微生物添加劑對(duì)甘蔗尾葉青貯細(xì)菌多樣性的影響

周俊華 黃光云 黃麗霞 羅鮮青 何仁春 周志揚(yáng) 梁琪妹 黃香 廖玉英 王啟芝

摘要：【目的】研究微生物添加劑對(duì)甘蔗尾葉青貯細(xì)菌多樣性的影響，為甘蔗尾葉青貯技術(shù)優(yōu)化提供參考依據(jù)。【方法】試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理：處理1在新鮮甘蔗尾葉中添加1%植物乳桿菌和3%米曲霉，處理2添加1%飼用復(fù)合微生物制劑，以新鮮甘蔗尾葉直接青貯為對(duì)照處理。青貯原料切碎后與添加劑充分混勻，密封，室溫青貯45 d后采樣，放入無(wú)菌樣品袋，-80 ℃保存。采用Miseq高通量測(cè)序分析甘蔗尾葉青貯細(xì)菌門(mén)、屬水平群落結(jié)構(gòu)，并對(duì)3個(gè)處理的甘蔗尾葉青貯進(jìn)行感官評(píng)定。【結(jié)果】對(duì)照、處理1和處理2甘蔗尾葉青貯的感官評(píng)定等級(jí)分別為良好、良好和一般。3個(gè)處理甘蔗尾葉青貯細(xì)菌共有操作分類(lèi)單元（OTU）182個(gè)，對(duì)照、處理1和處理2特有OTUs分別為179、319和3321個(gè)，OTUs總數(shù)分別為845、1115和3815個(gè)。處理2的甘蔗青貯細(xì)菌群落Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著高于對(duì)照和處理1（P<0.05，下同），處理1的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著高于對(duì)照，3個(gè)處理的覆蓋指數(shù)均接近1.00。在門(mén)水平上，對(duì)照和處理1甘蔗尾葉青貯的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)均為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），相對(duì)豐度分別為95.92%、2.46%和84.90%、13.79%;處理2的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），相對(duì)豐度分別為74.67%、23.52%和1.61%。在屬水平上，對(duì)照甘蔗尾葉青貯細(xì)菌中相對(duì)豐度在1.00%以上的屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）、梭菌屬I(mǎi)V群（Clostridium_IV）和嚴(yán)格梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto），三者相對(duì)豐度分別為84.28%、1.18%和5.14%;處理1中，乳桿菌屬、醋酸桿菌屬（Acetobacter）和芽孢桿菌屬（Bacillus）3個(gè)屬的相對(duì)豐度在1.00%以上，分別為78.56%、12.78%和4.14%;處理2甘蔗尾葉青貯細(xì)菌中相對(duì)豐度在1.00%以上的屬有10個(gè)，其中腐敗菌腸桿菌科未分類(lèi)菌屬（Enterobacteriaceae_unclassified）（47.64%）、梭菌科未分類(lèi)菌屬（Clostridiaceae_1_unclassified）（7.62%）、梭菌屬I(mǎi)V群（Clostridium_IV）（4.79%）和腸桿菌屬（Enterobacter）（7.38%）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，乳桿菌屬相對(duì)豐度僅為0.81%?！窘Y(jié)論】甘蔗尾葉添加飼用復(fù)合微生物制劑進(jìn)行青貯，其物種數(shù)最豐富，但腐敗菌未得到抑制;甘蔗尾葉添加植物乳桿菌和米曲霉進(jìn)行青貯可顯著提高甘蔗尾葉青貯細(xì)菌群落的繁殖生長(zhǎng)，進(jìn)而提高甘蔗尾葉青貯的微生物多樣性及群落相對(duì)豐度，可在甘蔗尾葉青貯中應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 甘蔗尾葉;微生物添加劑;青貯;細(xì)菌多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)： S816.53? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）09-2254-07

Effects of microbial additives on bacterial diversity of

sugarcane tops silages

ZHOU Jun-hua1， HUANG Guang-yun1， HUANG Li-xia1， LUO Xian-qing1， HE Ren-chun1， ZHOU Zhi-yang1， LIANG Qi-mei1， HUANG Xiang1， LIAO Yu-ying2*， WANG Qi-zhi1*

（1Animal Husbandry Research Institute of Guangxi， Nanning? 530001， China; 2Guangxi Veterinary Research Institute，Nanning? 530000， China）

Abstract：【Objective】The objective of the present study was to investigate the effects of microbial additives on bacterial diversity of sugarcane tops silages，and provide reference for sugarcane tops silage. 【Method】Three treatments were set： treatment 1 adding 1% Lactobacillus plantarum and 3% Aspergillus oryzae in fresh sugarcane tops， treatment 2 adding 1% the compound microbiological preparation in fresh sugarcane tops， controlwithout any microbal additive in the fresh sugarcane tops. Fresh sugarcane tops were cut， mixed with additives， sealed， and sampled after 45 d of ensiling， and put into sterile sample bag and stored at -80 ℃. Miseq high-throughput sequencing technology was utilized to detect the bacterial composition of sugarcane tops silages at the phylum level and the genus level. Sensory evaluation was used to assess the quality of sugarcane tops silage in three treatments. 【Result】The sensory evaluation grades of control，treatment 1 and treatment 2 were fine，fine and general，respectively. The results showed that， at the operational taxonomic units（OTUs） level，182 OTUs were shared by all samples in the three treatments，there were 179 special OTUs in control group，319 special OTUs in treatment 1 and 3321 special OTUs in treatment 2， and total OTUs in control， treatment 1 and treatment 2 were 845，1115 and 3815， respectively. Shannon index，Chao1 index of treatment 2 were significantly higher than those in the control group and treatment 1（P<0.05， the same below）. Shannon index， Simpson index of treatment 1 were significantly higher than those in the control group. The coverage index of the three treatments all near 1.00. At the phylum level，the dominant bacteria of control group were Firmicutes and Proteobacteria，with relative abundance of 95.92% and 2.46%; the dominant bacteria? of treatment 1 were Firmicutes and Proteobacteria，with relative abundance of 84.90% and 13.79%; the dominant bacteria of treatment 2 were Proteobacteria， Firmicutes and Bacteroidetes，with relative abundance of 74.67%，23.52% and 1.61%. At the genus level， the bacteria whose relative abundance was over 1.00% of control group were Lactobacillus， Clostridium_IV and? Clostridium_sensu_stricto ，with relative abundance of 84.28%， 1.18% and 5.14%; the bacteria whose relative abundance was over 1.00% of treatment 1 were Lactobacillus， Acetobacter and Bacillus， with relative abundance of 78.56%，12.78% and 4.14%. There were ten bacteria whose relative abundance was over 1.00% in treatment 2，but the Enterobacteriaceae_unclassifie（47.64%），Clostridiaceae_1_unclassified（7.62%）， Clostridium_IV（4.79%） and Enterobacter（7.38%） were dominant in the ten bacteria，relative abundance of Lactobacillus was only 0.81%. 【Conclusion】Adding the compound microbiological preparation in fresh sugarcane tops treatment has the most abundant species but the spoilage bacteria are not inhibited. Adding L. plantarum and A. oryzae in fresh sugarcane tops can significantly improve the growth and reproduction of bacterial community， and improve the microbial diversity and community abundance of the sugarcane tops silages， which can be a reference for the actual production of sugarcane tops silage.

Key words： sugarcane tops; microbial additives; silage; bacteria diversity

Foundation item： Guangxi Science and Technology Plan Project（Guike AB16380175）;Nanning Scientific Research and Technology Development Project（20182195）; Guangxi Public Welfare Research Institute Project（GMYZX 2019-11）

0 引言

【研究意義】甘蔗是廣西重要的特色農(nóng)作物之一，年種植面積在100萬(wàn)ha以上。甘蔗尾葉是甘蔗頂部2～3個(gè)嫩節(jié)及附帶的整個(gè)葉片，約占整株甘蔗全重的20%。每年11月—翌年4月是甘蔗收獲期，也是青綠飼料生產(chǎn)的淡季;而大量的甘蔗尾葉被當(dāng)作廢棄物焚燒，不僅造成資源浪費(fèi)，還污染環(huán)境。若能有效利用甘蔗尾葉，既可緩解冬季反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)青綠飼料短缺的問(wèn)題，又能促進(jìn)廢棄物資源化利用及農(nóng)作物秸稈的綜合利用。甘蔗尾葉粗纖維含量高，質(zhì)地粗硬，通過(guò)青貯發(fā)酵可改善其適口性，提高其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，同時(shí)延長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間。青貯是一個(gè)由多種微生物參與的復(fù)雜發(fā)酵過(guò)程，不同微生物對(duì)青貯品質(zhì)有不同影響。因此，全面了解經(jīng)不同微生物添加劑處理的甘蔗尾葉青貯微生物群落結(jié)構(gòu)及有害菌種類(lèi)，對(duì)微生物添加劑的安全使用及青貯調(diào)控均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】青貯過(guò)程是多種微生物參與的復(fù)雜發(fā)酵體系，不同微生物對(duì)青貯飼料品質(zhì)的影響有所不同。穆勝龍等（2018）、唐振華等（2018）研究表明，新鮮甘蔗尾葉添加植物乳桿菌和布氏乳桿菌進(jìn)行青貯，可改善甘蔗尾葉青貯品質(zhì)，并提高甘蔗尾葉青貯的有氧穩(wěn)定性。周俊華等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，添加乳酸芽胞桿菌和黑曲霉進(jìn)行甘蔗尾葉青貯，可改善甘蔗尾葉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。高通量測(cè)序是可最大限度保留菌群原有群落組成及分布特征的一種免培養(yǎng)分子生物學(xué)技術(shù)。Li等（2015）采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到巴茅青貯過(guò)程中30多個(gè)菌屬群落的變化情況。陶蓮和刁其玉（2016）采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)分析了玉米秸稈青貯前后整個(gè)群落結(jié)構(gòu)及微生物豐度的變化信息。胡宗福等（2017）研究表明，全株玉米青貯在發(fā)酵前期、后期和開(kāi)袋期3個(gè)階段，微生物群落組成有明顯變化。劉蓓一等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，大麥青貯第2～60 d的優(yōu)勢(shì)菌群是乳桿菌屬，而有氧暴露后，有害菌沙雷氏菌屬和不動(dòng)桿菌屬等的相對(duì)豐度有所增加?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，尚無(wú)采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)添加微生物制劑的甘蔗尾葉青貯細(xì)菌多樣性進(jìn)行檢測(cè)分析的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)分析直接青貯、植物乳桿菌及米曲霉、飼用復(fù)合微生物制劑對(duì)甘蔗尾葉青貯細(xì)菌門(mén)、屬水平群落結(jié)構(gòu)的影響，為甘蔗尾葉青貯技術(shù)優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

新鮮甘蔗尾葉來(lái)源于廣西崇左市扶綏縣甘蔗種植區(qū)，揉搓切碎至2 cm左右。植物乳桿菌和米曲霉由廣西畜牧研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室保存提供，飼用復(fù)合微生物制劑（枯草芽孢桿菌≥5.6×107 CFU/g，沼澤紅假單胞菌≥2.0×107 CFU/g，乳酸菌≥4.0×106 CFU/g）購(gòu)自南寧微瑞生物科技有限公司。

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)。處理1：新鮮甘蔗尾葉添加1%植物乳桿菌菌液（7.6×106 CFU/mL，采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)菌液濃度）和3%米曲霉（1.3×108 CFU/g，采用血球計(jì)數(shù)法進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)）;處理2：新鮮甘蔗尾葉添加1%飼用復(fù)合微生物制劑;處理3：對(duì)照，不添加微生物制劑。青貯原料與添加劑充分混勻，裝入青貯袋壓實(shí)并用真空壓包機(jī)封口，每袋裝樣品8 kg，室溫青貯45 d后，用無(wú)菌鑷子采樣，放入無(wú)菌樣品袋，-80 ℃保存待測(cè)。

1. 3 甘蔗尾葉青貯細(xì)菌高通量測(cè)序

1. 3. 1 甘蔗尾葉青貯細(xì)菌基因組DNA提取 利用E.Z.N.A? Stool DNA Kit試劑盒（上海哈研生物科技有限公司）提取甘蔗尾葉青貯細(xì)菌基因組DNA，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，采用紫外分光光度計(jì)對(duì)所提取DNA進(jìn)行定量分析。

1. 3. 2 甘蔗尾葉青貯微生物群落結(jié)構(gòu)MiSeq高通量測(cè)序 以16S rDNA為目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列為341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'），805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix（New England Biolabs）12.5 μL，正、反向引物各2.4 μL，50 ng DNA模板，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃ 10 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 s。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并采用AMPure XT beads Kit對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收純化。參照MiSeq Reagent Kit V3（深圳海恩安生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明，使用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序。

1. 3. 3 生物信息分析 采用FLASH（v1.2.8）軟件，依據(jù)雙端序列的Overlap關(guān)系，將序列拼接成Tag，并去除Barcode及引物序列，采用Vsearch（v2.3.4）過(guò)濾嵌合體。經(jīng)預(yù)處理的Cleandate經(jīng)Vsearch分析后獲得的有效序列作為該操作分類(lèi)單元（OTU）的代表序列。使用QIIME（v1.8.0）分析α多樣性。使用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，將OTU代表序列與RDP（核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)）及NCBI-16S數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)每個(gè)代表序列進(jìn)行物種注釋。圖片均采用R包（v3.2.5）實(shí)現(xiàn)。利用Excel 2007對(duì)甘蔗尾葉青貯細(xì)菌門(mén)、屬水平的相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 17.0對(duì)α多樣性指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），研究分析微生物菌劑對(duì)甘蔗尾葉青貯細(xì)菌門(mén)、屬水平相對(duì)豐度的影響。

1. 4 甘蔗尾葉青貯感官評(píng)定

依照《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》（劉建新，1996）對(duì)3個(gè)處理的甘蔗尾葉青貯進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參考表1。

2 結(jié)果與分析

2. 1 甘蔗尾葉青貯的感官評(píng)定結(jié)果

依照《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)3個(gè)處理甘蔗尾葉的pH、水分、色澤、氣味和質(zhì)地等進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)定結(jié)果見(jiàn)表2。甘蔗尾葉經(jīng)45 d青貯后，對(duì)照、處理1和處理2的感官評(píng)定等級(jí)分別為良好、良好和一般，其中處理1的甘蔗尾葉青貯pH為3.92、水分含量77%、色澤亮黃、松散軟柔不黏手、氣味無(wú)不舒適感，總分最高，為69分。

2. 2 甘蔗尾葉青貯細(xì)菌OTUs基礎(chǔ)分析結(jié)果

OTU是人為給定品系、種和屬等某一分類(lèi)單元設(shè)置的同一標(biāo)志。對(duì)來(lái)自于同一環(huán)境的所有樣品序列進(jìn)行合并，并將相似性大于97%的序列歸類(lèi)為一個(gè)OTU。由圖1可知，3個(gè)處理甘蔗尾葉青貯細(xì)菌共有OTUs為182個(gè)，對(duì)照特有OTUs為179個(gè)，處理1特有OTUs為319個(gè)，處理2特有OTUs為3321個(gè)。對(duì)照、處理1和處理2的甘蔗尾葉青貯細(xì)菌OUTs分別為845、1115和3815個(gè)。

2. 3 微生物添加劑對(duì)甘蔗尾葉青貯細(xì)菌群落α多樣性的影響

Shannon指數(shù)主要用于描述OTUs出現(xiàn)的紊亂及不確定性，不確定性越高，多樣性指數(shù)越高。由表3可知，3個(gè)處理甘蔗尾葉青貯細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)差異顯著（P<0.05，下同），變化范圍為2.20～7.72，其中處理2的Shannon指數(shù)最高，顯著高于處理1和對(duì)照。Simpson指數(shù)越高，表示樣品物種多樣性越豐富。由表3可知，3個(gè)處理甘蔗尾葉青貯細(xì)菌群落的Simpson指數(shù)變化范圍在0.44～0.98，處理2和處理1顯著高于對(duì)照，但處理2與處理1間無(wú)顯著差異（P>0.05，下同）。Chao1指數(shù)在生態(tài)學(xué)中主要用來(lái)估測(cè)物種豐富度，數(shù)值越高代表物種越多。由表3可知，處理2甘蔗尾葉青貯細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)顯著高于對(duì)照和處理1，對(duì)照與處理1間差異不顯著，但處理1較對(duì)照有所增加。覆蓋指數(shù)用于表示本次測(cè)序相對(duì)于整體樣本的覆蓋程度，數(shù)值越高，覆蓋程度越高。由表3可知，3個(gè)處理甘蔗尾葉青貯細(xì)菌群落的覆蓋指數(shù)均接近1.00，表明樣品中微生物群落基本被檢測(cè)出。

2. 4 微生物添加劑對(duì)甘蔗尾葉青貯細(xì)菌門(mén)水平群落組成及其相對(duì)豐度的影響

由圖2可知，對(duì)照甘蔗尾葉青貯的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），其相對(duì)豐度分別為95.92%和2.46%，兩者總相對(duì)豐度達(dá)98.38%。處理1甘蔗尾葉青貯的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)也是厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)，相對(duì)豐度分別為84.90%和13.79%，兩者總相對(duì)豐度達(dá)98.69%。處理2甘蔗尾葉青貯的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），相對(duì)豐度分別為74.67%、23.52%和1.61%，3個(gè)菌門(mén)的總相對(duì)豐度達(dá)99.80%。

2. 5 微生物添加劑對(duì)甘蔗尾葉青貯細(xì)菌屬水平群落組成及其相對(duì)豐度的影響

由圖3可知，在處理1甘蔗尾葉青貯細(xì)菌群落中，乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋桿菌屬（Acetobacter）和芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對(duì)豐度均在1.00%以上，分別為78.56%、12.78%和4.14%，三者總相對(duì)豐度為95.48%。在處理2甘蔗尾葉青貯細(xì)菌群落中，相對(duì)豐度在1.00%以上的菌屬有10個(gè)，總相對(duì)豐度為90.90%，其中腸桿菌科未分類(lèi)菌屬（Enterobacteriaceae_unclassified）占優(yōu)勢(shì)地位，相對(duì)豐度達(dá)47.64%，隨后依次為蘭奧爾菌屬（Raoultella）（8.38%）、梭菌科未分類(lèi)菌屬（Clostridiaceae_1_unclassified）（7.62%）、腸桿菌屬（Enterobacter）（7.38%）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）（5.75%）、梭菌屬I(mǎi)V群（Clostridium_IV）（4.79%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）（3.53%）、瘤胃菌科未分類(lèi)屬（Ruminococcaceae_unclassified）（2.83%）、梭菌屬（Clostridium）（1.88%）和沙雷氏菌屬（Serratia）（1.10%），其他各菌屬的相對(duì)豐度不高，但也占有一定比例。在對(duì)照甘蔗尾葉青貯細(xì)菌群落中，相對(duì)豐度在1.00%以上的屬有乳桿菌屬、梭菌屬I(mǎi)V群和嚴(yán)格梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto），三者總相對(duì)豐度達(dá)90.60%，其中乳桿菌屬（84.28%）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。

3 討論

青貯是青貯原料附著微生物、發(fā)酵微生物和腐敗變質(zhì)微生物參與的復(fù)雜過(guò)程（Muck，2013），因此，對(duì)青貯飼料微生物的群落組成進(jìn)行研究具有重要意義。Eikmeyer等（2013）研究報(bào)道，在飼草青貯過(guò)程中，青貯第14 d和第58 d厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度分別為86.00%和87.00%。McGarvey等（2013）研究報(bào)道，苜蓿青貯主要的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)。劉蓓一等（2019）研究報(bào)道，在大麥青貯期，厚壁菌門(mén)是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。產(chǎn)芽孢菌群、支原體菌群及非產(chǎn)芽孢菌群均屬于厚壁菌門(mén)，且大部分厚壁菌門(mén)可降解淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)等大分子化合物（Romero et al.，2017）。大腸桿菌、弧菌、螺桿菌及歐文氏菌屬、甲基桿菌屬和假單胞菌屬等均屬于變形菌門(mén)，是細(xì)菌中最大的菌門(mén)（Peng et al.，2018）。變形菌門(mén)內(nèi)的物種在農(nóng)業(yè)、環(huán)保及工業(yè)等領(lǐng)域具有重要價(jià)值，已廣泛用于污染物降解及廢水處理等。本研究通過(guò)MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)甘蔗尾葉青貯細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是3個(gè)處理甘蔗尾葉青貯的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，與Eikmeyer等（2013）、McGarvey等（2013）、劉蓓一等（2019）的研究結(jié)果基本一致?？梢?jiàn)，變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)在青貯中發(fā)揮重要作用。在后續(xù)甘蔗尾葉青貯研究中，分離培養(yǎng)變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)細(xì)菌并用于甘蔗尾葉青貯，對(duì)于改善甘蔗尾葉青貯品質(zhì)將具有指導(dǎo)意義。

濕度、溫度、青貯原料及區(qū)域氣候環(huán)境等均會(huì)影響青貯飼料中優(yōu)勢(shì)群落的種類(lèi)（熊乙等，2017）。Dunière等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，類(lèi)芽孢桿菌、黃桿菌、鞘氨醇單胞菌及微小桿菌等是玉米青貯的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。陶蓮和刁其玉（2016）研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈青貯45 d后，片球菌屬（22.65%）、魏斯氏菌屬（9.98%）及乳桿菌屬（9.74%）為優(yōu)勢(shì)菌群。豆艷麗等（2019）研究報(bào)道，全株玉米青貯過(guò)程中乳酸桿菌屬和魏斯氏屬是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。本研究中，在屬水平上，對(duì)照的優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬、梭菌屬I(mǎi)V群和嚴(yán)格梭菌屬;處理1的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳桿菌屬、醋酸桿菌屬和芽孢桿菌屬;處理2的乳酸菌屬相對(duì)豐度低于1.00%，非乳酸菌屬主要有腸桿菌科未分類(lèi)菌屬、梭菌科未分類(lèi)菌屬、蘭奧爾菌屬、 腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、梭菌屬I(mǎi)V群、瘤胃球菌屬和瘤胃菌科未分類(lèi)屬。對(duì)照和處理1的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳桿菌屬，而處理2的優(yōu)勢(shì)菌屬為非乳酸菌屬。乳酸菌是制作優(yōu)良青貯飼料的主要微生物，具有抑制腐敗菌及其他有害菌繁殖的作用，進(jìn)而防腐保鮮青貯飼料。腸桿菌可對(duì)青貯飼料中的蛋白質(zhì)進(jìn)行腐敗性分解，破壞青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分，而降低青貯飼料適口性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。梭狀芽孢桿菌在厭氧條件下可將青貯飼料中的乳酸或葡萄糖進(jìn)行丁酸發(fā)酵，而丁酸發(fā)酵的程度是判斷青貯飼料質(zhì)量好壞的重要標(biāo)準(zhǔn)，丁酸水平越高，青貯飼料品質(zhì)越差。

α多樣性是指特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，主要用來(lái)反映物種豐富度和均勻度及測(cè)序深度（Caporaso et al.，2012）。本研究結(jié)果顯示，處理2甘蔗尾葉青貯細(xì)菌OTU數(shù)目遠(yuǎn)高于對(duì)照和處理1，其Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著高于對(duì)照和處理1，覆蓋指數(shù)與對(duì)照相同，略高于處理1。結(jié)合各處理優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)、屬的分析結(jié)果可知，處理2細(xì)菌種群物種多，多樣性水平高，其優(yōu)勢(shì)菌屬是非乳酸菌屬，但乳酸菌屬是優(yōu)良青貯飼料的關(guān)鍵微生物;同時(shí)腐敗菌腸桿菌科未分類(lèi)菌屬、梭菌科未分類(lèi)菌屬、梭菌屬I(mǎi)V群和腸桿菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，由于腐敗菌未得到抑制而導(dǎo)致OTU數(shù)目遠(yuǎn)超對(duì)照和處理1。這與王聰（2018）、盧強(qiáng)等（2020）的研究結(jié)果相似，均由于腐敗菌未得到有效抑制，導(dǎo)致OTU數(shù)目具有類(lèi)似趨勢(shì)。此外，處理2感官評(píng)定中的質(zhì)地、色澤和氣味得分遠(yuǎn)低于對(duì)照和處理1，可能也是腐敗菌未得到抑制所致。青貯是一個(gè)復(fù)雜的微生物發(fā)酵過(guò)程，本研究中不同微生物添加劑在青貯過(guò)程中與各類(lèi)微生物的相互競(jìng)爭(zhēng)繁殖情況有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

甘蔗尾葉添加飼用復(fù)合微生物制劑進(jìn)行青貯，其物種數(shù)最豐富，但腐敗菌未得到抑制;甘蔗尾葉添加植物乳桿菌和米曲霉進(jìn)行青貯可顯著提高甘蔗尾葉青貯細(xì)菌群落的繁殖生長(zhǎng)，進(jìn)而提高甘蔗尾葉青貯的微生物多樣性及群落相對(duì)豐度，可在甘蔗尾葉青貯中應(yīng)用。

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