云南西雙版納辣木果腐病病原鑒定

何英云 陳興全 張永科 張祖兵 徐萬(wàn)壽 黃美智 張傳利 龍繼明 馬麗宣 田洋

摘要：【目的】明確辣木果腐病的病原菌種類，為該病的有效防控提供依據(jù)?！痉椒ā坎捎贸Ｒ?guī)組織分離法對(duì)采自云南西雙版納的辣木果腐病樣品進(jìn)行病原菌分離純化;將分離物于PDA培養(yǎng)基上26 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察其形態(tài)特征，在顯微鏡下觀察其孢子形態(tài)，初步確定其種屬;通過(guò)致病性測(cè)定、ITS序列分析等對(duì)病原菌種類進(jìn)行鑒定?！窘Y(jié)果】從感病的辣木果莢樣品中分離純化得到1株疑似致病真菌菌株YJiH-1，顯微鏡下觀察菌株YJiH-1的菌絲、單孢子、孢子囊、孢子梗和孢囊孢子等與已報(bào)道的笄霉（Choanephora spp.）高度相似。離體條件下接種菌株YJiH-1后，辣木果莢產(chǎn)生腐爛癥狀，并在接種發(fā)病的果莢病斑上分離到該病菌，符合柯赫氏法則。病原菌rDNA-ITS序列的BLAST同源性比對(duì)結(jié)果，菌株YJiH-1的rDNA-ITS區(qū)序列與印度巴豆瓜笄霉C.8-18菌株（登錄號(hào)KX462163）和印度CBS 178.86菌株（登錄號(hào)JN943007）的rDNA-ITS區(qū)序列完全一致（相似性100%）;與印度番木瓜瓜笄霉CP-5菌株（登錄號(hào)KX790359）的相似性為99%，進(jìn)一步確定該致病菌為瓜笄霉（C. cucurbitarum）?！窘Y(jié)論】引起云南西雙版納辣木果莢腐爛且表面有白色菌絲體的辣木果腐病病原菌為瓜笄霉（C. cucurbitarum）。

關(guān)鍵詞： 辣木;果腐病;形態(tài)特征;致病性測(cè)試;rDNA-ITS序列分析;瓜笄霉

中圖分類號(hào)： S763.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）09-2160-07

Seed pod rot pathogen identification of Moringa oleifera in Xishuangbanna， Yunnan

HE Ying-yun1，2， CHEN Xing-quan1， ZHANG Yong-ke3， ZHANG Zu-bing3，

XU Wan-shou1， HUANG Mei-zhi1， ZHUANG Chuan-li4，

LONG Ji-ming3， MA Li-xuan5， TIAN Yang6，7*

（1 College of Plant Protection， Yunnan Agriculture University， Kunming? 650201， China; 2Horticulture Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming? 650205， China; 3 Yunnan Institute of Tropical Crops， Jinghong， Yunnan? 666100， China; 4 College of Tropical Crops， Yunnan Agricultural University， Puer，Yunnan? 665000， China; 5 Yunnan Plateau Characteristic Agriculture Industry Research Institute，Kunming? 650201， China; 6 Yunnan Provincial Key Laboratory of Biological Big Data， Kunming? 650201， China; 7College of Food Science and

Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming? 650201， China）

Abstract：【Objective】To identify the pathogen of seed pod rot on Moringa oleifera， and provide theory basis for effective prevention and control on the disease. 【Method】The pathogen of diseased seed pods were isolated and purified from samples collected in Xishuangbanna， Yunnan by convention tissue separation. The isolated tissues were cultured on PDA culture under 26 ℃ constant temperature， its morphological characteristics were observed. Its species and genus were preliminarily identified， and its type was identified through pathogenicity test and ITS sequence analysis results. 【Result】A suspected pathogen strain YJiH-1 was isolated and purified from the diseased seed pod of M. oleifera， which was highly identical to the morphological characteristics of hypha， monospore， sporangium， spore stem， and sporangiospore with the reported Choanephora spp. Strain YJiH-1 was inoculated to healthy seed pod of M. oleifera in vitro， and the soft and rot symptom could be observed on the inoculated seed pods. Strain YJiH-1 could be re-isolated from the di-seased seed pod which conformed to the Kochs postulates perfectly. According to BLAST homology comparison of pathogen rDNA-ITS sequence， rDNA-ITS nucleotide sequence of strain YJiH-1 shared the highest identity of 100% with the Choanephora cucurbitarum isolates of Indian croton C.8-18（accession No. KX462163） and Indian CBS 178.86（acce-ssion No. JN943007）， while it had 99% similarity with C. cucurbitarum Indian papaya isolate CP-5（accession No. KX790359）. Based on the results of morphological characteristics observation， pathogenicity test and rDNA-ITS sequence analysis of the pathogen isolated from seed pod rot on M. oleifera， the causal agent was identified as C. cucurbitarum. 【Conclusion】The pathogen causing seed pod rot of M. oleifera with white mycelium in Xishuangbanna， Yunnan is C. cucurbitarum.

Key words： Moringa oleifera; seed pod rot; morphological characteristic; pathogenicity test; rDNA-ITS sequence analysis; Choanephora cucurbitarum

Foundation item： Yunnan Key Research and Development Project（2017ZF004）; Yunnan University Science and Technology Innovation Team Support Project（Yunjiaoke〔2014〕22）; Special Project of Modern Agricultural Industry Technology System Construction（CARS-11-03A）

0 引言

【研究意義】辣木（Moringa spp.）隸屬于辣木科辣木屬，是一種多年生速生小喬木，原產(chǎn)于印度，19世紀(jì)引種到我國(guó)，現(xiàn)主要在臺(tái)灣、云南、海南和貴州等地種植（黃麗娜等，2016;夏濤等，2018）。目前報(bào)道的辣木上主要病害有果腐病、白粉病、枝條回枯病、根莖基腐病等，其中辣木果腐病是最普遍、最嚴(yán)重的病害之一。據(jù)報(bào)道，云南省辣木種植區(qū)果腐病平均發(fā)病率為4%～72%，在降水密集的7—8月果莢受害率達(dá)90%以上，嚴(yán)重時(shí)整條果莢開(kāi)裂，露出種仁，種籽減產(chǎn)（黃美智等，2019）。引起辣木果腐病的病原較復(fù)雜，可能由多種病原菌復(fù)合侵染造成，且不同病原菌在致病性方面存在差異。因此，明確辣木果腐病病原菌種類，對(duì)辣木果腐病的防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)內(nèi)外對(duì)辣木的研究主要包括栽培技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、化學(xué)成分分析、提取物功能分析等，針對(duì)辣木某一種病蟲(chóng)害的深入研究較少。Kshirsagar和DSouz（1989）研究發(fā)現(xiàn)夏威夷內(nèi)臍蠕孢[Drechslera（Cochliobolus） hawaiiensis]可侵染辣木，引起果莢腐爛;Pande和Ghate（1998）、Lezcano等（2014）研究發(fā)現(xiàn)半裸鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和F. solani可為害辣木果莢和幼苗莖干;Resmi等（2005）、蔣桂芝等（2007）通過(guò)致病性測(cè)定及菌絲、分生孢子形態(tài)特征觀察，將辣木果腐病的病原菌鑒定為半裸鐮刀菌（F. semitectum）;蔡志英等（2016）通過(guò)對(duì)西雙版納辣木種植區(qū)辣木果莢腐病病樣進(jìn)行分離鑒定、柯赫氏驗(yàn)證及致病性測(cè)定，證實(shí)蘭生炭疽菌（Colletotrichum chlorophyti）不僅能引起辣木果莢腐爛，同時(shí)也可侵染葉片引起葉斑;He等（2017）從辣木果腐病病樣中分離到接合菌門接合菌綱毛霉目笄霉科笄霉屬的瓜笄霉（Choanephora cucurbitarum）;黃美智等（2019）于2016—2017年對(duì)云南省7個(gè)辣木主要種植地辣木病害進(jìn)行調(diào)查，明確了辣木上的常見(jiàn)病害種類及發(fā)生分布情況;劉一賢等（2019）采用單因子變量試驗(yàn)研究了不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、pH值、光照條件和致死溫度對(duì)辣木果腐病病原菌蘭生炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響，并選取10種常用殺菌劑進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人對(duì)不同病原菌引起的辣木果腐病進(jìn)行了相關(guān)研究。本研究團(tuán)隊(duì)前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從西雙版納采集的辣木果腐病的病害癥狀與現(xiàn)有報(bào)道存在差異，采集病果莢表面白色菌絲體，顯微鏡下觀察其孢子囊、孢子梗和孢囊孢子均與已報(bào)道的病原菌孢子形態(tài)不同，是由何種病原菌侵染引起的病害目前尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用形態(tài)學(xué)特征、致病性測(cè)定、ITS序列分析等對(duì)采集自云南西雙版納的辣木果腐病樣本進(jìn)行病原菌系統(tǒng)鑒定，以確定辣木果腐病的病原菌種類，為該病原菌引起的辣木果腐病的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

具有典型果腐病癥狀特征的感病辣木果莢采自中—古辣木科技合作中心辣木栽培試驗(yàn)示范基地（云南西雙版納），品種為印度改良辣木PKM1。培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉18 g，用無(wú)菌水混合配制至1000 mL。供試試劑：植物基因組DNA提取試劑盒DP305和通用型DNA純化回收試劑盒（Universal DNA Purification Kit）[天根生化科技（北京）有限公司];10×Buffer、2.5 mmol/L dNTP、Taq DNA聚合酶、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株和鏈接試劑盒pMD19-T Vector Cloning Kit[寶生物工程（大連）有限公司];引物ITS1和ITS4（北京六合華大基因科技股份有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 病原菌分離及觀察 病原菌分離采用常規(guī)組織分離法（張蓉，2009）。從辣木果莢的病健交界處取約0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，用75%乙醇溶液消毒1 min后再用無(wú)菌水漂洗3次，然后置于PDA培養(yǎng)基上恒溫26 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑取培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行分離純化，將分離純化獲得的代表性菌株移接到PDA培養(yǎng)基上，記錄菌落的生長(zhǎng)情況，在Olympus U-UCD8 A型顯微鏡下對(duì)病原菌分生孢子進(jìn)行顯微形態(tài)（孢子囊、孢囊孢子的形態(tài)和大小）觀測(cè)。參照《植物病原真菌學(xué)》（陸家云，2001）對(duì)病原菌種類進(jìn)行初步鑒定。

1. 2. 2 致病性鑒定 制備孢子懸浮液，懸浮液濃度調(diào)至2.78×106個(gè)/mL。采用針刺接種法（魏林等，2009），選取6個(gè)健康、無(wú)病斑的辣木果莢，在每個(gè)果莢上選取2～3處（視果莢長(zhǎng)短而定）進(jìn)行接種。用脫脂棉蘸75%酒精少許，在辣木果莢接種部位涂拭消毒，晾干后，用滅菌解剖針蘸取孢子懸浮液輕輕地在接種部位刺10～15針，并用少量脫脂棉蘸取孢子懸浮液后包扎在傷口上。對(duì)照果莢上接種無(wú)菌水。將接種后的果莢在培養(yǎng)箱中[溫度26 ℃，相對(duì)濕度（80±5）%，光周期（黑暗∶光照）=12 h∶12 h]培養(yǎng)3 d后，觀察果莢的病害發(fā)生情況及病斑形態(tài)。待辣木果莢發(fā)病后，對(duì)感病果莢進(jìn)行病原菌再分離，通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證病原菌。

1. 2. 3 病原菌rDNA-ITS序列的PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析 用植物基因組DNA提取試劑盒DP305提取代表性菌株的DNA。用通用引物ITS1和ITS4對(duì)菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的片段分離純化后連接至克隆載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，菌液經(jīng)PCR鑒定后送至昆明碩擎生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果輸入GenBank在線網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），通過(guò)NCBI提供的BLAST工具，搜索同源性較高的序列。利用Clustal W程序?qū)⒛繕?biāo)序列與GenBank中搜索到的相關(guān)真菌的ITS區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)MEGA 6.1中的鄰位加入法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2. 1 辣木果腐病的發(fā)生及田間癥狀

辣木果腐病在云南主要發(fā)生于4—8月果莢快速生長(zhǎng)期和接近成熟期，平均發(fā)病率4%～72%。高溫多雨季節(jié)或連續(xù)2～3 d的高溫多雨天氣有利于辣木果腐病的發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)病果率高達(dá)90%，可造成種子失收。果莢感病初期病部呈淡褐色、棕褐色的點(diǎn)狀、條狀或不規(guī)則狀小斑（圖1-A）;感病中期，病斑擴(kuò)大且多個(gè)病斑連接，甚至延伸整個(gè)果莢，果莢的顏色變深褐色，表面有一層白色菌絲體（圖1-B）;后期病害嚴(yán)重時(shí)整個(gè)果莢布滿白色菌絲體（圖1-C），果莢開(kāi)裂，種子干癟（圖1-D）。

2. 2 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

從發(fā)病的辣木果莢上分離出1株疑似致病真菌，編號(hào)為YJiH-1。菌株YJiH-1于PDA培養(yǎng)基上26 ℃恒溫培養(yǎng)1 d后產(chǎn)生白色至淡黃棕色菌絲（圖2-A），氣生菌絲發(fā)達(dá);2 d后菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，最外圍菌絲上面著生黑色點(diǎn)狀物（孢子囊）。顯微鏡下觀察，菌絲無(wú)隔膜，有分枝;孢囊梗無(wú)隔膜、不分枝、平滑透明，頂端彎曲且著生孢子囊（圖2-D）;大型孢子囊圓形，深棕色，大小50.25～77.72 μm×101.33～122.18 μm，內(nèi)含多個(gè)孢囊孢子（圖2-E），孢囊孢子卵圓形、梭形，棕色或暗褐色，大小7.48～13.37 μm×47.99～69.46 μm，在兩端著生10根或10根以上纖毛（圖2-F）;小型孢子囊（單孢子的小型孢子囊）只含有1個(gè)孢子，橢圓形或卵形，棕色或暗褐色，在40倍顯微鏡下可見(jiàn)表面清晰的條紋，大小8.19～17.16 μm×15.55～22.84 μm（圖2-B和圖2-C）。未觀察到接合孢子。依據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定分離物YJiH-1為毛霉目（Mucorales）笄霉科（Choanephoraceae）笄霉屬（Choanephora）的笄霉（Choa-nephora spp.）。

2. 3 病原菌致病性鑒定結(jié)果

通過(guò)針刺接種法接種的辣木果莢，接菌后第3 d果莢刺傷處出現(xiàn)輕度腐爛，刺傷處周圍出現(xiàn)明顯的水漬狀病斑（圖3-A），隨著時(shí)間的推移，水漬狀病斑不斷擴(kuò)大;接種后第6 d，果莢由綠變淺褐色，表面出現(xiàn)白色菌絲體，果莢內(nèi)輕度腐爛（圖3-B和圖3-C），病斑占據(jù)整個(gè)辣木果莢的40%左右;接種后第10～11 d，整個(gè)果莢變深褐色，嚴(yán)重腐爛，表面布滿白色菌絲體，果莢內(nèi)部種子腐爛、萎縮（圖3-D和圖3-E）?？瞻讓?duì)照無(wú)菌水接種的傷口附近均未出現(xiàn)任何癥狀（圖3-F）。對(duì)接種后發(fā)病的辣木果莢重新進(jìn)行病原菌分離，再次獲得相同形態(tài)特征的病原菌，符合柯赫氏法則（謝聯(lián)輝，2006），證明接種用分離菌株YJiH-1為辣木果腐病病原菌。

2. 4 病原菌rDNA-ITS序列分析結(jié)果

2. 4. 1 病原菌rDNA-ITS序列的克隆與測(cè)序 以菌株YJiH-1的基因組DNA為模板，用真菌rDNA-ITS區(qū)通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條500～750 bp的條帶（圖4）。經(jīng)測(cè)序，該片段全長(zhǎng)576 bp，測(cè)序結(jié)果提交至GenBank，獲得登錄號(hào)為KY618842。

2. 4. 2 病原菌rDNA-ITS序列的BLAST比對(duì)與親緣關(guān)系分析 將菌株YJiH-1的rDNA-ITS序列在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果表明分離所獲病原菌YJiH-1 rDNA-ITS區(qū)序列與印度巴豆瓜笄霉C.8-18菌株（登錄號(hào)KX462163）和印度CBS 178.86菌株（登錄號(hào)JN943007）的rDNA-ITS區(qū)序列完全一致（相似性100%）;與印度番木瓜瓜笄霉CP-5菌株（登錄號(hào)KX790359）的相似性為99%，進(jìn)一步證實(shí)所獲得的辣木果腐病致病菌株YJiH-1為瓜笄霉（C. cucurbitarum）。

利用MEGA 6.1構(gòu)建相關(guān)病原菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)一步分析其親緣演化關(guān)系。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示（圖5），菌株YJiH-1與笄霉屬的C. cucurbitarum-C.8-18（登錄號(hào)KX462163）、C. cucurbitarum-CBS 178.76（登錄號(hào)JN943007）、C. cucurbitarum-CP-5（登錄號(hào)KX790359）、C. cucurbitarum-CHMcry-11（登錄號(hào)AB470640）、C. cucurbitarum-CCB001（登錄號(hào)KJ817815）、C. cucurbitarum-KA47637（登錄號(hào)KJ461159）和C. infundibulifera（登錄號(hào)KT828740）等7個(gè)分離物聚為一個(gè)獨(dú)立的分支;布拉霉屬（Blakeslea）的三孢布拉霉（B. trispora）登錄號(hào)為HQ248186和JN943005的2株菌株聚為一個(gè)獨(dú)立的分支;吉爾霉屬（Gilbertella）的桃吉爾霉（G. persicaria）登錄號(hào)為JQ951601和KT213045的2株菌株聚為一個(gè)獨(dú)立的分支;而毛霉目毛霉科毛霉屬的Mucor exponens（登錄號(hào)JN206207）則以較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系處在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的外圍。

3 討論

本研究切取辣木病果莢病健交界處帶白色菌絲體的組織，通過(guò)病原菌分離純化、致病性測(cè)定、ITS序列分析等方法明確了引起辣木果腐病的病原菌為瓜笄霉，這是國(guó)內(nèi)外繼夏威夷內(nèi)臍蠕孢（Kshirsagar and DSouza，1989）、半裸鐮刀菌（Resmi et al.，2005;蔣桂芝等，2007）和蘭生炭疽菌（蔡志英等，2016）后報(bào)道的第4種引起辣木果腐病的病原。夏威夷內(nèi)臍蠕孢引起辣木果莢變褐，感病部位縮小，果皮變薄;半裸鐮刀菌引起辣木果莢病斑表面出現(xiàn)黑色厚垣孢子堆或橙黃色孢子堆;蘭生炭疽菌導(dǎo)致辣木果莢呈黑色小顆粒狀物病原菌子實(shí)體。本研究結(jié)果與前人報(bào)道的辣木果腐病病原菌存在一定差異，可能與取樣部位、取樣范圍、分離鑒定方法等有關(guān)，如本研究選取的是帶白色菌絲體的辣木病果莢病健交界處組織，且大小為0.5 cm×0.5 cm;分離時(shí)只用75%乙醇溶液消毒，未用升汞溶液消毒;在室內(nèi)進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證;鑒定過(guò)程中未對(duì)β-tubulin基因序列進(jìn)行分析等。Resmi等（2005）采用致病性測(cè)定和形態(tài)學(xué)鑒定，確定引起辣木果腐病的病原菌為鐮刀菌;蔣桂芝等（2007）先用自來(lái)水沖洗果莢表面，晾干后用75%酒精表面消毒，然后削去病斑表面及周圍的皮層，選取大小為2～3 mm×2～3 mm的組織進(jìn)行接種，最終根據(jù)菌絲和分生孢子形態(tài)，將病原菌鑒定為半裸鐮刀菌;蔡志英等（2016）選取受害果莢中有黑色小顆粒狀物的病原菌子實(shí)體進(jìn)行分離培養(yǎng)、顯微觀察，并結(jié)合多基因分析的方法，將分離出的炭疽病菌鑒定為蘭生炭疽菌。

瓜笄霉侵染植物體的速度非?？?，在溫濕度較適宜的情況下，2～3 d即可表現(xiàn)癥狀。瓜笄霉主要侵染植物的葉、花和果實(shí)，引起花和果實(shí)等腐爛，可被侵染的寄主種類豐富，如尼日利亞的莧菜（Adebanjo，1994）、日本的冰葉日中花（Kagiwada et al.，2010）、山東的瓜類（李金堂，2011）、韓國(guó)的秋葵（Park et al.，2015）、印度的花椰菜（Gogoi et al.，2016）和巴西的豬屎豆（Alfenas et al.，2018）等。在印度，瓜笄霉較常見(jiàn)，而辣木原產(chǎn)于印度，因此瓜笄霉極有可能是通過(guò)辣木種子帶菌傳入我國(guó)。目前，國(guó)內(nèi)報(bào)道的瓜笄霉主要在山東壽光引起瓜類的花腐和幼果腐爛，4—5月和8—10月是瓜笄霉褐腐病高峰期，造成瓜類大面積死亡。

辣木果腐病主要發(fā)生在5—8月辣木快速生長(zhǎng)期和接近成熟期，此時(shí)正是西雙版納的雨季，高溫、高濕的自然條件非常有利于該病的流行。目前，僅在云南西雙版納地區(qū)辣木果腐病就有2種病原菌，且不同病原菌引起辣木果腐病的癥狀也不同，表明辣木果腐病可能存在多種病原菌。本研究團(tuán)隊(duì)在西雙版納辣木種植基地只發(fā)現(xiàn)了瓜笄霉1種病原菌，并未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有報(bào)道的其他病原菌，這些病原菌是否存在協(xié)同侵染有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過(guò)病原菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確認(rèn)引起云南西雙版納辣木果莢腐爛且表面有白色菌絲體的辣木果腐病病原菌為瓜笄霉（C. cucurbitarum）。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）