大腸桿菌O157:H7在不銹鋼表面生物膜形成能力及其與菌株的特性關(guān)系

吳麗娜，董鵬程，張一敏，毛衍偉，梁榮蓉，楊嘯吟，朱立賢,，羅 欣,2

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

大腸桿菌O157:H7是一種食源性致病菌，可引起人感染性腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合征等疾病，嚴(yán)重時可致人死亡[1]。食品可以作為大腸桿菌O157:H7污染的爆發(fā)源，例如魚、牛肉、乳品、水果等都可以作為大腸桿菌O157:H7的載體[2-4]。生物膜是指微生物為了適應(yīng)環(huán)境，黏附于非生物或活性組織表面，分泌大量的多糖、蛋白質(zhì)和核酸等不均一的胞外基質(zhì)，將菌體自身包裹在其中而形成的大量菌體聚集膜狀物，是菌體在自然界中常見的生存狀態(tài)，直接影響著人類生產(chǎn)和生活的各個方面[5]。大腸桿菌O157:H7常通過形成生物膜附著在食品、食品加工設(shè)備、包裝材料等表面，難以殺滅與清除，從而形成持續(xù)性的污染，產(chǎn)生食品安全隱患，造成巨大的經(jīng)濟損失，并且增加了食源性疾病爆發(fā)的風(fēng)險[6]。

在接觸面上生物膜的形成是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，受到很多因素的影響，比如細菌分離的來源、接觸面的類型、菌株特性（自聚性、運動性、疏水性）等。大多數(shù)學(xué)者都是在實驗室標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中研究細菌的生物膜形成，如胰蛋白胨大豆肉湯、LB培養(yǎng)基等[7-8]，但是不同的營養(yǎng)條件都會對生物膜的形成產(chǎn)生影響。食品加工中的一些條件，如接觸面的類型、營養(yǎng)基質(zhì)等都與實驗室的條件有所不同，因此，與在實驗室條件下評估的生物膜相比，真實的食品加工環(huán)境中的生物膜可能出現(xiàn)不同的生長情況。肉汁培養(yǎng)基可被用于在實驗室中模擬真實情況的培養(yǎng)環(huán)境，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)雞肉汁培養(yǎng)基對彎曲桿菌和沙門氏菌生物膜的形成有著促進作用[9]。還有一些含有食物成分（如魚、牛奶、油和碳水化合物）的培養(yǎng)基也可以對大腸桿菌生物膜起著保護作用[10]。但也有研究發(fā)現(xiàn)雞肉汁培養(yǎng)基中沙門氏菌生物膜的形成能力要弱于胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）[11]。目前，國內(nèi)鮮有針對肉牛加工環(huán)境條件下牛肉源大腸桿菌O157:H7生物膜形成的報道，尤其是針對有肉汁殘留的不銹鋼表面。因此，牛肉汁培養(yǎng)基（beef extract，BE）和實驗室標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基對不同大腸桿菌O157:H7生物膜形成的影響是否存在差異尚不清楚。

本實驗用BE為生長基質(zhì)用于模擬真實的食品加工環(huán)境，并以實驗室標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)TSB為對照，以不銹鋼為接觸面，研究牛肉源不同大腸桿菌O157:H7菌株生物膜的形成能力及其菌株特性，為大腸桿菌O157:H7的控制提供指導(dǎo)，從而有助于開發(fā)有效的生物膜防控技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TSB、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy ager，TSA）、葡萄糖、細菌瓊脂粉、LB培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯化鈉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二甲苯 天津凱通化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖溶液 北京索萊寶科技有限公司；不銹鋼片（50 mm×20 mm×1 mm，304，2B表面） 江蘇浩瑞金屬科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo 1300A2型生物安全柜 美國Thermo Scientific公司；HF safe-MJQ1型紅外線滅菌器 上海力申科學(xué)儀器有限公司；5804R型離心機 德國Eppendorf公司；BioTek Epoch2型酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將凍存于－20 ℃的菌株（大腸桿菌O157:H7）接種于新鮮的TSB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)18 h進行活化，經(jīng)2 次活化后的菌液以4 ℃、10 000×g離心5 min，去上清液，用無菌生理鹽水重復(fù)洗滌沉淀2 次，然后用無菌生理鹽水重懸后備用。

1.3.2 BE制備

將牛肉除去脂肪并切成小塊，以牛肉∶水為1∶2（g/mL）的比例加入蒸餾水，在高壓滅菌鍋中蒸煮滅菌，將獲得的肉湯用紗布過濾后分裝備用，在－20 ℃貯存[12-13]。

1.3.3 不銹鋼表面生物膜制備

出站的路上，幾位火車站的保安大叔半開玩笑的關(guān)懷，一下就讓人感受到了天津人的熱情，似乎身上也暖和了許多！再往前走，一個開出租車的女司機，看我穿得清涼，主動要給我外套，我說不要緊，一會兒上車就暖和了，她還一個勁兒地要我趕緊穿上，而關(guān)鍵問題是我并不是她的客戶。最后我還是固執(zhí)地沒有接受她的外套，只好道聲“感謝”！

在使用前將不銹鋼片沖洗并滅菌。將1.3.1節(jié)中的菌液稀釋1 000 倍，取100 μL懸浮液轉(zhuǎn)移到20 mL含不銹鋼片的TSB或BE中。將所有含不銹鋼片的培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)7 d。菌株分別在培養(yǎng)1～7 d時計數(shù)。將不銹鋼片用0.85% NaCl溶液沖洗3 次以除去未附著的細菌，而后用無菌棉簽擦拭除去附著的生物膜，再將拭子轉(zhuǎn)移到含有0.85% NaCl溶液的管中并渦旋約5 min，然后制備連續(xù)稀釋液。通過胰蛋白酶大豆瓊脂平板法進行菌落計數(shù)用于評估大腸桿菌O157:H7生物膜形成能力[14]。

1.3.4 自聚能力測定

調(diào)整1.3.1節(jié)中各菌懸液的OD600nm值約至0.8，并準(zhǔn)確測定其OD600nm值（A0），將相同體積的各菌懸液置于37 ℃培養(yǎng)6 h，吸取各菌株的等量上清液，并測定其OD600nm（A1），計算各菌株的自聚性能（自聚能力/%=（A0－A1）/A0×100）；各菌株均重復(fù)3 次[15]。

1.3.5 泳動能力測定

采用軟瓊脂平板法測定各菌株的泳動能力。單一菌體泳動能力（swimming）平板的配方為[16]10 g/L胰蛋白胨，5 g/L NaCl，2.5 g/L葡萄糖，0.3%瓊脂粉；群體泳動能力（swarming）平板的配方為25 g/L LB，0.5 g/L葡萄糖，0.5%瓊脂粉，取3 μL各菌株的懸浮液接種至兩種平板的中心位置，在室溫下放置20 min，使菌液充分吸收；將swimming平板和swarming平板置于37 ℃培養(yǎng)48 h，測定菌株擴散菌圈的直徑大?。╩m）；每種平板中各菌株重復(fù)3 次。

1.3.6 表面疏水性測定

調(diào)整各菌懸液的OD600nm值至1.0±0.2，并準(zhǔn)確測定其初始濃度（A0，OD600nm），分別取2 mL的各菌懸液，分別加入2 mL的二甲苯，充分渦旋2 min后，使其在室溫靜置15 min，充分分層后測定各體系中水相的OD600nm（A1），各測試項均重復(fù)3 次[17]。菌株的表面疏水特性計算如下：

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SAS軟件（Version 9.0）的混合模型進行交互作用分析，菌株、時間、培養(yǎng)基類型作為對生物膜形成能力影響的固定因素，實驗重復(fù)及固定效應(yīng)的交互作用為隨機因素，數(shù)據(jù)使用3 次重復(fù)的表示。菌株特性使用ANOVA法進行單因素分析，用Pearson相關(guān)系數(shù)法進行各參數(shù)之間的相關(guān)性分析，P＜0.05，差異顯著。使用Sigma Plot1 2.5軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物膜形成能力

BE培養(yǎng)基用于模擬肉類加工環(huán)境，以獲得與實際加工情況最接近的實驗數(shù)據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，本實驗使用的所有大腸桿菌O157:H7在2 種培養(yǎng)基中都可以附著在不銹鋼表面上（表1），菌株、時間、培養(yǎng)基質(zhì)的交互作用對生物膜的形成有顯著影響（P＜0.05）。

表1 不同大腸桿菌O157:7菌株在不銹鋼片上生物膜形成能力Table 1 Biofilm formation abilities of different E. coli O157:7 strains on stainless steel plates

表1 不同大腸桿菌O157:7菌株在不銹鋼片上生物膜形成能力Table 1 Biofilm formation abilities of different E. coli O157:7 strains on stainless steel plates

注：肩標(biāo)大寫字母不同表示同一菌株在同一培養(yǎng)基不同時間下差異顯著（P＜0.05）；肩標(biāo)拉丁字母不同表示同一菌株在同一時間不同培養(yǎng)基中差異顯著（P＜0.05）；肩標(biāo)小寫字母不同表示不同菌株在同一時間同一培養(yǎng)基中差異顯著（P＜0.05）。

lg（CFU/cm2）菌株 培養(yǎng)基質(zhì)BE 0.00αAa 2.43βBa 2.62βBCa2.69αBCDa2.95αCDa 3.06βDa 3.74βEa 3.84βEb 3.96βEb 104 TSB 0.00αAa 4.11βDEb 4.65βFb 4.16βEb 3.67βCDc3.10βBab3.83βCDEb3.11βBa 3.47βBCb BE 0.00αAa 3.41αBCc 3.30αBb 3.51αBCb3.57βBCDb3.81αCDb3.70βBCDa3.75αCDb 4.01αDb 107 TSB 0.00αAa 2.80βBa 3.26βCa 3.12βBCa3.19βBCb 3.31βCb 3.37βCa 3.13αBCa2.96αBCa BE 0.00αAa 2.61βBb 3.52βDEb3.10βCDab3.58βEb 3.00βBCa 4.22αFb3.17αCDEa3.03αBCa時間 標(biāo)準(zhǔn)誤差1 h 12 h 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d S1 TSB 0.00αAa 2.85βBCa2.90βBCDa3.15βCDa 2.47βBa 2.76βBCa3.37βDEa3.77βEFb 4.08βFc 0.22

3 株菌都在初始1 h內(nèi)沒有產(chǎn)生黏附。所測試的菌株之間的生物膜數(shù)量差異顯著（P＜0.05），其中，104菌株的最大黏附量要高于S1菌株和107菌株的最大黏附量。3 株菌在不銹鋼上的最大黏附數(shù)量為4.65（lg（CFU/cm2）），黏附數(shù)較低，這可能與接觸面的材質(zhì)有關(guān)，表面疏水特性的菌株傾向于黏附在疏水材料表面，表面親水特性的菌株傾向于黏附在親水材料表面，表面疏水菌株比親水細菌更易在接觸表面附著，不銹鋼片屬于親水材料，細菌在不銹鋼上的黏附能力較差[18]。

3 株菌在不銹鋼表面產(chǎn)生最大黏附的時間不一致，S1菌株在第7天產(chǎn)生最大黏附，107菌株在第5天形成最大黏附，而104菌株在TSB中生長較快，在第1天形成最大黏附，在BE中生長較慢，在第7天形成最大黏附。

不同的菌株在不銹鋼片上的生長趨勢不一致，除了所用菌株本身原因之外，還可能是因為培養(yǎng)基質(zhì)的不同。生物膜形成受到所用培養(yǎng)基類型的影響，對于3 株菌的最大生物膜形成能力來說，在TSB中培養(yǎng)的S1、104兩株菌顯示出比BE中更高的生物膜形成能力，而107菌株剛好相反。

2.2 菌株特性

圖1 不同大腸桿菌O157:7菌株特性Fig. 1 Cell surface hydrophobicity, autoaggregation ability and motility of different E. coli O157:H7 strains

在本研究中，在不同菌株中觀察到自聚能力的變化（圖1A）。3 株菌的自聚能力不同，其中107菌株的自聚能力要顯著高于其他2 株菌（P＜0.05）。由圖1B可知，不同菌株的泳動能力有顯著差異，S1菌株和107菌株的群體泳動能力顯著低于104（P＜0.05），S1和104的單一泳動能力低于107（P＜0.05）。群體泳動能力的結(jié)果與大腸桿菌O157:H7在不銹鋼上初始黏附的結(jié)果一致，S1菌株和107菌株的初始黏附要低于104菌株。如圖1C所示，不同菌株疏水性不同。其中，107菌株對二甲苯的親和力要顯著高于其他2 株菌，表明107菌株的疏水性要顯著高于其他2 株菌（P＜0.05）。

2.3 生物膜形成能力與菌株特性的相關(guān)性

表2 大腸桿菌O157:7菌株特性與生物膜形成的相關(guān)性分析Table 2 Correlation coefficients between E. coli O157:7 cell characteristics and biofilm formation ability

表2 大腸桿菌O157:7菌株特性與生物膜形成的相關(guān)性分析Table 2 Correlation coefficients between E. coli O157:7 cell characteristics and biofilm formation ability

注：*. P＜0.05，差異顯著；**. P＜0.01，差異極顯著。BF-TSB或BF-BE表示在相應(yīng)培養(yǎng)基中生物菌膜（5 d）的形成。

指標(biāo) 自聚能力 單一泳動 群體泳動 疏水性 BF-TSB單一泳動 0.621群體泳動 －0.117 0.498疏水性 0.914** 0.813** 0.034 BF-TSB －0.297 －0.058 0.694* －0.358 BF-BE 0.601 0.605 0.118 0.669* －0.137

如表2所示，菌株的疏水性與自聚性存在極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），單一泳動能力與疏水性存在極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），TSB中的生物膜形成能力只和群體泳動存在顯著正相關(guān)（P＜0.05），而BE中的生物膜形成只和疏水性存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。除此之外，菌株在2 種培養(yǎng)基質(zhì)中的生物膜形成能力不存在相關(guān)性。

3 討 論

為了與肉牛加工的環(huán)境更為相似，本研究選取不銹鋼為菌株的黏附表面，并且使用牛肉汁為菌株培養(yǎng)基質(zhì)，與TSB進行比較，在這些條件下研究大腸桿菌O157:H7菌株生物膜形成可以獲得與實際情況最為類似的信息，對控制實際環(huán)境中的大腸桿菌O157:H7更有幫助。不同培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分會影響生物膜菌株的形成，S1、104、107這3 株菌在2 種培養(yǎng)基中的生物膜形成能力并不一致。Li Jiaqi等[9]在LB培養(yǎng)基中補充不同濃度的雞肉汁，發(fā)現(xiàn)補充體積分?jǐn)?shù)50%的雞汁達到最高的生物膜形成水平，但是純雞汁也會使細菌生物膜形成水平顯著高于對照組（未添加肉汁）。除此之外，也有研究表明使用一些食物成分（如魚、牛奶、油和碳水化合物）為生長基質(zhì)可以增強生物膜的形成，這表明許多食物殘留物可能促進各種細菌形成生物膜[10]。與本研究中107菌株的結(jié)果類似，107菌株在BE中形成的生物膜比TSB中更強。氯化鈉、葡萄糖等營養(yǎng)成分也會影響生物膜的形成，有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加適量的葡萄糖會促進生物膜的形成[19-20]。

此外，不銹鋼是現(xiàn)在肉品加工過程中接觸面的主要材質(zhì)，尤其是自動加工工藝的發(fā)展，增加了不銹鋼設(shè)備的使用，而不銹鋼表面與產(chǎn)品的反復(fù)接觸可能會增加大腸桿菌O157:H7的交叉污染。因此，對于不銹鋼表面菌株生物膜的研究十分必要。同一菌株在不銹鋼表面與塑料、玻璃、木材、陶瓷等其他材質(zhì)表面的生物膜形成能力不一致。有學(xué)者對來自于食品中的67 種金黃色葡萄球菌在不銹鋼及聚苯乙烯上生物膜形成能力進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同菌株在聚苯乙烯和不銹鋼上形成生物膜的能力有相當(dāng)大的變化，與不銹鋼相比，金黃色葡萄球菌生物膜的形成優(yōu)先發(fā)生在聚苯乙烯上[21]。也有研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7在不銹鋼上生物膜形成能力要高于聚丙烯、玻璃[22]。

對3 株大腸桿菌O157:H7菌株特性進行研究發(fā)現(xiàn)不同菌株的自聚能力不同，這可能是由于菌株表面物質(zhì)的差異。這種差異可能是由細胞表面蛋白與個體血清型的特異性改變引起的，特別是與聚集過程中介質(zhì)表面的相關(guān)蛋白有關(guān)[23]。此外，大腸桿菌每個細胞的鞭毛在蜂群期間會加倍[24]。而泳動能力與鞭毛的存在有關(guān)，通常生物膜的形成與鞭毛數(shù)量的增加有關(guān)[25-26]。鞭毛可以增加細菌的運動能力，使細菌在泳動期間向有利環(huán)境移動，并通過在宿主表面上黏附和形成生物膜提高病原體的毒力[27]。細菌疏水性通常與黏附性有關(guān)，會因菌株的不同而不同，并且受細菌表面結(jié)構(gòu)的影響[28]。本研究采用BATH法對大腸桿菌O157:H7的疏水性進行了測定，由于菌株對不同碳氫化合物的黏附程度具有差異，Dillon等[29]研究發(fā)現(xiàn)與二甲苯作用產(chǎn)生了最好的反應(yīng)效果，因此本研究的疏水性是通過與二甲苯的親和力評估。疏水性的差異可能是由于蛋白質(zhì)和多糖在不同細菌表面的分布和比例的不同所致，因為蛋白質(zhì)的存在可能導(dǎo)致更高的疏水性，而更親水的表面則與多糖的存在有關(guān)[30]。菌株的表面特性，如自聚能力、泳動能力、疏水性等，都會對生物膜的形成產(chǎn)生重要影響，菌株表面特性的差異取決于細菌表面物質(zhì)，尤其是表面蛋白種類和數(shù)量的不同會直接影響細菌的表面疏水性和自聚能力，進而影響細菌運動、黏附和生長[28]。

研究發(fā)現(xiàn)菌株群體泳動能力、疏水性分別與TSB、BE生物膜形成能力有顯著相關(guān)性。細菌的菌毛有助于細胞表面的疏水性，大部分菌毛含有高比例的疏水性氨基酸殘基，這些殘基在細胞表面特性和附著中起作用[31]。有研究表明，細菌細胞疏水性與疏水表面附著之間存在正相關(guān)[32]。但也有研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的疏水性與生物膜形成存在負相關(guān)[28]。然而本研究發(fā)現(xiàn)在TSB中，疏水性與生物膜形成相關(guān)性不顯著（P＞0.05），BE中生物膜形成和疏水性存在顯著的正相關(guān)（P＜0.01），疏水性與生物膜形成的相關(guān)性可能與菌株的培養(yǎng)基質(zhì)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)只有TSB中生物膜形成與群體泳動能力存在正相關(guān)，但是有研究發(fā)現(xiàn)，無論培養(yǎng)的基質(zhì)如何，運動性都未與單核細胞性李斯特菌的生物膜形成能力呈正相關(guān)[33]。自聚能力與2 種培養(yǎng)基中的生物膜形成均沒有相關(guān)性，然而在其他菌株的研究中有相反的結(jié)果，沙門氏菌在TSB中的生物膜形成與自聚能力存在正相關(guān)[11]。因此，還需要進一步從胞外聚合物產(chǎn)生量、生物膜的微觀結(jié)構(gòu)、生物膜形成相關(guān)基因的表達調(diào)控等方面研究有關(guān)肉汁培養(yǎng)基和實驗室標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基TSB對不同大腸桿菌O157:H7菌株在不銹鋼表面生物膜形成的機制，相關(guān)研究正在開展進行中。

4 結(jié) 論

大腸桿菌O157:H7可以在工廠中常用的不銹鋼表面形成生物膜。其生物膜形成能力受菌株、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)基質(zhì)顯著影響且存在交互作用；各菌株的自聚能力、泳動能力、疏水性等指標(biāo)呈現(xiàn)出顯著差異。其中群體泳動能力、疏水性分別與TSB、BE中生物膜形成能力有顯著相關(guān)性。需要進一步研究不同大腸桿菌O157:H7菌株在不銹鋼表面生物膜形成的機制。