蛹蟲草及其下腳料水提物聯(lián)合殼聚糖涂膜對西葫蘆保鮮效果的影響

石 浩， 張 慜*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

西葫蘆含有大量蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和鈣元素而深受廣大消費者青睞[1]，然而西葫蘆在生長、收獲、包裝運輸以及儲藏過程中，會由于微生物繁殖、氧化應激反應等原因，使果實質(zhì)量下降，影響其食用和商業(yè)價值[2]。采用冷藏的方法可減緩西葫蘆在采后運輸儲藏過程中出現(xiàn)的品質(zhì)劣變現(xiàn)象，但會帶來另外的問題，如冷凍傷害、嗜冷微生物繁殖等[3-4]。

殼聚糖作為一種理想涂層，因其優(yōu)良的抗菌性能可用于延長果蔬貨架期，另外殼聚糖本身可以與其他功能性天然食品添加劑一起作為成膜劑[5-6]。蛹蟲草（Cordyceps militaris，CM）是中國傳統(tǒng)的食藥兩用真菌，含蟲草素（3′-脫氧腺苷）、腺苷、蟲草酸、超氧化物歧化酶和蛹蟲草多糖等活性成分[7]。蛹蟲草提取物具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等生物活性。而蛹蟲草下腳料是蛹蟲草固體培養(yǎng)后去除子實體后留下的子座和部分固體培養(yǎng)基組成的混合物，含有核苷類抗菌性物質(zhì)，如蟲草素等[8-9]。超微粉碎技術是一種新型的制粉技術，處理后的材料粒徑可達到0.1μm，在此粒徑下粉末能夠表現(xiàn)出優(yōu)異的性質(zhì)，如更高活性成分溶出率和更強的抗氧化性[10]。

作者研究的目的是探求蛹蟲草及其下腳料超微粉末的水提物聯(lián)合殼聚糖涂膜對西葫蘆冷藏期間的保鮮效果。評估了不同涂膜劑的抗氧化與抑菌性質(zhì)及西葫蘆品質(zhì)參數(shù)變化，為西葫蘆貯藏及保鮮提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西葫蘆：市售。挑選無機械損傷、無病蟲侵染、成熟度基本一致的西葫蘆作為試驗材料；蛹蟲草及其下腳料：湖南炎帝生物技術有限公司提供（下腳料主要包括蛹蟲草收割后殘留的子座及微量固體培養(yǎng)基）；殼聚糖、DPPH、冰乙酸、抗壞血酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、醋酸鈉、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚等試劑均為國產(chǎn)分析純；大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、 金 黃 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus）、變異鏈球菌（Streptococcus mutans）均為作者所在實驗室保藏。

1.2 儀器與設備

CJM-SY-A高能納米沖擊磨：秦皇島市太極環(huán)納米制品有限公司產(chǎn)品；UV-1780紫外可見分光光度計：日本島津公司產(chǎn)品；PL203電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；TA.XT.Plus物性分析儀：英國Stable Mico System公司產(chǎn)品；TDL-60B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品。

1.3 蛹蟲草及其下腳料水提物提取

將蛹蟲草及其下腳料60℃烘干至恒重，剪成小段并研磨20 min，在（2±1）℃下超微粉碎處理4 h得到最終粉末。按照料液比1 g∶40 mL，在60℃條件下水浴提取2 h，過濾取濾渣按照相同條件提取2 h，合并兩次濾液，60℃下通過旋轉蒸發(fā)濃縮至100 mL，得到1 g/mL的濃縮水提液，冷藏備用。

1.4 不同涂膜劑的制備及活性測定

1.4.1 不同涂膜劑的制備5種處理組涂膜劑的配制如下：殼聚糖涂膜劑（Chi）制備：先配置體積分數(shù)為1%的冰乙酸溶液，再加入質(zhì)量分數(shù)為1%的殼聚糖，在60℃下磁力攪拌至完全溶解，并在4℃下靜置；蛹蟲草水提物涂膜劑（CM）制備：將蛹蟲草濃縮水提液與蒸餾水按照體積比1∶99配置成體積分數(shù)為1%的蛹蟲草水提液，4℃下靜置過夜備用；下腳料水提物涂膜劑（SS）制備：類似CM制備方法；殼聚糖復配蛹蟲草水提液涂膜劑（Chi+CM）制備：將體積分數(shù)1%殼聚糖涂膜劑與質(zhì)量分數(shù)1%蛹蟲草水提物涂膜劑按照體積比1∶1混合，攪拌均勻后4℃下靜置備用；殼聚糖復配蛹蟲草下腳料水提液涂膜劑（Chi+SS）制備：類似Chi+CM制備方法。對照組涂膜劑為蒸餾水。

1.4.2 不同涂膜劑的抗氧化能力測定 涂膜劑的抗氧化活性參照文獻[11]確定，使用DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除率法，以維生素C（VC）為陽性對照。

1.4.3 不同涂膜劑的抑菌能力測定 參照文獻[12]并稍作修改，主要采用抑菌圈法測定。

1.5 不同涂膜劑涂膜處理的西葫蘆品質(zhì)測定

1.5.1 西葫蘆涂膜處理 處理組：每次隨機挑選西葫蘆置于5種涂膜劑中浸泡2 min后取出并自然晾干；對照組：隨機挑選西葫蘆以蒸餾水處理相同時間并自然晾干，每個處理重復3次。將處理后的所有樣品用聚乙烯袋包裝，包裝置于6℃下冷藏，在不同時間測定相關指標。

1.5.2 失重率 采用差量法測定[13]。

1.5.3 色澤 采用色差計法[13]。每個處理組測定8次西葫蘆赤道附近4個方位的L*、a*和b*值。

1.5.4 硬度 參照文獻[14]并有所修改，采用質(zhì)構儀測定。

1.5.5 可溶性固形物 采用手持式折光儀測定[15]。

1.5.6 維生素C含量 參考曹建康等的方法進行測定[15]。

1.5.7 丙二醛含量 參考曹建康等的方法進行測定[15]。

1.5.8 過氧化物酶（POD）活性 參考曹建康等的方法并稍作修改[15]。

1.5.9 多酚氧化酶（PPO）活性 參考曹建康等的方法并稍作修改[15]。

1.5.10 菌落總數(shù) 參照王國英的方法測定[16]。

2 結果與分析

2.1 不同涂膜劑抗氧化性及抑菌能力測定

2.1.1 不同涂膜劑對DPPH清除能力測定 不同涂膜劑在不同質(zhì)量濃度下對DPPH的清除能力如圖1所示，所有涂膜劑的DPPH清除能力在0～1.0 mg/mL范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度增加而增加。當質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，Chi，CM，SS，Chi+CM和Chi+SS的自由基清除能力分別為22.42%，43.31%，39.18%，46.90%和33.38%，均明顯低于VC（99.76%）。而單獨CM的DPPH自由基清除能力強于SS以及Chi+SS，與Chi聯(lián)合后抗氧化能力顯著提高（P＜0.05）?？赡苁荂M中的活性成分與殼聚糖分子協(xié)同作用，并且殼聚糖分子表面積較大，使CM更加均勻地分布于溶液中。以上結果與ZHANG Hao等人發(fā)現(xiàn)類似[17]。

圖1 不同質(zhì)量濃度涂膜劑DPPH清除率變化Fig.1 Effect of different coating concentration on the scavenging rate of DPPH

2.1.2 不同涂膜劑抑菌能力測定 不同涂膜劑的抑菌能力如表1所示，Chi+SS對于大腸桿菌的抑制作用明顯低于其他涂膜劑（P＜0.05），而其他涂膜劑之間差異不顯著（P＞0.05）；而對于銅綠假單胞菌菌來說，Chi+SS和Chi+CM的抑菌效果明顯高于其他實驗組（P＜0.05）；對于金黃色葡萄球菌和變異鏈球菌來說，CM和SS抑菌效果不明顯，而Chi+CM抑菌能力明顯強于其他涂膜劑（P＜0.05）。總體看來Chi+CM對于革蘭氏陽性菌抑制作用強于對革蘭氏陰性菌的抑制作用，并且強于CM、SS以及Chi單獨作用時的效果。CM對大腸桿菌抑制效果較好，結合Chi后對實驗所用4種菌都具有廣泛的抗菌活性，DONG Caihong發(fā)現(xiàn)CM甲醇提取物對于大多微生物具有良好的抗菌活性，原因可能與提取劑有關[18]。

2.2 不同涂膜處理對冷藏條件下西葫蘆品質(zhì)的影響

2.2.1 失重率的變化 由圖2可知，隨著儲藏期的延長，西葫蘆的質(zhì)量損失率顯著增加（P＜0.05）。其中對照組在整個儲藏期過程中質(zhì)量損失率明顯高于其他實驗組，當儲藏期超過16 d時，對照組和SS的質(zhì)量損失率顯著高于其他處理組，而Chi+CM組失水率最低，可能是西葫蘆經(jīng)蛹蟲草活性水提物質(zhì)和殼聚糖涂膜后，能夠改變果蔬內(nèi)部的氣體成分起到類似氣調(diào)包裝儲藏類似的效果，減少了西葫蘆表面水分的揮發(fā)[19]。

表1 不同涂膜劑對4種細菌抑菌圈直徑的影響Table 1 Effect of different coating agents on the diameter of inhibition zone of four bacteria

圖2 不同涂膜處理對西葫蘆失重率的影響Fig.2 Effect of coating treatments on the weight loss of zucchini

2.2.2 色澤的變化 圖3顯示了不同涂膜處理條件下西葫蘆在儲藏期間顏色參數(shù)的變化情況，主要包括ΔL*，Δa*和Δb*。從圖3（a）中可以發(fā)現(xiàn)，西葫蘆冷藏條件下的亮度值隨著儲存時間的延長先增加后減少，第24天時，CM和Chi+CM處理組的亮度變化值明顯小于其他組，分別為-1.25±0.233和-0.215±0.199。而從圖3（b）中可以看出，西葫蘆表面的Δa*值隨儲藏時間增加，12 d后CM組和SS組樣品的紅綠值變化最小。到24 d，對照組樣品的綠值下降最大達到4.51±0.11，顯著高于其他組（P＜0.05）。而SS和CM組的綠色值得到了較好的保護，最終變化值＜2。圖3（c）顯示的是不同實驗處理對西葫蘆表面黃藍值隨變化的影響，樣品黃值隨時間的延長而不斷增加，當儲藏時間超過12 d時，對照組和SS組的Δb*顯著高于其他實驗組（P＜0.05）。在第24天，Chi組，CM組，Chi+CM以及Chi+SS組西葫蘆黃值變化量顯著低于對照組和SS實驗組（P＜0.05），但這4組之間的差異不明顯（P＞0.05）。相比于對照組，經(jīng)過CM涂膜處理能夠有效減緩西葫蘆儲藏過程中亮度值和綠值的下降速率，降低黃值的變化幅度。這主要是因為CM及SS水提物中含有大量具有抗氧化活性或抗菌能力物質(zhì)，如酚類、黃酮類和核苷類物質(zhì)，這些物質(zhì)可以延緩西葫蘆中酚類物質(zhì)的降低，抑制多酚氧化酶的活性和相關腐敗微生物的繁殖，從而維持西葫蘆在儲藏過程中的新鮮色澤[20]。

圖3 不同涂膜處理對西葫蘆ΔL*、Δa*和Δb*影響Fig.3 Effect of coating treatments on theΔL*、Δa*、Δb*value of zucchini

2.2.3 硬度的變化 圖4顯示了不同涂膜處理對西葫蘆在冷藏條件下表面硬度的影響，西葫蘆表面硬度隨著儲藏時間的延長呈下降的趨勢。第16天后，Chi+CM處理組樣品的硬度值明顯高于其他處理組（P＜0.05）；而對照組在15 d之前硬度值下降幅度小，20 d之后下降速率明顯高于其他實驗組（P＜0.05）。第24天時Chi+CM處理組西葫蘆表面硬度值最高，Chi、CM和Chi+SS涂膜處理的實驗組硬度值之間沒有顯著差異（P＜0.05），但均高于對照組，這與WILLEKE等發(fā)現(xiàn)一致。蛹蟲草水提物聯(lián)合殼聚糖涂膜處理能夠有效延緩西葫蘆表面硬度的下降，原因可能是蛹蟲草提取物中的活性物質(zhì)對果皮細胞壁中的果膠多糖具有保護作用，而果膠多糖的增溶和解聚作用能夠延遲果實軟化[2，13]。

圖4 不同涂膜處理對西葫蘆硬度影響Fig.4 Effect of coating treatments on the firmness of zucchini

2.2.4 可溶性固形物和VC質(zhì)量分數(shù)的變化 圖5（a）顯示了冷藏條件下西葫蘆中可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)隨時間的變化。隨著儲存期增加，可溶性固形物先增加然后減少。Chi+SS和Chi+CM處理在第16天時具有最高的可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)，而其他處理組在第4天到第12天之間顯示最高值。可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)主要與果蔬成熟度有關，表明CM和SS聯(lián)合Chi處理能夠有效延緩西葫蘆的采后成熟時間，可能是西葫蘆在發(fā)育過程中積累了大量糖。采摘后這些糖主要用來進行呼吸作用，而殼聚糖聯(lián)合蛹蟲草及其下腳料水提物涂膜能夠在西葫蘆表面形成一層致密具有還原作用的薄膜，能夠減緩植物呼吸作用，從而減少貯藏過程中糖分的消耗，使可溶性固形物維持在較高水平。 有研究發(fā)現(xiàn)采用鈣離子涂膜與氣調(diào)結合也能夠增加西葫蘆TSS保留率[20]。

圖5 （b）顯示了不同涂膜處理的西葫蘆冷藏條件下抗壞血酸質(zhì)量分數(shù)的變化。隨著儲藏時間的延長，抗壞血酸質(zhì)量分數(shù)一直減少，相較于其他組，12 d前CM處理組的抗壞血酸質(zhì)量分數(shù)維持在較高水平，12 d后Chi+CM實驗組抗壞血酸質(zhì)量分數(shù)明顯高于其他組（P＜0.05）?？箟难嵋资墉h(huán)境中的活性氧（ROS）如過氧化氫（H2O2）、超氧化物和羥基自由基引起的氧化應激反應導致質(zhì)量分數(shù)下降[21]。而CM中含有的抗氧化性成分能夠作用于環(huán)境中的活性氧，進而降低西葫蘆中抗壞血酸在貯藏過程中的損耗，另外CM聯(lián)合殼聚糖后DPPH清除能力明顯提升，因此Chi+CM涂膜處理能更好地延緩西葫蘆中抗壞血酸降解。

圖5 不同涂膜處理對可溶性固形物和西葫蘆VC質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.5 Effect of coating treatments on the soluble solid and VC content value of zucchini

2.2.5 丙二醛含量的變化 如圖6所示，西葫蘆中MDA含量隨儲存期的增加而增加，對照組值在第8天后明顯高于處理組。Chi+CM組儲藏期間一直處于較低水平，第24天時西葫蘆中丙二醛含量在所有處理組中最低。一般不同種類的西葫蘆在冷藏條件下受到的冷害程度不同，受到的冷害程度越低果實MDA含量也越低[4]。該結果證明CM與Chi聯(lián)合涂膜作為一種活性氧清除劑，能夠有效減少西葫蘆在冷藏期間因氧化應激和氧化損傷引起的外表損傷。另外也有研究表明，腐胺處理等措施也能夠減少西葫蘆冷藏過程中的氧化應激代謝產(chǎn)物，提高果實的耐凍屬性[22-23]。

2.2.6 POD和PPO活性的變化 過氧化物酶（POD）是水果和蔬菜中一種重要的氧化還原酶，對外界刺激、病原菌侵染、貯藏環(huán)境、加工條件十分敏感[24]。圖7（a）顯示了不同涂膜處理對冷藏期間西葫蘆POD活性的影響，西葫蘆中的POD活性隨時間增加不斷上升，對照組在第20天達到峰值，且明顯高于處理組（P＜0.05）。儲藏8 d后，Chi和SS處理組西葫蘆中POD活性與其他處理組開始出現(xiàn)明顯差異（P＜0.05）。24 d時，Chi+CM組最低，而Chi、CM和Chi+SS組之間差異不明顯（P＞0.05）。隨著儲藏時間增加，西葫蘆受到低溫脅迫也不斷加深，POD活性上升明顯，而殼聚糖以及蛹蟲草水提物涂膜能保護西葫蘆表面細胞膜，能夠有效清除或者抑制西葫蘆體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，延緩POD酶活上升，減輕冷害作用。張秀蘭等人也發(fā)現(xiàn)赤霉素和殼聚糖聯(lián)合涂膜處理能夠延緩毛竹筍中POD酶活的增加，提升保鮮效果[25]。

圖6 不同涂膜處理對西葫蘆丙二醛含量的影響Fig.6 Effect of coating treatments on the malondialdehyde content value of zucchini

從圖7（b）中可以看出，每個處理組西葫蘆中的PPO活性隨時間增加呈上升趨勢，儲藏16 d后，對照組的PPO活性顯著高于其他處理組（P＜0.05），儲藏結束時最高。其他處理組PPO活性顯著低于對照組相（P＜0.05），但是各處理組之間差異并不明顯（P＞0.05）。該結果說明CM，SS和Chi涂膜能在西葫蘆表面形成保護屏障，減少氧氣對西葫蘆內(nèi)部多酚物質(zhì)的氧化破壞，延緩了PPO活性的變化從而減少褐變，這和之前觀察到的西葫蘆儲藏期內(nèi)顏色變化一致。也有研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖和丙酸鈣聯(lián)合處理能夠降低鮮切香蕉皮在儲藏期間的PPO活性并且抑制了褐變和微生物活性[26]。

圖7 不同涂膜處理對西葫蘆過氧化物酶和多酚氧化酶活性的影響Fig.7 Effect of coating treatments on the activity of POD，PPO of zucchini

2.2.7 菌落總數(shù)的變化 微生物腐敗是影響新鮮水果蔬菜貯藏品質(zhì)的最重要因素之一。圖8顯示，儲藏期間西葫蘆表面的微生物數(shù)量不斷增加，第24天時對照組樣品中的微生物數(shù)量明顯高于其他處理組，而Chi和Chi+CM處理組中的菌落總數(shù)保持在較低水平，這和不同涂膜劑抑菌能力的結果一致。CM結合殼聚糖涂膜處理可有效抑制西葫蘆在冷藏過程中微生物的生長，原因是殼聚糖和CM均具有抑菌作用，且形成的Chi-CM復合膜結構致密能夠減少空氣中氧氣進入果蔬內(nèi)部，從而最終控制水果蔬菜中微生物的呼吸生長。

圖8 不同涂膜處理對西葫蘆菌落總數(shù)的影響Fig.8 Effect of coating treatments on the total numbers of colony of zucchini

3 結語

在Chi、CM、SS、Chi+CM和Chi+SS 5種涂膜劑中，Chi+CM復合涂膜劑的DPPH自由基清除能力較好，抑菌圈實驗結果也證明殼聚糖與蛹蟲草水提物復合涂膜能夠提高殼聚糖對革蘭氏陽性菌抑制能力。將5種涂膜劑應用于西葫蘆，在6℃條件下冷藏24 d后發(fā)現(xiàn)，Chi+CM涂膜能夠有效降低西葫蘆在儲藏期間的質(zhì)量損失、褐變以及可溶性固形物和抗壞血酸質(zhì)量分數(shù)的下降。通過形成致密的CMChi復合膜系統(tǒng)，能夠減少因氧化應激和氧化損傷引起的MDA積聚以及POD和PPO酶活的上升，抑制西葫蘆冷藏過程中微生物的繁殖。因此，殼聚糖聯(lián)合蛹蟲草提取物涂膜能夠?qū)崿F(xiàn)西葫蘆冷藏過程中品質(zhì)維持，為殼聚糖聯(lián)合天然活性成分涂膜保鮮果蔬提供一定的依據(jù)。