān)性。以期為更好了解研究鳳香型白酒的釀造機(jī)理提供理論依據(jù)，對鳳香型白酒的提質(zhì)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣：西鳳酒903制酒車間，圓窖期間3月份的重點(diǎn)窖酒醅。分別按入池0、4、7、10、14、18、22 d和30 d（出窖）時(shí)間跟蹤取樣8 次，記為J0d、J4d…J30d。用取樣器依次取上層、中層和下層酒醅（每層取3 個(gè)區(qū)域的點(diǎn)樣混合，見圖1），將3 層的樣品進(jìn)行混合，放于－20 ℃冰箱保存。

0.1 mol/L NaOH溶液、1%酚酞溶液、0.2%葡萄糖溶液、斐林氏甲液、斐林氏乙液、10 g/L次甲基藍(lán)指示劑美國Sigma公司。

圖1 取樣位點(diǎn)示意圖Fig. 1 Schematic of sampling sites

1.2 儀器與設(shè)備

DH-2000R高速臺式冷凍離心機(jī) 上海德洋意邦儀器有限公司；D-78224超聲水浴清洗儀 德國Elma公司；AB204-E分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅理化指標(biāo)的檢測

酸度、淀粉、還原糖測定：參照DB 34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》；溫度測定：用測溫計(jì)測量取樣點(diǎn)附近的溫度。

1.3.2 酒醅微生物多樣性檢測

將酒醅樣品送北京奧維森基因科技有限公司，利用ITS2 MiSeq PE300平臺進(jìn)行高通量測序分析。提取酒醅微生物總基因組后，分別對基因組的16S V3-V4區(qū)和ITS2（ITS3-ITS4）區(qū)擴(kuò)增子測序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

2.1.1 真菌

2.1.1.1 真菌菌群測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表1 酒醅真菌菌群測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Statistical analysis of fungal community sequencing data of fermented grains

如表1所示，得到每個(gè)樣品所對應(yīng)的分類序列條數(shù)（tag數(shù)），通過歸類操作，將每個(gè)樣品序列按照彼此的相似性分歸為許多可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。其中發(fā)酵30 d真菌的OTU數(shù)最高為58，所有樣品共有的真菌OTU數(shù)為27。發(fā)酵過程中酒醅樣本的Chao1指數(shù)在50.15～78.38之間，Shannon指數(shù)在1.80～3.26之間。發(fā)酵30 d的Shannon指數(shù)最高，達(dá)到3.26（Shannon指數(shù)越高，多樣性越高），說明出池酒醅的微生物多樣性遠(yuǎn)高于發(fā)酵期酒醅。發(fā)酵過程中氧逐漸被消耗，產(chǎn)生酸和乙醇，對有些微生物起到抑制作用，所以發(fā)酵中期多樣性指數(shù)較低。所有樣本的覆蓋率（Coverage）在0.999 5～0.999 7之間，測序結(jié)果能完整反映西鳳酒酒醅真菌菌群組成信息。

2.1.1.2 發(fā)酵過程中真菌群落的演替規(guī)律

圖2 門水平下真菌群落結(jié)構(gòu)組成分布Fig. 2 Distribution of fungal community structure at phylum level

如圖2所示，整個(gè)發(fā)酵過程中有子囊菌門（Ascomycota）、毛霉亞門（Mucoromycota），其中Ascomycota占絕對優(yōu)勢。已有研究表明，Ascomycota不僅是鳳香型酒醅中優(yōu)勢真菌種群，同樣也是醬香型白酒及食醋等多種發(fā)酵食品中的主要真菌種群。

圖3 屬水平下真菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig. 3 Distribution of fungal community structure at genus level

西鳳酒酒醅發(fā)酵過程中共檢測出33 個(gè)屬的真菌微生物，真菌群落屬水平的演替規(guī)律如圖3所示，其中主要存在11 個(gè)真菌類群：Naumovozyma、Rhizopus、熱子囊菌屬（Thermoascus）、Aspergillus、Candida、Pseudeurotium、Saccharomycopsis、Pichia和Saccharomyces、Kregervanrija、Penicillium。發(fā)酵過程中主要優(yōu)勢菌為Rhizopus、Naumovozyma、Thermoascus、Candida、Pichia、Pseudeurotium和Saccharomyces。其中Naumovozyma占絕對優(yōu)勢，相對豐度為8.77%～66.69%，發(fā)酵前期增殖迅速，成為優(yōu)勢菌株，在11 d相對豐度達(dá)到峰值，發(fā)酵后期逐漸降低。Rhizopus相對豐度為0.39%～24.87%；Rhizopus、Aspergillus在發(fā)酵前期占據(jù)優(yōu)勢地位，隨著氧氣的耗盡、溫度的升高呈下降趨勢，在18 d短暫回升，發(fā)酵后期再次下降至發(fā)酵結(jié)束。Saccharomyces相對豐度為0.24%～3.30%，發(fā)酵前期繁殖迅速，在動(dòng)態(tài)穩(wěn)定期成為第二優(yōu)勢菌株，主要完成乙醇發(fā)酵；在發(fā)酵后期（22 d）急劇降低并保持在很低水平。Thermoascus相對豐度為0.27%～9.65%；從初始9.65%（0 d）下降至0.43%（11 d），后處于較低水平。Candida相對豐度為0.62%～4.57%，在發(fā)酵初始和發(fā)酵結(jié)束時(shí)相對豐度為3.5%～4.5%，發(fā)酵過程中較低。Pichia相對豐度為0.05%～6.18%，在發(fā)酵中后期波動(dòng)增加。Pseudeurotium相對豐度為0.33%～6.75%，發(fā)酵中波動(dòng)增加，增幅較小。

2.1.2 細(xì)菌

2.1.2.1 細(xì)菌菌群測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表2 酒醅細(xì)菌菌群測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistical analysis of bacterial community sequencing data of fermented grains

酒醅細(xì)菌菌群測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析見表2，每個(gè)樣品所對應(yīng)的分類序列條數(shù)（tag數(shù)）最終為25 415，發(fā)酵4 d的OTU數(shù)最高為314，所有樣品共有的OTU數(shù)為43。發(fā)酵過程中酒醅樣本的Chao1指數(shù)在88.37～345.58之間，Shannon指數(shù)在0.53～5.55之間，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，Shannon指數(shù)降低，說明發(fā)酵過程中低氧、低pH值以及高乙醇的不利條件，使得許多細(xì)菌受到抑制。所有樣本的Coverage在0.997 2～0.999 1之間，測序結(jié)果能完整反映西鳳酒酒醅細(xì)菌菌群組成信息。

2.1.2.2 酵過程中細(xì)菌群落的演替規(guī)律

如圖4所示，西鳳酒發(fā)酵酒醅中細(xì)菌分屬5 個(gè)門類，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和Saccharibacteria。其中Firmicutes占絕對優(yōu)勢。

圖5 屬水平下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig. 5 Distribution of bacterial community structure at genus level

西鳳酒發(fā)酵酒醅中共檢測出183 個(gè)屬的細(xì)菌微生物，如圖5所示，西鳳酒發(fā)酵酒醅中主要存在22 個(gè)細(xì)菌類群，分別為Lactobacillus、片球菌屬（Pediococcus）、Bacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Weissella、地桿菌屬（Pedobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）等。入池酒醅的細(xì)菌群落以Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus、Staphylococcus、Weissella、Acetobacter等為主。

發(fā)酵過程中主要優(yōu)勢菌為Lactobacillus、Weissella、Streptomyces、Pediococcus，其中Lactobacillus占絕對優(yōu)勢，相對豐度為23.98%～98.9%，發(fā)酵前期逐漸增多占據(jù)絕對優(yōu)勢，在發(fā)酵后期相對豐度保持在90%以上。Weissella相對豐度為0.13%～6.29%，從初始的6.29%下降至0.17%（11 d），后期保持在一個(gè)較低的水平。Streptomyces相對豐度為0.05%～5.53%，在發(fā)酵7 d升高隨后降低并在11 d后保持在0.9%以下。Pediococcus相對豐度為0.15%～13.82%，從初始的13.82%下降至0.75%（11 d），并在發(fā)酵后期保持在較低水平，這可能與發(fā)酵過程中環(huán)境因素的變化有關(guān)，隨著發(fā)酵進(jìn)行窖池逐漸進(jìn)入?yún)捬鹾透邼B環(huán)境，不利于片球菌的生長繁殖。

綜合以上，西鳳酒酒醅真菌以Naumovozyma、Rhizopus、Thermoascus、Saccharomyces、Candida、Pichia、Pseudeurotium等為主；細(xì)菌以Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus、Weissella、Streptomyces等為主，其中Naumovozyma和Lactobacillus占絕對優(yōu)勢。

Rhizopus產(chǎn)糖化酶和液化酶能力強(qiáng)，有產(chǎn)生脂肪酶和乙醇的能力，能快速催化有機(jī)酸和乙醇生成酯類物質(zhì)[16]；Naumovozyma產(chǎn)生的乙醇可與乙酸、乳酸反應(yīng)產(chǎn)生己酸和丁酸，在一定程度上抑制窖內(nèi)發(fā)酵中乳酸及乙酸的合成[17]；Pichia產(chǎn)乙酸酯能力較強(qiáng)，多數(shù)產(chǎn)糖苷酶[18]。乳酸菌也是酸肉、香腸發(fā)酵中的優(yōu)勢細(xì)菌[4,6]，具有生成乙酸、乳酸和其他風(fēng)味物質(zhì)的能力[19]；Weissella可促進(jìn)乳桿菌生長；Streptomyces各個(gè)種都能利用葡萄糖，有較強(qiáng)的淀粉和蛋白質(zhì)水解能力。

表3 鳳香型白酒與其他香型白酒微生物菌群高通量測序結(jié)果比較Table 3 Comparison of microbial communities in fermented grains of different Chinese liquors by next-generation sequencing

如表3所示，鳳香型酒醅中優(yōu)勢真菌的組成及比例與其他香型均不同；細(xì)菌均多以Lactobacillus為主，但低豐度細(xì)菌在種類上也有差異。不同香型白酒采用不同的曲種和釀造工藝，均會導(dǎo)致發(fā)酵過程中微生物組成及演替的差異，最終蒸餾得到的酒中微量組分不同，影響酒的品質(zhì)與風(fēng)格。鳳香型白酒微生物群落結(jié)構(gòu)有別于以上4 種香型，具有獨(dú)特性，是其白酒風(fēng)格形成的重要因素之一。

2.2 酒醅發(fā)酵過程中理化指標(biāo)分析

如圖6所示，發(fā)酵前期溫度緩慢上升，發(fā)酵12 d達(dá)到30 ℃，維持30 ℃以上8 d，后期溫度略微下降。發(fā)酵前期酒醅中淀粉濃度高，微生物繁殖快，短時(shí)間內(nèi)生成大量發(fā)酵熱量，導(dǎo)致酒醅溫度升高；隨后糖化作用生成的還原糖量與窖池內(nèi)酵母菌維持生長代謝所需還原糖量達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，發(fā)酵作用基本停止，酒醅溫度在32 ℃保持5 d左右；后期的酯化階段細(xì)菌等微生物代謝產(chǎn)生較多的酶和酸，對前期生成的醇和酸起到催化酯化反應(yīng)的作用，酒醅溫度緩慢下降。

圖6 發(fā)酵過程中酒醅理化指標(biāo)的變化情況Fig. 6 Changes in physiochemical indexes in fermented grains during fermentation

鳳型酒醅的酸度前期緩慢上升，中后期上升迅速，說明霉菌、酵母菌及好氧細(xì)菌不是產(chǎn)酸的主體，厭氧及兼性厭氧細(xì)菌的大量增殖生成了多種有機(jī)酸，導(dǎo)致酒醅酸度迅速增加，適量的酸能增加白酒的后味，使酒體更加豐滿。因此，釀造過程的酸度必須控制在合適的范圍內(nèi)。

酒醅中淀粉和還原糖含量的變化反映了發(fā)酵進(jìn)度和完全度，對工藝操作具有一定的指導(dǎo)作用。發(fā)酵后淀粉含量約下降30%，前期下降顯著，中后期由于霉菌逐漸消亡，淀粉分解利用的速率明顯降低；發(fā)酵前后還原糖降低約90%，呈先升高后波動(dòng)平衡的趨勢。發(fā)酵初期霉菌快速生長繁殖，淀粉質(zhì)原料快速分解，而此時(shí)酵母菌消耗還原糖比較少，所以還原糖不斷積累。發(fā)酵中期酵母菌數(shù)量增多，發(fā)酵作用加快，還原糖被代謝旺盛的酵母菌快速消耗，含量迅速下降，直至發(fā)酵期結(jié)束。

2.3 理化指標(biāo)和微生物群落的相關(guān)性分析

表4 酒醅樣品中理化指標(biāo)與微生物多樣性的相關(guān)性Table 4 Correlation coefficents between physicochemical indicators and microbial diversity in fermented grain samples

利用SPSS軟件對酒醅樣品的理化指標(biāo)（溫度、酸度、還原糖和淀粉）和酒醅微生物多樣性進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。發(fā)酵溫度與細(xì)菌多樣性呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為－0.895（P＜0.01），淀粉含量與細(xì)菌多樣性呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.857（P＜0.01），還原糖與細(xì)菌多樣性呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.938（P＜0.01），理化指標(biāo)與真菌多樣性之間相關(guān)性不顯著。

3 結(jié) 論

本研究利用高通量測序法檢測分析鳳香型白酒不同發(fā)酵時(shí)期的酒醅樣品的微生物組成，達(dá)到深度測序的效果，共檢測出216 個(gè)屬和一些未被歸類的微生物，其中細(xì)菌檢測出183 個(gè)屬，真菌檢測出33 個(gè)屬。發(fā)酵過程中真菌以Naumovozyma、Rhizopus、Thermoascus、Saccharomyces、Candida、Pichia、Pseudeurotium等為主；細(xì)菌以Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus、Weissella、Streptomyces等為主，其中Naumovozyma和乳酸菌屬占絕對優(yōu)勢。鳳香型白酒微生物群落結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性，是其白酒風(fēng)格形成的主要因素。發(fā)酵溫度與細(xì)菌多樣性呈極顯著負(fù)相關(guān)，淀粉含量和還原糖與細(xì)菌多樣性呈極顯著正相關(guān)，理化指標(biāo)與真菌多樣性之間相關(guān)性不顯著。