基因編輯及其在疾病治療中的應用研究進展

華亮 朱冰

DNA 雙螺旋結構的提出，開啟了現(xiàn)代分子生物學的時代。從此，人類對疾病尤其是遺傳性疾病的認識進入了DNA 分子層面。隨著基因測序技術的不斷發(fā)展，越來越多的疾病的分子機理被發(fā)現(xiàn)。2015年美國總統(tǒng)奧巴馬提出“精準醫(yī)療”的概念，通過修改或編輯基因序列的方式進行個體化疾病治療越來越成為研究和關注的熱點。

1 基因編輯的原理

基因編輯技術的基本原理大致相同：通過人工核酸內切酶，精確靶向特異性切割DNA 雙鏈誘導形成位點特異性的DNA 雙鏈斷裂（doublestrand break，DSB），DSB 產生后，激活細胞啟動兩種主要的天然修復機制：非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復（HRR）。通常，細胞主要通過NHEJ 方式進行修復，NHEJ 在斷裂DNA 修復重連的過程中，能夠在DSB 位點產生堿基隨機插入或缺失（indel），常造成移碼突變使基因失活，從而實現(xiàn)目的基因的敲除。若一個外源性供體基因序列存在，NHEJ 機制會將其連入雙鏈斷裂DSB 位點，從而實現(xiàn)定點的外源基因敲入。當一個帶有同源臂的重組供體存在時，細胞還會采取HDR 的方式對DSB 進行修復，供體中的外源目的基因會通過同源重組過程完整的整合到靶位點，從而實現(xiàn)特定位點的精確插入、缺失或者堿基置換，而不會出現(xiàn)隨機的堿基插入或丟失。

2 基因編輯的簡要發(fā)展歷程

1986年，Smithies 等［1］提出同源重組能夠被應用于人類疾病的治療，標志著基因組編輯時代的開啟。同年，Kirk R 等［2］用核內注射的方法對哺乳動物細胞內染色體上由突變造成的基因缺陷進行修復時首次提出基因編輯的概念。

借助不同的核酸內切酶平臺，研究人員能夠在靶基因組中制造位點特異性的DNA 斷裂點。伴隨著用于基因編輯的人工核酸內切酶平臺的發(fā)展，其介導的基因編輯技術也歷經了多個階段的變革。

2.1 大范圍核酸酶技術

大范圍核酸酶是一種具有較大切割位點（12～45 bp）的序列特異性核酸內切酶。研究者將其用于細胞系誘導靶序列附近產生DSB，以達到在基因組中敲除內源基因或敲入外源基因的目的，或矯正與單基因疾病相關的突變。它的編輯精度高，自身編碼基因較小，易包裝入AAV 載體中。但是，由于其種類限制，以及大部分大范圍核酸酶很難在人基因組上找到合適的位點，使其廣泛應用受到限制。

2.2 鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）技術

ZFP 是一類通過Cys2-His2 鋅指結構域結合DNA 的轉錄因子。ZFN 主要包括用于識別和結合特定DNA 序列重復的ZFP 和可以通過二聚體化非特異地切割DNA 的核酸內切酶Fok I。利用一對串聯(lián)的鋅指結合特異DNA，將Fok I 的兩個亞基帶到特定基因組位點，對DNA 進行切割產生DSB。該技術靶向結合效率高，但是其識別特定DNA 的鋅指序列需要通過文庫篩選來確定，鋅指核酸酶存在上下游DNA 序列的依賴效應，進一步加大了篩選的難度，無法實現(xiàn)對任意靶基因的結合，亦無法實現(xiàn)高通量的基因編輯。且可能產生脫靶效應，引發(fā)細胞毒性，對其推廣運用造成了一定的影響。

2.3 轉錄激活因子樣效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技術

與ZFN 相似，TALEN 也由兩部分構成，一部分是由33-35 個氨基酸的重復單元組成，通過位于12 位和13 位的兩個可變氨基酸殘基識別并結合DNA 序列，其唯一靶向限制是對N 端結構有5′T的要求，所以，理論上可以通過構建不同的位于12位和13 位的兩個可變氨基酸殘基達到靶向幾乎任何DNA 序列的目的。另一部分是與ZFN 相同的限制性核酸內切酶Fok I。TALEN 技術在一定程度上克服了ZFN 技術存在的脫靶問題，設計簡單，特異性和活性更高。目前，已在人類多功能干細胞和體細胞中有效誘導NHEJ 和HDR。但是，TALEN 的體積比ZFN 大，使得某些病毒傳遞系統(tǒng)的包裝較困難，從而限制了其用于高通量的基因編輯。

2.4 成簇規(guī)律間隔短回文重復序列/成簇規(guī)律間隔短回文重復序列關聯(lián)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas）技術

CRISPR/Cas9 技術通過sgRNA 與靶標DNA中相對保守的PAM 序列的上游基因互補配對，再經Cas9 蛋白對靶標基因進行切割。通過設計與目標片段匹配的sgRNA，就可以精確地定位到所有的DNA 位置，然后由Cas9 剪切DNA 形成DBS。為了避免NHEJ 出現(xiàn)基因變異，可使用外源DNA模板進行HDR，對靶標基因進行修飾，從而實現(xiàn)精準基因編輯。且CRISPR 系統(tǒng)可以同時靶向多個基因，這對研究復雜的人類疾病上是一個巨大的進步。與ZFN 和TALEN 相比，CRISPR/Cas9 設計簡便、成本低、效率高，可用于高通量的基因編輯。然而，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)也有其不足之處，主要體現(xiàn)在功能發(fā)揮時系統(tǒng)對DNA 上PAM 序列的依賴性以及切割時潛在的脫靶效應。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，Cas9 只在具有PAM 序列且可以與sgRNA 互補配對的靶序列發(fā)生切割?；谶@些需要改善的方面，研究人員開創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)了一些識別更多樣PAM 的CRISPR/Cas 系統(tǒng)，這些優(yōu)化或改造的Cas9 可降低50～1 500 倍的脫靶率，極大地解決了脫靶問題。

2.5 單堿基編輯（Base editor，BE）技術

2016年，哈佛大學的David Liu 實驗室報道了一種基于脫氨酶與CRISPR/Cas9 系統(tǒng)融合形成的BE 技術［3］：由sgRNA 和經過改造的Cas9、胞嘧啶脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子組成的復合體。胞嘧啶脫氨酶可將胞嘧啶脫氨基變?yōu)槟蜞奏?，在DNA 復制過程中則變?yōu)樾叵汆奏?。BE 技術不引入DSB，不需要重組修復模板，且效率遠高于由DSB 引起的同源重組修復，對許多點突變造成的疾病具有很大的應用潛能。

2.6 表觀基因組編輯和轉錄調控

表觀遺傳修飾和轉錄調控是把各種表觀調控效應器融合到工程化缺陷型核酸酶（dCas9）上，利用dCas9 靶向識別并結合DNA 的特性，實現(xiàn)在特定位點上表觀基因組的編輯。這些調控效應器同dCas9 的結合拓展了CRISPR 在轉錄調控和表觀基因組編輯的應用范圍，且dCas9 的表觀基因組編輯具有很高的安全性和特異性，無明顯的脫靶效應，為體內表觀基因修飾和治療奠定了基礎。

3 基因編輯在疾病治療中的應用

基因編輯治療人類疾病在體內和體外都取得了成功。體內基因治療包括組織特異性靶向，局部遞送或靶細胞特異性基因表達；而離體療法靶向體外的細胞，這些修飾的細胞可用于疾病建?；蛴米髦委焺?。

3.1 體外基因編輯

體外基因編輯是從病人身上提取相應的細胞，在基因編輯后將細胞移植回患者相應部位以達到治療疾病的目的的治療方法。該技術最大的優(yōu)點在于它消除了捐贈者組織與移植者之間的免疫排斥。將所需基因轉移到造血干細胞，然后移植給患者已經改善甚至治療了血液系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的單基因病。如：X 連鎖嚴重的聯(lián)合免疫缺陷、腺苷脫氨酶、嚴重的聯(lián)合免疫缺陷、腎上腺腦白質營養(yǎng)不良、異染性白質營養(yǎng)不良、Wiskott-Aldrich綜合征和β-地中海貧血［4-5］。

通過基因編輯和NHEJ 對目的基因進行插入或敲除操作研究已經應用于包括鐮狀細胞病和地中海貧血在內的血紅蛋白?。?］。使用HRR 進行基因編輯也顯示出巨大潛力。如在影響造血系統(tǒng)的遺傳缺陷中，已經發(fā)現(xiàn)了許多疾病，包括溶酶體酶缺乏癥［7］，地中海貧血［8］，慢性肉芽腫病［9］和X 連鎖高IgM 綜合征［10］。

3.2 體內基因編輯

當受影響的細胞或組織無法從患者身上獲得，或者離體操作后無法有效地移植回患者體內，則必須進行體內基因編輯。

杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是基因突變引起的，導致骨骼肌和心肌進行性變性。利用AAV 載體將Cas9 和sgRNAs遞送到DMD 小鼠體內，能夠使DMD 基因外顯子缺失，靶細胞再通過NHEJ 對目的基因進行修復，從而部分恢復閱讀框，使骨骼肌和心肌的生化和功能改善［11-12］。

利用AAV 載體結合NHEJ 的基因編輯方法被用于中樞神經系統(tǒng)的遺傳病。學者們將所需成分直接注射到患者視網膜或大腦中治療這些疾病。如亨廷頓舞蹈癥［13］，常染色體顯性遺傳性視網膜色素變性［14］，以及萊伯先天性黑蒙癥10［15］。

對于需要基因較正或基因替代進行治療的疾病，其治療方式是使患者體內獲得足夠的體內HRR。這種方法已被用于治療一些肝臟代謝性疾病：鳥氨酸轉氨甲酰酶缺乏癥［16］、乙型血友?。?7］、黏多糖貯積癥Ⅰ、黏多糖貯積癥Ⅱ、法布雷病和戈謝病［18-19］。學者們還通過敲除同一代謝途徑中的基因，將Ⅰ型酪氨酸血癥轉變?yōu)楦夹缘蘑笮屠野彼嵫Y［20］。

3.3 病毒性疾病的基因編輯

基因編輯同樣被用于病毒性疾病。研究人員通過gRNA 和用AAVs 轉染的Cas9 成功去除了HIV 轉基因小鼠中跨LTR 和gag 區(qū)的病毒DNA 基因組［21］。一項針對病毒逃逸和突變的單獨研究表明，靶向HIV 基因組兩個不同區(qū)域的兩個強gRNA可以完全阻止病毒復制［22］。

乙型肝炎具有共價閉合的環(huán)狀DNA（cccDNA），其在肝臟中處于休眠狀態(tài)，且cccDNA 充當慢性感染和再激活轉錄的模板，因此抗病毒藥無法成功消除該病毒。研究人員通過HBV 靶向gRNA，并利用Cas9 切割cccDNA，造成多個缺失和突變，隨后通過宿主的NHEJ 機制對其進行了修復。結果顯示可以將HBV 感染減少多達八倍［23］。

3.4 表觀遺傳學疾病的基因編輯

表觀遺傳修飾的失調與多種人類疾病有關，基因編輯技術的應用為表觀遺傳機制異常疾病的研究和治療創(chuàng)造了一種全新的方法。如，在自然界中，表觀遺傳沉默可以導致靶基因表達在多個有絲分裂過程中完全減弱。通過靶向組蛋白和DNA 甲基轉移酶的不同組合在不同的位點實現(xiàn)對靶基因最大程度的抑制［24］?；谏窠浽獌?yōu)化的CRISPR 系統(tǒng)能夠在多個主要嚙齒動物神經元培養(yǎng)系統(tǒng)上實現(xiàn)強大，模塊化和可調的基因誘導以及多重基因調控［25］。研究證明，Cas9 系統(tǒng)在體內可以通過反表觀遺傳重塑激活內源性靶基因［26］，并被用于糖尿病，肌肉營養(yǎng)不良和急性腎臟疾病的小鼠模型中。此外，CRISPR-Cas9 還被用于體內小鼠視網膜色素變性模型中，通過使Nrl（棒狀光感受器的主要調節(jié)基因）失活而將棒狀光感細胞重編程為圓錐狀細胞，證明CRISPR-Cas9 可通過轉錄抑制防止視力喪失［27］。

4 結語與展望

在過去的十年中，基因編輯取得了長足的進步。特別是2013年后，隨著CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的開發(fā)，我們取得了更大的進步。借助這些工具，我們已經擁有了一類全新的療法來治療甚至治愈以前缺乏有效干預措施的疾病?；蚓庉嫾夹g將被應用于生物醫(yī)學的許多領域并將徹底改變這些領域。雖然，目前這一技術還需要加以完善。但是，我們相信：一旦該技術變得更普及，無疑將使患者受益。而這些技術肯定會得到進一步完善，并在未來的某一天可能會成為許多疾病的主流療法。