意識障礙動物模型制作的研究進展

劉 倩，孫偉銘，馮 珍

(南昌大學a.第一附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科； b.第一臨床醫(yī)學院，南昌 330006)

近年來隨著醫(yī)療水平的不斷提高，顱腦損傷救治水平不斷提高，大量危急患者被搶救成功，但是很多患者因長期腦組織缺血、缺氧、壞死等進一步誘發(fā)腦神經(jīng)元變性壞死，最終導致神經(jīng)功能喪失而形成意識障礙(disturbance of consciousness，DOC)，表現(xiàn)為患者對外界刺激失去反應，包括運動和感覺功能，只保留自主神經(jīng)系統(tǒng)功能的狀態(tài)[1]，給患者家庭和社會帶來了極大負擔。目前，從臨床診斷和鑒別的角度出發(fā)，意識障礙可以區(qū)分為腦死亡(brain death,BD)、昏迷(coma)、植物狀態(tài)(vegetative state,VS)、最低意識狀態(tài)(minimally conscious state,MCS)等類型[2]。

由于意識障礙的類型多樣，致病機制較復雜，實驗研究和臨床治療顯得尤為重要。以人作為試驗對象來研究疾病在時間、空間上存在諸多局限性，且在方法和倫理上受到限制。因此醫(yī)學實驗常用動物模型作為試驗基礎。借助于動物模型，可以突破以上研究的局限性，獲得條件一致且數(shù)量龐大的實驗材料，能更準確地獲得實驗結(jié)果并與人類意識障礙進行比較研究，更方便有效地研究人類意識障礙的原發(fā)性、繼發(fā)性損傷機制以及生理病理過程，為診斷和治療提供依據(jù)。動物模型建立的最終目的是防治疾病，而疾病模型研究結(jié)果的可靠程度取決于模型與人腦意識障礙的相似性或可比性[3]。選擇合適的動物模型將有助于實驗研究的進行。本文就國內(nèi)外常用的意識障礙動物模型的建模方法和模型評價作一綜述。

1 自由落體撞擊法動物模型

經(jīng)典“自由落體撞擊法”是較早用于制作意識障礙動物模型的方法，即重物在動物上方的滑竿中自由落下，撞擊頭部致腦損傷，構(gòu)建意識障礙動物模型。

1981年FEENEY等[4]設計了自由落體撞擊致腦損傷模型。2004年高燕等[5]改進FEENEY的自由落體模型裝置，采用電磁鐵釋控開關自由落體模型，以不同沖擊力(200 g×cm、600 g×cm、1000 g×cm)致大鼠輕、中、重度腦損傷，證實腦組織出現(xiàn)不同程度的改變，與致力傷大小成正比。2009年宋揚等[6]在此模型的基礎上做了一些改進，使大鼠頭部受已知重量的自由落體撞擊致腦損傷，發(fā)現(xiàn)所有創(chuàng)傷組均見明顯、廣泛的蛛網(wǎng)膜下腔出血，符合腦損傷改變。證明了本體系可用于建立和量化評價大鼠創(chuàng)傷性腦損傷情況。陳琴等[7-8]利用改進后的自由落體撞擊法成功地建立了大鼠意識障礙模型，證明了正中神經(jīng)電刺激(median nerve electrical stimulation,MNES)和經(jīng)顱直流電刺激(transcranial direct current stimulation,tDCS)可改善腦損傷(traumatic brain injury,TBI)后昏迷大鼠的意識狀態(tài)水平。

自由落體撞擊法動物模型主要是通過加速型腦損傷模擬臨床上的局限性腦挫裂傷，該模型損傷明顯、部位局限，癥狀恢復慢，非損傷區(qū)腦組織無明顯損傷，可用于研究局限性腦挫裂傷造成的意識障礙[9]。

2 沖擊加速性動物模型

沖擊加速性動物模型對自由落體撞擊法進行改進，通過增加泡沫墊和鐵盤來保證外力負荷的瞬時性和彌漫性，模擬閉合性直線加速顱腦損傷，是一種在垂直面上的直線加速打擊致顱腦損傷的意識障礙模型。

1994年MARMAROU等[10]對自由落體撞擊法模型進行改進，用于研究延長性昏迷和彌漫性軸索損傷。方法是動物俯臥于海綿平臺上，在顱骨表面的正中放置有槽金屬圓盤，重物自上方滑桿中垂直落下撞于圓盤上引起顱腦損傷。2000年王君宇等[11]對MARMAROU的實驗裝置進行改進，建立彌漫性軸索損傷合并局灶性腦挫傷模型。在骨窗相適應的位置的墊片上加一個圓柱狀突起，產(chǎn)生廣泛的彌漫性軸索損傷，又可將打擊力度直接作用到硬膜上產(chǎn)生局灶性腦挫傷。2006年張繼東等[12]采用改進的MARMAROU致傷模型建立家兔直線加速型腦損傷合并尺骨骨折模型，致傷后家兔未見顱骨骨折，腦組織外觀無局灶性挫裂傷改變，行病理組織學檢查證明為彌漫性腦損傷。

此模型的優(yōu)點是同時具備沖擊和加速度，損傷機制與臨床實驗的致傷機制相吻合，且不易出現(xiàn)直接沖擊硬膜導致的腦干傷，血壓變化小，死亡率低，便于對致傷機制加以研究。

3 液壓沖擊顱腦損傷動物模型

液壓沖擊法是常用的建立動物意識障礙模型的方法。該模型在顱骨鉆孔處，運用已知重量的流體沖擊完整的硬腦膜，使壓力傳遞至硬膜下空間，導致傳遞性的彌漫性腦損傷，被廣泛用于研究顱腦損傷機制。

1966年LINDGREN等[13]最先利用液壓沖擊法建立兔的顱腦損傷模型。1987年DIXON等[14]設計了大鼠液壓沖擊致腦損傷模型，利用壓力傳感器測出腦組織所承受的壓力，以復制輕、中、重度顱腦損傷動物模型。2000年張永亮等[15]對該模型進行改進，建立大鼠分級側(cè)位液壓沖擊腦損傷模型，精確地控制沖擊氣壓的大小，并在沖擊后能很快釋放裝置內(nèi)的壓力，使腦組織不受再次損傷，發(fā)現(xiàn)側(cè)位液壓沖擊腦損傷隨沖擊壓力的增加而加重，以沖擊側(cè)大腦半球為最重，也可波及對側(cè)及腦底部。2016年金衛(wèi)蓬等[16]采用3種液壓沖擊力建立小鼠液壓沖擊腦損傷模型，發(fā)現(xiàn)打擊力度與小鼠腦損傷程度、死亡率及腦挫裂傷灶和MRI影像學改變成正比。2017年吳志寶等[17]利用液壓沖擊腦損傷大鼠模型，觀察了腦損傷核因子E2相關因子2-抗氧化反應元件通路的時程表達變化。

液壓沖擊損傷模型的優(yōu)點為可精確地復制分級的腦損傷，可用于研究顱腦損傷病理、分子病理、生物力學、死亡原因及法醫(yī)學鑒定；缺點為可引起神經(jīng)源性肺水腫、腦橋和延髓損傷致動物死亡[18]。

4 慣性加速性腦損傷動物模型

慣性加速性腦損傷動物模型是因頭部揮鞭樣或加速性旋轉(zhuǎn)運動形成的剪應力造成神經(jīng)軸索損傷的動物模型，顯微鏡下可見神經(jīng)軸索斷裂、軸漿溢出、軸漿運輸受損甚至中斷[19]。方法是直線或旋轉(zhuǎn)外力作用于與實驗裝置固定聯(lián)動的動物頭部，造成頭部的揮鞭樣或加速性旋轉(zhuǎn)運動而導致神經(jīng)軸索損傷。

1982年GENNARELLI等[20]利用該方法建立了慣性加速損傷動物模型，將狒狒頭部與氣動和鏈鎖裝置聯(lián)動，使狒狒頭部做60°的角形加速運動，發(fā)現(xiàn)狒狒出現(xiàn)了持續(xù)性的意識喪失，且存在彌漫性軸索損傷。2000年SMITH等[21]對加速損傷裝置進行改進，發(fā)現(xiàn)延長性昏迷主要是因為腦干部位軸突發(fā)生彌漫性損害。國內(nèi)設計的電機驅(qū)動的托盤式加速機，發(fā)現(xiàn)以角加、減速度瞬時旋轉(zhuǎn)60°～80°作用于動物后，可造成3～4 h的持續(xù)性腦昏迷[22]。

此模型的缺點為大型動物較易引發(fā)彌漫性軸索損傷，小型動物的動物模型復制更困難，死亡率高；優(yōu)點為模型的致傷機制為加速性損傷，沒有沖擊因素，對運動可較好地控制。目前，瞬間加速性旋轉(zhuǎn)模型在彌漫性軸索損傷研究中代表性最強、應用最廣泛。

5 顱腦爆炸腦損傷動物模型

顱腦爆炸傷模型是動物頭顱受爆炸沖擊波作用后，腦干及高級中樞受到?jīng)_擊損傷制作的動物意識障礙模型，可用于研究爆炸性武器沖擊波及碎片作用于大腦所致的腦損傷。

2000年SUNESON等[23]用豬進行顱腦爆炸傷實驗，觀察到傷后動物均出現(xiàn)心率減慢、呼吸暫停等腦干抑制現(xiàn)象。2007年高波等[24]建立了犬顱腦爆炸傷模型，將爆炸球分別懸于距致傷動物右顳頂部不同但適當距離處，采用點爆炸源對犬的右顳頂部進行不同距離的爆炸。2016年郭運林等[25]制作了新西蘭大白兔改良爆震傷模型，證明該方法可制作穩(wěn)定重型顱腦爆震傷。

該模型可模擬沖擊波原發(fā)效應，致傷因素單一，且炸藥能量或動物致傷物距離可調(diào)節(jié)，穩(wěn)定性好，重復率高且操作安全，可用于臨床顱腦爆炸傷的實驗研究。缺點是震蕩區(qū)與挫傷區(qū)邊界不清，易引發(fā)顱內(nèi)血腫，死亡率高。

6 放射性顱腦損傷動物模型

放射性動物顱腦損傷模型是在動物清醒或麻醉狀態(tài)下，進行頭顱的放射性照射后造成腦損傷制作的動物意識障礙模型。

2003年邢詒剛等[26]在將大鼠麻醉后成功地建立了大鼠放射性顱腦損傷的動物模型。方法為：將大鼠麻醉后，俯臥于60CO治療機治療床，在一定的源皮距下照射，結(jié)束后取腦組織行病理組織學檢查。2004年王琛等[27]在大鼠清醒情況下建立大鼠放射性腦損傷模型，使用“熱記憶膜固定罩”，給予大鼠全腦照射，并用劑量儀測量所吸收的劑量。2018年張慧民等[28]用直線加速器進行腦部照射22 Gy后制作放射性顱腦損傷模型，觀察葡萄籽原花青素對放射性腦損傷大鼠學習能力及生長相關蛋白(GAP)-43的表達；符楨琳等[29]建立了放射性腦損傷模型，放射組小鼠予60CO γ射線照射。放射前、后分別檢測血漿中的纖維蛋白原含量，發(fā)現(xiàn)放射可致血漿中纖維蛋白原升高，沉積于腦組織的纖維蛋白原可能是繼發(fā)性腦損傷的原因。

該動物模型制作方法操作簡便，可重復率高，照射劑量確定，可排除麻醉藥物等其他因素的干擾，適用于放射性顱腦損傷的研究。

7 腦冷凍傷動物模型

腦冷凍傷模型模擬的是人腦挫傷，主要引起血管源性的腦水腫，是常用的顱腦損傷動物模型[30]。

2001年郭偉等[31]對楊氏[32]模型進行改良，成功地建立了大鼠的腦冷凍傷實驗模型，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元病理改變與傷后時間的延長密切相關，證明傷后局部腦組織微循環(huán)障礙、供血不足是誘導大腦神經(jīng)細胞發(fā)生變性壞死的主要原因。2007年陳世文等[33]將大鼠用盛有液氮的冷凍杯行硬腦膜外冷凍，傷后行病理檢查，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞周圍出現(xiàn)水腫，神經(jīng)元變性、壞死，神經(jīng)、膠質(zhì)細胞出現(xiàn)空泡樣變。證明了腦冷凍傷動物模型的穩(wěn)定可靠性。

腦冷凍傷動物模型為硬膜外冷凍法，定位準且操作簡單，冷凍時間確定，效果一致，可重復性好，符合腦外傷后病理生理改變。

8 光化學誘導法意識障礙動物模型

化學誘導法是通過使用特定的冷光源照射動物腦特定部位，引起化學反應形成血栓，造成動物大腦皮層損傷、皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)相對完整的動物意識障礙模型。

WATSON等[34]首先用光化學誘導法建立了腦梗死模型。2004年周薇等[35]用光化學誘導法建立了大鼠皮質(zhì)微血栓模型，具體方法為：在大鼠股靜脈注射紅玫瑰B后，使用能量確定的冷光源照射大鼠腦部特定部位，造成照射部位大腦皮質(zhì)的血管內(nèi)形成血栓，進而相應的皮層發(fā)生缺血性梗死，最終形成意識障礙。2012年楊峰等[36]用光化學法誘導建立大鼠局灶性腦梗死模型，發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)域神經(jīng)細胞發(fā)生變性、壞死，符合局灶性腦梗死的病理變化。

光化學誘導法建立意識障礙動物模型方法簡便，梗死程度穩(wěn)定，可重復性好，死亡率低，可用于制作進一步臨床研究的意識障礙動物模型。

9 立體定向電解法腦損傷模型

立體定向電解法是通過電流毀損動物的中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)造成意識障礙的實驗方法。2000年常鵬飛[37]等以不同強度的電流損毀貓中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，造成其不同程度的昏迷。2001年韓震[38]等用中腦被蓋絕緣電極插入損毀的方法，造成了大鼠不同程度意識障礙。具體方法為：大鼠吸入異氟醚麻醉后置于SN-Ⅲ型立體定位儀上，參照Paxinos等圖譜，選擇中腦被蓋部3個座標點先后用直徑0.2～0.3 mm、尖端裸露0.8～1.2 mm 的絕緣毀損電極插入，通以陽極直流電(6 V，1.5 min)，進行電解毀損。

電解損傷模型的優(yōu)點在于定位準確，致傷參數(shù)可調(diào)節(jié)，可重復性好、經(jīng)濟適用。缺點是電解損毀易引起機械性損傷，以及高熱和輻射造成局部、周圍組織損傷，腦組織的受損范圍較電解涉及區(qū)域大，且死亡率較高。

10 缺氧缺血性腦損傷模型

血管缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是由于各種原因誘發(fā)腦血管栓塞引起腦組織缺血缺氧，進一步誘發(fā)腦神經(jīng)細胞變性、壞死,最終導致神經(jīng)功能障礙喪失的一類疾病[39]。

2007年吳志強等[40]參照LONGA等[41]的方法并加以改進，通過線栓法成功制備了Wistar大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)局灶性腦缺血模型。2006年潘興華等[42]建立獼猴的血管缺血性腦損傷模型，將栓子運送到大腦中動脈使動脈分支栓塞，誘導缺血性腦損傷的發(fā)生。發(fā)現(xiàn)病變特點與臨床表現(xiàn)一致，該模型可靠、穩(wěn)定，可用于急、慢性治療研究及相關的基礎理論研究[30]。2008年賈小兵等[43]通過用改良后的四血管阻塞法加“針控線拴法”，建立了大鼠缺血性昏迷模型，為進一步研究缺血性昏迷動物的促醒實驗提供了較好的實驗模型。2017年宋紅花等[44]通過雙線結(jié)扎大鼠左側(cè)頸總動脈制作HIBD模型，探討新生大鼠HIBD模型的制作和早期鑒定。張丹等[45]對經(jīng)典Vannucci法進行改進，行小鼠左頸總動脈結(jié)扎，按照C1—C8條件缺氧建模，證明了該方法是用于新生兒缺血缺氧性腦損傷研究較為理想的動物模型。

HIBD模型的優(yōu)點為不用開顱且缺血、再灌注時間可控。但實驗操作上受許多因素影響，如動物體重、線栓粗細、插線深度及操作技術等；且該動物模型存在制作難度較大、成功率低，易繼發(fā)血栓形成、蛛網(wǎng)膜下腔出血等缺點。

11 小結(jié)

意識障礙類型多樣，致病機制復雜,動物模型的基本要求是：1)具有較好的可調(diào)控性；2)可操作性好；3)可重復性、再現(xiàn)性好；4)經(jīng)濟適用。意識障礙動物模型的制作方法繁多，模型適用領域不同且各有利弊。意識障礙的恢復是不可預測的，雖然臨床研究取得了重大進展，但仍然受到高變異性、有限的數(shù)據(jù)輸出和缺乏必要控制的阻礙[46]。本文討論了建立TBI誘導的意識障礙模型的方法及評價，研究者可根據(jù)實驗目的選擇合適造模方法，亦可對現(xiàn)有模型進一步改進，尋找新造模方法。