Nisin、?-聚賴氨酸、pH值對(duì)蝦源枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面模型構(gòu)建與評(píng)價(jià)

郭全友，劉 玲,，李保國(guó)，楊 絮，姜朝軍

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

熟制水產(chǎn)品通常是以魚(yú)類(lèi)、甲殼類(lèi)、貝類(lèi)、軟體類(lèi)、棘皮類(lèi)等動(dòng)物性水產(chǎn)品為主要原料，經(jīng)蒸、煮、烘烤、油炸等加熱熟制過(guò)程制成的直接食用的水產(chǎn)加工品，在加工過(guò)程中自原料、預(yù)處理、熟制或滅菌、包裝等工藝難以將芽孢桿菌完全殺滅，即使經(jīng)過(guò)高溫殺菌的食品，可能因殘存芽孢桿菌和孢子萌發(fā)而受到污染。枯草芽孢桿菌耐高溫，極端條件下還可被誘導(dǎo)產(chǎn)生抗逆性很強(qiáng)的內(nèi)源孢子[1]，孢子的萌發(fā)為食品安全埋下隱患?？莶菅挎邨U菌常存在于烤腸、對(duì)蝦或鮑汁等熟制水產(chǎn)品中[1-3]。陳曉等[1]在酸臭的蒜蓉烤腸中檢出枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)該菌滋生與原料、設(shè)備、加工和二次滅菌等關(guān)鍵控制點(diǎn)均密切相關(guān)。鄭瑞生[3]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌感染的鮑魚(yú)無(wú)明顯惡臭和黑變特征，但存在部分流汁和酸敗現(xiàn)象，其分泌的酶類(lèi)物質(zhì)可能是其變質(zhì)的重要因素。鄭麗君等[4]通過(guò)測(cè)定免泡豆桿中腐敗代謝產(chǎn)物（揮發(fā)性鹽基氮）的產(chǎn)量因子為35.38 mg/100 g，確定枯草芽孢桿菌是致腐能力較強(qiáng)的腐敗菌之一。表明枯草芽孢桿菌是熟制水產(chǎn)品中被檢出常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，因而抑制其生長(zhǎng)對(duì)保障食品質(zhì)量安全至關(guān)重要。

預(yù)測(cè)微生物學(xué)是食品微生物學(xué)領(lǐng)域中一種有效的預(yù)測(cè)工具，可定量描述環(huán)境因子（溫度、pH值、水分活度等）與微生物（如致病菌和腐敗菌）生長(zhǎng)的關(guān)系，在食品貨架期預(yù)測(cè)及安全質(zhì)量管理中具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值[5]。預(yù)測(cè)微生物模型分為初級(jí)模型、二級(jí)模型和三級(jí)模型，經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃屠碚撃Ｐ?，?dòng)力學(xué)模型及概率模型等[6]。20世紀(jì)90年代以來(lái)，動(dòng)力學(xué)模型是預(yù)測(cè)微生物學(xué)的研究重點(diǎn)，能較好描述微生物生長(zhǎng)與環(huán)境因子之間的關(guān)系，但不能對(duì)微生物的非生長(zhǎng)狀況進(jìn)行定量表述[7]。微生物生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型可定量描述不同因子作用下微生物生長(zhǎng)的可能性（或概率），獲知其生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)信息，為食品保藏和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供一種有效工具[8]。目前微生物的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型有確定性方法[9]、Logistic回歸法[10]、最小凸多面體法[11]、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法[12]、簡(jiǎn)化式法[13]等。Logistic回歸模型具有模型擬合度高、表達(dá)直觀、應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn)，更適合多種控制因子不同水平生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型的建立。研究者多采用改變溫度、pH值、水分活度及NaCl等環(huán)境因子控制微生物的生長(zhǎng)[8,14-15]，目前，通過(guò)生物因子（如乳酸鏈球菌肽（Nisin）、?-聚賴氨酸（?-polylysine，?-PL））與環(huán)境因子的交互作用定量調(diào)控生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)狀況逐漸引起關(guān)注，如Boziaris等[16]研究了NaCl、KCl、pH值及Nisin對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)邊界的影響，Na等[17]研究?-PL和殼聚糖涂層對(duì)冷藏蝦質(zhì)量及其微生物群生長(zhǎng)的影響。相關(guān)研究表明[18]Nisin對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)抑制作用，其機(jī)理表現(xiàn)為對(duì)菌體凈表面電荷改變、疏水性變化、磷脂組成改變、膜脂肪酸組成的變化、細(xì)胞壁增厚或蛋白水解等起重要作用；?-PL是一種對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌及霉菌均有抑制作用的天然防腐劑，且對(duì)細(xì)菌的抑制作用強(qiáng)于霉菌，尤其對(duì)枯草芽孢桿菌等抑制作用較明顯[19]，同時(shí)有研究[20]發(fā)現(xiàn)Nisin具有依賴于pH值的即時(shí)性殺菌效果，其殺菌效果隨pH值的降低而增加。

目前針對(duì)枯草芽孢桿菌在Nisin、?-PL和pH值交互作用下生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面模型與效應(yīng)評(píng)價(jià)少見(jiàn)報(bào)道，本研究以源自熟制南美白對(duì)蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌枯草芽孢桿菌為研究對(duì)象，在37 ℃通過(guò)pH值、Nisin及ε-PL交互作用對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)概率產(chǎn)生影響，用Logistic回歸模型建立該交互作用下生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型，對(duì)其擬合優(yōu)度和適用性進(jìn)行評(píng)估及驗(yàn)證，分析比較3 種抑菌因子對(duì)枯草芽孢桿菌的交互作用，以期為優(yōu)化熟制水產(chǎn)品生產(chǎn)工藝、定量預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)情況狀況提供一種有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

真空包裝熟制對(duì)蝦蝦仁采購(gòu)于寧德市某水產(chǎn)公司，在其貨架期終點(diǎn)時(shí)分離純化出優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)MIDI脂肪酸鑒定、BIOLOG微生物鑒定和16S rRNA測(cè)序（序列號(hào)：KU570452.1）鑒定為枯草芽孢桿菌[21-22]，凍干，4 ℃貯藏，待用。

0.01 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液 深圳市博材達(dá)科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、氯化鈉 上海市國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Nisin 浙江新銀象生物工程有限公司；?-PL 鄭州博研生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bioscreen C微生物生長(zhǎng)測(cè)定儀 芬蘭Oy Growth Curves Ab有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；SW-CJ-1FB潔凈工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZM-100反壓蒸煮消毒鍋 廣州標(biāo)際包裝設(shè)備有限公司；ZHWY-200H恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；低溫培養(yǎng)箱 日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 生長(zhǎng)介質(zhì)的制備

設(shè)計(jì)多因子交互試驗(yàn)，使用營(yíng)養(yǎng)肉湯作為培養(yǎng)介質(zhì)。參考GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》及相關(guān)文獻(xiàn)[23]，Nisin在熟制水產(chǎn)品中限量≤0.5 g/kg，?-PL在熟肉制品中限量≤0.25 g/kg 。?-PL及Nisin溶液梯度皆設(shè)置為0、20、60、100、140、180 μg/mL共6 個(gè)水平?？莶菅挎邨U菌及孢子在3.0～10.0的pH值范圍內(nèi)具有耐受性[24-25]，考慮到產(chǎn)品特性，參考GB 4789.26—2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 商業(yè)無(wú)菌檢驗(yàn)》低酸性食品與酸性食品界定為pH 4.6，取pH 4.0、4.6、5.0、6.0、7.0共5 個(gè)水平。參考文獻(xiàn)[10,12]選取144 例數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，36 例數(shù)據(jù)作為驗(yàn)證集，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 交互試驗(yàn)訓(xùn)練集與驗(yàn)證集設(shè)計(jì)Table 1 Design of training and validation set for interactiom experiments

1.3.2 菌懸液的制備及接種

菌株活化：取枯草芽孢桿菌接種于無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中，振蕩30 s，37 ℃培養(yǎng)24 h，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中劃線得到單菌落。

菌懸液制備：挑取單菌落，接種到10 mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18 h，取1 mL培養(yǎng)液至9 mL無(wú)菌生理鹽水中得到10－1菌懸液，逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥?0－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6梯度菌懸液，各取0.1 mL涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，選取菌量約105CFU/mL菌懸液作為接種液。

調(diào)節(jié)過(guò)pH值、ε-PL質(zhì)量濃度的營(yíng)養(yǎng)肉湯溶液經(jīng)121 ℃滅菌處理，無(wú)菌條件下調(diào)節(jié)Nisin至所需質(zhì)量濃度，每孔180 μL接入200微孔板中，取105CFU/mL 的接種液20 μL，確定最終接種液濃度為3.8×104CFU/mL ，接種入孔，每個(gè)條件10 組平行，1 個(gè)空白，微生物生長(zhǎng)測(cè)定儀中速振蕩25 ℃培養(yǎng)，7 d內(nèi)每隔1 h測(cè)其OD600nm值。

1.3.3 生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面的判別

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，微孔中出現(xiàn)明顯混濁或沉淀物且OD值讀數(shù)大于3×空白值（0.10左右）則判定枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)[10,12,26]，當(dāng)OD值∈（0.10，0.30）或?qū)π】字芯鷳乙簻啙岫葻o(wú)法判定時(shí)，通過(guò)涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板證明，出現(xiàn)該菌典型菌落形態(tài)，且菌數(shù)大于初始菌量0.5（lg（CFU/mL））時(shí)[14]，則確定枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)，否則確定為不生長(zhǎng)。當(dāng)結(jié)果確定枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)，記為“1”，反之則記為“0”。

1.3.4 生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型構(gòu)建與驗(yàn)證

1.3.4.1 Logistic模型構(gòu)建

Ratkowsky等[27]提出了簡(jiǎn)單Logistic回歸模型，其能夠在一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)控制因子和添加劑的情況下，擬合菌株生長(zhǎng)與非生長(zhǎng)之間的邊界，通過(guò)預(yù)測(cè)微生物學(xué)概率及動(dòng)力學(xué)方面的整合，從而應(yīng)用于預(yù)測(cè)食品微生物學(xué)中，選取144 例數(shù)據(jù)為訓(xùn)練集用以構(gòu)建模型。

式（1）中：Logit（P）=ln[P/（1－P）]；P為枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)概率；ai（i=0～3）為擬合參數(shù)；Nisin、ε-PL均表示質(zhì)量濃度/（μg/mL）。式（2）同。

多項(xiàng)式Logistic回歸模型是一種建立在一個(gè)多項(xiàng)式的邏輯回歸模型的算法，可避免對(duì)大系數(shù)的過(guò)度擬合[12]：

式（2）中：bi（i＝0～9）為擬合參數(shù)。

1.3.4.2 模型評(píng)價(jià)與驗(yàn)證

模型評(píng)價(jià)：評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括R2-Nagelkerke和Hosmer-Lemeshow。Hosmer-Lemeshow測(cè)試常用來(lái)評(píng)估模型的擬合優(yōu)度及任意數(shù)量的連續(xù)與分散的解釋變量，其值越小擬合效果越好。R2-Nagelkerke值主要反映了解釋變量與響應(yīng)變量間的關(guān)系，其值越接近1，擬合優(yōu)度越好[12]。預(yù)測(cè)正確率（fraction correct，F(xiàn)C）是指預(yù)測(cè)值與實(shí)際值一致樣本占總樣本數(shù)量的百分比，可用來(lái)評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)精度[28]。

模型驗(yàn)證：選取表1中36 例驗(yàn)證集，代入建立的Logistic模型中，采用C-matrix獲得FC，驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確度。

式（3）中：FC=（a＋d）/（a＋b＋c＋d）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

模型擬合通過(guò)SPSS 18.0（美國(guó)IBM公司），并通過(guò)Origin 9.0（美國(guó)OriginLab公司）繪制生長(zhǎng)概率等高線圖（選取概率Pi（i=1～9）為0.1～0.9時(shí)的預(yù)測(cè)值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型構(gòu)建及驗(yàn)證

2.1.1 Logistic回歸模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)

枯草芽孢桿菌2 種生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型的擬合參數(shù)見(jiàn)表2。采用簡(jiǎn)單Logistic回歸模型，pH值、ε-PL與Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)影響顯著（P＜0.05）；采用多項(xiàng)式Logistic回歸模型，pH值、ε-PL與Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)影響亦顯著（P＜0.05）。

簡(jiǎn)單Logistic回歸模型：

多項(xiàng)式Logistic回歸模型：

表2 Logistic模型擬合參數(shù)及擬合優(yōu)度比較Table 2 Comparison of parameters and goodness of fit between simple and polynomial Logistic models

表3 兩種模型擬合優(yōu)度評(píng)價(jià)和驗(yàn)證Table 3 Goodness of fit evaluation and verification of simple and polynomial Logistic models

表3 為兩種模型擬合優(yōu)度評(píng)價(jià)。R2-Nagelkerke是評(píng)價(jià)模型擬合度的指標(biāo)；Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)表明，測(cè)試P值越大，χ2值越小，模型擬合優(yōu)度越高[28]。由表3可知，多項(xiàng)式Logistic模型的R2-Nagelkerke為0.91，高于簡(jiǎn)單Logistic模型R2-Nagelkerke為0.79，說(shuō)明多項(xiàng)式Logistic模型擬合優(yōu)度高于簡(jiǎn)單Logistic模型，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)擬合效果更好。比較Hosmer-Lemeshow結(jié)果亦得出，多項(xiàng)式Logistic模型（χ2=0.76，P=1）擬合效果優(yōu)于簡(jiǎn)單Logistic模型（χ2=2.00，P=0.981），多項(xiàng)式Logistic模型擬合效果優(yōu)于簡(jiǎn)單Logistic模型。

2.1.2 生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型的驗(yàn)證

FC一般用以反映模型的預(yù)測(cè)能力，通常作為模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，反映預(yù)測(cè)值和實(shí)際值的一致性[14]。由表3可見(jiàn)，簡(jiǎn)單Logistic模型訓(xùn)練集FC為65.2%，驗(yàn)證集FC為61.8%，訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的FC較接近，但FC較低，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較低。多項(xiàng)式Logistic模型的訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的FC分別為87.4%和84.1%，兩者較接近，對(duì)于同一性質(zhì)的數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高。從驗(yàn)證集看，F(xiàn)C值越高，代表模型對(duì)驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高。

2.2 環(huán)境因子對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)的作用

2.2.1 Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)的作用

圖1 不同Nisin質(zhì)量濃度下枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面圖Fig. 1 Growth/no growth boundaries at different concentrations of nisin for B. subtilis

圖1 為Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)概率的影響，根據(jù)模型擬合出生長(zhǎng)概率P為0.1～0.9的分界線，P=1表明該條件下適宜生長(zhǎng)；P=0說(shuō)明該區(qū)域條件下Nisin、?-PL和pH值的交互作用對(duì)枯草芽孢桿菌有較好的抑制作用，該條件下不適宜生長(zhǎng)。隨著Nisin質(zhì)量濃度增加，枯草芽孢桿菌非生長(zhǎng)區(qū)變大，其生長(zhǎng)受到抑制，Nisin質(zhì)量濃度對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)情況影響顯著（P＜0.05）。

圖1 a～c中，根據(jù)非生長(zhǎng)區(qū)大小可知，Nisin質(zhì)量濃度≤60 μg/mL時(shí)，Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面的影響較小，?-PL質(zhì)量濃度越高則生長(zhǎng)區(qū)越小，pH值越接近7.0則生長(zhǎng)區(qū)越大；圖1d～f中，Nisin質(zhì)量濃度大于60 μg/mL時(shí)，Nisin是影響枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面的主要因素。隨Nisin質(zhì)量濃度的增加，生長(zhǎng)概率等高線圖逐漸變緩，說(shuō)明pH值與?-PL質(zhì)量濃度的交互作用中pH值的影響減弱，?-PL質(zhì)量濃度的影響增強(qiáng)。無(wú)論?-PL質(zhì)量濃度為何值，Nisin質(zhì)量濃度為60、100、140、180 μg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌在pH值分別為4.0、4.25、4.5、5.0時(shí)表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。隨pH值增大至7.0，圖1c中Nisin質(zhì)量濃度為60 μg/mL時(shí)，生長(zhǎng)概率在?-PL質(zhì)量濃度為90 μg/mL時(shí)達(dá)到0.98；圖1d中Nisin質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，生長(zhǎng)概率在?-PL質(zhì)量濃度為60 μg/mL時(shí)達(dá)到0.94；圖1e中當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度為140 μg/mL時(shí)，?-PL質(zhì)量濃度為20 μg/mL，生長(zhǎng)概率為0.92；圖1f中當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度達(dá)到180 μg/mL時(shí)，生長(zhǎng)概率在?-PL質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)僅為0.40。隨Nisin質(zhì)量濃度增加，生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界限向更高?-PL質(zhì)量濃度、更低pH值方向移動(dòng)。Nisin在本次實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面的影響，其背后機(jī)理可能為Nisin中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)枯草芽孢桿菌等細(xì)菌起到抗菌作用[29]。枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)區(qū)隨Nisin質(zhì)量濃度的增加而變小，這與Boziaris等[16]研究NaCl、KC、pH值及Nisin對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)邊界的影響結(jié)果較為相似，其結(jié)果顯示增加Nisin質(zhì)量濃度顯著影響生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面，導(dǎo)致單核細(xì)胞性李斯特菌Scott A非生長(zhǎng)區(qū)增大，Nisin的存在導(dǎo)致單核細(xì)胞性李斯特菌Scott A更受抑制；因此，結(jié)合生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面模型對(duì)調(diào)控Nisin與pH值間的交互作用，以及靶向控制熟制水產(chǎn)品中的腐敗菌具有重要意義。

2.2.2?-PL對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)的作用

由圖2可知，與Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面的作用類(lèi)似，?-PL對(duì)其生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)情況影響顯著，即隨著?-PL質(zhì)量濃度增加，枯草芽孢桿菌非生長(zhǎng)區(qū)變大，其生長(zhǎng)受到抑制越強(qiáng)。由圖2可知，隨?-PL質(zhì)量濃度的增加，生長(zhǎng)概率等高線圖也逐漸變緩，說(shuō)明pH值與Nisin質(zhì)量濃度交互作用中Nisin占主導(dǎo)作用，且Nisin與?-PL的交互作用增強(qiáng)。無(wú)論Nisin質(zhì)量濃度為何值，?-PL質(zhì)量濃度為60、100、140、180 μg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌在pH值分別為4.0、4.5、4.75、5.25時(shí)生長(zhǎng)概率為0。隨pH值增大至7.0，圖2c中當(dāng)?-PL質(zhì)量濃度為60 μg/mL時(shí)，生長(zhǎng)概率在Nisin質(zhì)量濃度為90 μg/mL時(shí)達(dá)到0.97；圖2d中當(dāng)?-PL質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，生長(zhǎng)概率在Nisin質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)達(dá)到0.98；圖2e中當(dāng)?-PL質(zhì)量濃度為140 μg/mL時(shí)，Nisin質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，生長(zhǎng)概率為0.97；圖2f中當(dāng)?-PL質(zhì)量濃度達(dá)到180 μg/mL時(shí)，生長(zhǎng)概率在Nisin質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)僅為0.73。若?-PL質(zhì)量濃度不斷增加，生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界限向更高Nisin質(zhì)量濃度、更低pH值方向移動(dòng)。綜上，?-PL對(duì)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出較好的抑制作用，與蔡瑞等[30]研究得出?-PL對(duì)芽孢桿菌屬具有顯著抑制效果結(jié)論相似，當(dāng)添加量為最小抑菌質(zhì)量濃度（1.25～5 mg/L）時(shí)，對(duì)芽孢桿菌屬菌數(shù)減少量為1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)，與Sun Haitao等[31]通過(guò)澆鑄法將Nisin（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%～0.5%）和?-PL（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%）摻入玉米磷酸二淀粉/納米纖維素薄膜中制備抑菌生物納米復(fù)合薄膜，結(jié)果表明結(jié)合Nisin和?-PL的納米纖維素薄膜生物納米復(fù)合膜對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）具有協(xié)同抑菌活性也較為一致。?-PL作用機(jī)理主要呈現(xiàn)為導(dǎo)致細(xì)菌質(zhì)壁分離，菌體塌陷及細(xì)胞質(zhì)溢出等現(xiàn)象[19]，而?-PL與Nisin、pH值交互作用下對(duì)枯草芽孢桿菌的內(nèi)在抑菌機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

圖2 不同?-PL質(zhì)量濃度下枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面圖Fig. 2 Growth/no growth boundaries at different concentrations of ?-polylysine for B. subtilis

2.2.3 pH值對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)的作用

由圖3可知，pH值由7.0逐漸調(diào)至4.0，枯草芽孢桿菌非生長(zhǎng)區(qū)逐步擴(kuò)大，pH值抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)pH值低于5.0，枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制（非生長(zhǎng)區(qū)/生長(zhǎng)區(qū)＞1）。圖3a中，當(dāng)pH值為4.0時(shí)，pH值是影響枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的主要因素；圖3b～d中，當(dāng)pH≥5.0時(shí)，Nisin與?-PL的交互作用影響加強(qiáng)。同時(shí)，隨pH值的升高，生長(zhǎng)概率等高線逐漸變陡，可能是Nisin與?-PL的交互作用中，?-PL的影響減小，Nisin的影響增強(qiáng)導(dǎo)致的。pH值對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)情況影響顯著（P＞0.05）。pH值越低，Nisin與?-PL的交互作用被減弱，枯草芽孢桿菌越不適宜生長(zhǎng)，生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界限開(kāi)始變化點(diǎn)向低濃度生物因子（Nisin與?-PL）范圍移動(dòng)。

圖3 不同p值下枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面圖Fig. 3 Growth/no growth boundaries at different pH for B. subtilis

pH值下降會(huì)改變細(xì)胞膜通透性[26]，造成微生物新陳代謝有關(guān)酶失活[32]，進(jìn)而導(dǎo)致微生物死亡。有學(xué)者指出pH值對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和失活等影響顯著，如Balasubramanian等[33]研究了熱-壓力-pH值（4.0～7.0）的交互效應(yīng)下檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液中枯草芽孢桿菌ATCC 6633孢子的失活過(guò)程，結(jié)果顯示當(dāng)孢子分別懸浮在pH 5.0和pH 3.0的緩沖溶液中，孢子數(shù)量能減少約為6 個(gè)和7 個(gè)對(duì)數(shù)值。于枯草芽孢桿菌而言，pH值低于5.0時(shí)，Nisin與?-PL的交互作用逐漸受到影響，此時(shí)pH值為影響生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)邊界的主導(dǎo)因素。Vermeulen等[34]研究了pH值、水分活度及乙酸對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)情況，pH值越小，非生長(zhǎng)區(qū)范圍變大，生長(zhǎng)概率降低，生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面往更低乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%～0.4%）、更高水分活度（0.960～0.990）方向偏移，這也與本研究結(jié)果一致?？紤]到產(chǎn)品安全性及感官品質(zhì)的可接受性，例如為避免水產(chǎn)品或酸性食品中肉毒桿菌中毒的危害，pH 4.6通常被普遍接受為達(dá)到安全劑量的最小值[35]；有研究者[15]在調(diào)味軟烤扇貝中發(fā)現(xiàn)，pH值在5.7～5.9時(shí)，有一定去腥效果且酸感不明顯，而當(dāng)pH值低于5.5時(shí)，酸感較顯著。因此，結(jié)合生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面模型，調(diào)節(jié)適當(dāng)pH值并結(jié)合產(chǎn)品感官品質(zhì)特征在熟制水產(chǎn)品的加工及應(yīng)用中也具有一定參考價(jià)值。

3 結(jié) 論

研究源自熟制南美白對(duì)蝦的優(yōu)勢(shì)腐敗菌（枯草芽孢桿菌）37 ℃條件下，pH值、Nisin及?-PL的交互作用對(duì)其生長(zhǎng)概率的影響，通過(guò)簡(jiǎn)單Logistic和多項(xiàng)式Logistic方程擬合生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型，并對(duì)模型進(jìn)行了評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，比較3 種抑菌因子對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制效用，主要結(jié)論如下：1）建立了枯草芽孢桿菌簡(jiǎn)單Logistic和多項(xiàng)式Logistic生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型，可預(yù)測(cè)pH值、Nisin及?-PL作用下的枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)概率。簡(jiǎn)單Logistic模型與多項(xiàng)式Logistic模型訓(xùn)練集FC、R2-Nagelkerke及Hosmer-Lemeshow測(cè)試結(jié)果得出，多項(xiàng)式Logistic模型擬合效果優(yōu)于簡(jiǎn)單Logistic模型，表明多項(xiàng)式Logistic生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型能更好預(yù)測(cè)pH值、Nisin及?-PL作用下枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)概率。2）隨Nisin質(zhì)量濃度、?-PL質(zhì)量濃度增加或pH值的降低，生長(zhǎng)區(qū)域逐漸減小，非生長(zhǎng)區(qū)域逐漸擴(kuò)大，枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)受到抑制。當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度增加，枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界限往更高?-PL質(zhì)量濃度、更低pH值方向移動(dòng)。無(wú)論第3種因子質(zhì)量濃度為何值，當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度為60、100、140、180 μg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌在pH值分別為4.0、4.25、4.5、5.0時(shí)表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。?-PL質(zhì)量濃度為60、100、140、180 μg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌在pH值分別為4.0、4.5、4.75、5.25時(shí)生長(zhǎng)概率為0。當(dāng)pH＜5.0時(shí)，枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)受到較強(qiáng)抑制，此時(shí)pH值是影響枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界限的主要因素。

綜上，通過(guò)構(gòu)建水產(chǎn)品中腐敗菌/致病菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型，在預(yù)測(cè)和控制微生物安全和產(chǎn)品品質(zhì)等方面具有重要參考價(jià)值，為實(shí)際生產(chǎn)中有效預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)概率提供指導(dǎo)。由于水產(chǎn)品原料、加工、流通、銷(xiāo)售過(guò)程中影響因素的復(fù)雜性及不確定性，仍需根據(jù)產(chǎn)品特性和關(guān)鍵控制點(diǎn)導(dǎo)入更多調(diào)控因子，并對(duì)其協(xié)同/拮抗效應(yīng)作進(jìn)一步研究。